應(yīng)濤，方晶晶，陶靜，黃麗

血管內(nèi)皮生長因子單核苷酸多態(tài)性與動脈硬化性腦梗死的相關(guān)性研究

應(yīng)濤，方晶晶，陶靜，黃麗

目的研究血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）單核苷酸多態(tài)性（SNP）與動脈硬化性腦梗死（ACI）的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)，分析 100例 ACI患者與 100例健康對照組VEGF-460T/C、+405G/C與+936C/T基因的多態(tài)性。結(jié)果ACI組的三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽同醇（LDLC）、血壓均高于對照組（均P＜0.05）；兩組VEGF+936C/T的基因型和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），-460T/C與+405G/C基因型和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；攜帶有936T的人群患ACI的機會與非攜帶者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而ACI發(fā)病機會在攜帶有-460C和405C基因患者與非攜帶者差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論VEGF+936C/T核苷酸多態(tài)性與ACI相關(guān)，其基因型是ACI易感基因型，VEGF-460T/C、+405G/C與ACI無關(guān)。

血管內(nèi)皮生長因子；腦梗塞，動脈硬化性；單核苷酸多態(tài)性

動脈硬化性腦梗死（ACI），是腦部動脈粥樣硬化和血栓形成，使腦血管管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致急性腦供血不足，引起局部腦組織缺血性壞死。患者可出現(xiàn)偏癱、失語等腦局灶性損害癥狀，是影響中老年人生活質(zhì)量和生存率下降的重要原因［1］。然而，目前ACI發(fā)病的分子生物學(xué)機制仍不明確，遺傳的易感性被認(rèn)為是 ACI發(fā)病的一個重要環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是目前已知的作用最強的促血管生成因子，可增加血管通透性，保護血管。已發(fā)現(xiàn)ACI患者血漿中VEGF水平較正常人群高，VEGF基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點的不同基因型可顯著影響VEGF的表達［2-3］。因此，本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PC-RFLP）技術(shù)，對ACI患者 VEGF基因+936C/T、-460T/C 與+405G/C的多態(tài)性進行分析，探討ACI發(fā)病機制。報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2015年1月至2016年1月寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的ACI患者100例，符合1995年第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的ACI的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男55例，女45例；年齡50～80歲，平均（65±10）歲。另選同期健康體檢者100例為對照組，其中男60例，女40例；年齡5～80歲，平均（63±9）歲。兩組一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2方法所有受檢者均禁食12～14h，晨起空腹抽取靜脈血5 ml，常規(guī)分離血清，其中20l用作DNA提取，其余行三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定，并且測量血壓。

1.2.1試劑和儀器基因組抽提試劑盒和引物均購自上海生工生物工程服務(wù)有限公司，Roche 480實時熒光PCR儀和上海天能科技有限公司電泳槽、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2.2基因分型取血清 200l，按UNIQ-10柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒說明書提取基因組DNA。用PC-RFLP方法分析 VEGF-460T/C、+405G/C與+936C/T的多態(tài)性。引物序列見表1。擴增條件為94℃5 min 1個循環(huán)，94℃，30 s→58℃（VEGF-460T/C）62℃，30 s→72℃，30 s 30個循環(huán)，72℃5 min 1個循環(huán)，其中VEGF-460T/C退火溫度為62℃。1.3統(tǒng)計方法用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組比較用 檢驗；基因型的Hardy-Weinberg平衡采用X2檢驗；研究不同基因型與ACI間的關(guān)系用多元Logistic回歸分析；調(diào)整的危險因素關(guān)聯(lián)程度用相對危險度（CR）及其95%可信區(qū)間（CI）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1VEGF-460T/C、+405G/C與+936C/T引物序列

2　結(jié)果

2.1ACI組與對照組臨床資料分析

ACI組的TG、LDL-C、血壓均高于對照組（均P＜0.05），見表2。2.2Hardy-Weinberg平衡驗ACI組的VEGF+936C/T、-460T/C與+405G/C 3個位點基因分型理論頻數(shù)合和觀察頻數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。見表3。

表2　腦梗死組與對照組一般臨床資料比較

表3ACI組基因型分布Hardy-Weinberg檢驗

2.3VEGF+936C/T、-460T/C與+405G/ C位點的等位基因頻率和基因型分析兩組VEGF+936C/T的基因型和等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（X2=9.70、6.88，均P＜0.05），見表4。VEGF-460C等、VEGF+405C等位點基因型和等位基因頻率分布情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（X2≤2.56，均P＞0.05）。見表5、6。

2.4VEGF SNP與ACI的關(guān)系帶有936T的人群患ACI的機會與非攜帶者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而ACI發(fā)病機會在攜帶有-460C和405C基因患者與非攜帶者差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表7。

表4　兩組中VEGF+936C/T位點等位基因頻率和基因型分析

表5　兩組中VEGF-460T/C位點等位基因頻率和基因型分析

表6　兩組中VEGF+405G/C位點等位基因頻率和基因型分析

3　討論

VEGF是胱氨酸生長因子超家族的一員，具有促進血管內(nèi)皮細胞分裂、誘導(dǎo)血管生成的作用［4］，其 SNP位點以VEGF+936C/T、-460T/C與+405G/C最重要［5］，這些 SNP位點可能通過影響VEGF的轉(zhuǎn)錄或表達而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后［6-7］。

ACI發(fā)病是一個較復(fù)雜病理生理過程，環(huán)境因素和遺傳因素被認(rèn)為是ACI發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。本研究中，ACI組的TG、LDL-C、血壓均高于對照組（均P＜0.05），表明環(huán)境因素中高脂血癥和高血壓等都是 ACI發(fā)生的重要危險因素。Hardy-Weinberg平衡法則是群體遺傳學(xué)中的一個基本定律，它是進行人群基因多態(tài)性研究的前提和基礎(chǔ)，本實驗結(jié)果顯示，ACI組的VEGF+936C/T、-460T/C 與+405G/C 3個位點基因分型結(jié)果符合Hardy-Weinberg平衡，表明結(jié)果具有群體代表性；VEGF+936C/T在ACI組中的分布頻率高于對照組（P＜0.05），攜帶VEGF936T者患ACI的危險性是不攜帶者的2.181倍（?2.18，95%?1.22 ～3.93），可見VEGF+936C/T是ACI的易感基因型，VEGF+936C/T SNP與ACI有關(guān)系。有學(xué)者也報道中國漢族人群中VEGF+936C/T基因型可能與腦梗死發(fā)病有關(guān)［8-9］。Hugo等［10］研究表明VEGF+ 936C/T SNP可通過影響VEGF的表達，從而影響血管的修復(fù)能力，使攜帶者對ACI易感，具體機制有待于進一步研究。兩組VEGF-460T/C和VEGF+405G/C的基因型和等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），提示VEGF-460T/C和 VEGF+405G/C SNP 與ACI可能沒有關(guān)聯(lián)，與李天煉等［9］研究結(jié)果相符。

表7 兩組中VEGF936C/T、-460T/C、405G/ C基因多態(tài)性位點與ACI的關(guān)系

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.017

R743.33

A

1671-0800（2016）07-0876-03

寧波大學(xué) 2015校級課題（XYY15003）

315020寧波，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

應(yīng)濤，Email：nbyingtao@foxmail.com

2016-03-15