張嶧橋， 張雁芳+， 龍超良， 李春悅， 龍學輝， 崔文玉， 張　浩△， 汪　?！?/p>

(1. 軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所， 北京 100850； 2. 北京賽德維康藥物研究院， 北京 100039)

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基于XcmI識別序列的T載體的構建及連接PCR片段的優(yōu)化*

張嶧橋1， 張雁芳1+， 龍超良1， 李春悅1， 龍學輝1， 崔文玉2， 張浩1△， 汪海1△

(1. 軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所， 北京 100850； 2. 北京賽德維康藥物研究院， 北京 100039)

目的：構建基于XcmI識別序列的T載體并對與其連接的PCR片段進行優(yōu)化。方法：首先將5’和3’端含有Xcm I識別序列的人組蛋白H4 cDNA定向克隆至pCDNA3.0表達載體中，再用Xcm I酶切得到基于pCDNA3.0載體骨架的T載體，為提高T載體與DNA片段的連接效率，在DNA片段PCR擴增前將其引物進行磷酸化并在PCR結束后再用Taq DNA聚合酶和dATP處理，分別將長度為312 bp和1 329 bp的PCR片段T載體連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，通過菌液PCR和瓊脂糖凝膠電泳估算轉(zhuǎn)化子的陽性率。結果：經(jīng)Xcm I酶切后的T載體能高效地與目的DNA片段連接；除T載體本身質(zhì)量外，擴增DNA片段所用引物的磷酸化與否也是影響克隆效率的重要因素之一；對較大的插入片段而言，經(jīng)PCR擴增、純化后再用Taq DNA聚合酶和dATP處理也能夠顯著增加連接效率。結論：克服了對藍白篩選或插入自殺基因等實驗條件的限制，可為T載體的常規(guī)制備并與目的片段進行高效地連接提供了新的線索。

XcmI；T載體；磷酸化；dATP

分子克隆是基因功能研究和特定DNA片段的測序等實驗中的必要環(huán)節(jié)，常規(guī)的分子克隆是通過具有特定識別序列的限制性內(nèi)切酶分別對目的DNA片段和載體進行酶切之后再行連接、轉(zhuǎn)化和陽性克隆的篩選。相對而言，T載體克隆是利用T載體3’端的dT和目的片段3’端的dA互補而進行的具有粘端特性的高效連接。由于該過程不依賴于限制性內(nèi)切酶的切割作用，因而有很強的通用性，同時避免了酶切、回收等繁瑣過程，因而更簡單、經(jīng)濟。

現(xiàn)在制備T載體主要有以下兩種方法：1是將目的載體用EcoR V酶切然后通過Taq DNA聚合酶或者末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶在其3’平端加入dT[1-3]；2是在目的載體中先插入含有Xcm I或者Ahd I酶切位點的片段后再進行相應的酶切反應后得到3’含dT的片段[4-6]。第一種方法由于載體在酶切過程中發(fā)生不完全酶切的現(xiàn)象，極少量的未經(jīng)酶切的載體會夾雜在T載體中而產(chǎn)生假陽性，同時一些載體沒有類似EcoR V等能產(chǎn)生DNA平端的限制性內(nèi)切酶而無法應用。此外，用Taq DNA聚合酶或者末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶在載體3’平端加入dT的效率也是個問題；第二種方法相對而言更簡便，現(xiàn)在基于XcmI酶切構建T載體的研究比較多，其基本原理是插入含有兩個Xcm I識別序列的DNA片段，在這兩個識別序列中可以不包含或包含長度不一的DNA序列。同時其T載體骨架中往往含有藍白篩選標記基因，通過藍白篩選以及PCR篩選獲得陽性克隆。本研究將5’和3’端含有Xcm I識別序列的人組蛋白H4 cDNA定向克隆至pcDNA3.0表達載體中，用Xcm I酶切后得到基于pcDNA3.0載體骨架的T載體，為檢測T載體的質(zhì)量，分別將長度為312 bp和1 329 bp的cDNA片段與載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過菌液PCR和瓊脂糖凝膠電泳計算轉(zhuǎn)化克隆的陽性率，同時對連接反應的條件進行了優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自Takara公司，pcDNA3.0真核表達載體, pcDNA3.0-H4表達質(zhì)粒(含有編碼人組蛋白H4 312 bp cDNA片段), pcDNA3-CRBN表達質(zhì)粒(含有編碼人CRBN 1 329 bp的cDNA片段)為本室保存。

1.1.2主要試劑Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Xcm I購自NEB公司；限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I、T4 多核苷酸激酶、T4 DNA連接酶、dATP、Premix Taq DNA聚合酶、DNA 2000 marker均為Takara公司產(chǎn)品，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自北京天根生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設計及合成(1) 用于構建T載體的引物：正向引物：5’-CGCGGATCCCCA AAG CTC GAG TGG ATGTCTGGGCGAGGTAAAG-3’；反向引物：5’- CCGGAATTCCCA GAT ATC GAT TGG TCAACCGCCGAAACCATAAA-3’，其中斜體部分的堿基分別為限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I識別位點，劃線部分的堿基為Xcm I限制性內(nèi)切酶識別位點。(2) 用于擴增人H4 cDNA(312 bp)的正向引物：5’-CGGAATTCGCCACCATGTCTGGGCGAGGTAAAG-3’；反向引物序列為：5’-CGGGATCCACCGCCGAAACCATAAA-3’。(3) 用于擴增人CRBN cDNA(1329 bp)的正向引物：5’- CCCAAGCTTATGGCCGGCGAAGGAGATC-3’；反向引物：5’-CGGGATCC TTACAAGCAAAGTAT-TACTTTGTC-3’。(4) 用于菌液PCR鑒定陽性克隆的一對引物分別為：T7引物：5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’; SP6引物: 5’-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3’。以上引物均由上海生物工程有限公司合成，PAGE純化。

1.2.2PCR引物的磷酸化及PCR擴增反應的條件在50 μl反應體系中分別加入2 μl dNTP (10 mmol/L), 5 μl primer (10 μmmol/L), 1 μl T4 多核苷酸激酶, 2 μl 10×T4多核苷酸激酶反應緩沖液, 10 μl滅菌的超純水，37℃ 反應1 h。50 μl PCR 反應體系包含以下組分：1 μl 正向引物(10 μmmol/L)，1 μl 反向引物(10 μmmol/L)，1 μl dNTP(10mmmol/L)，1 μl 質(zhì)粒模板(pcDNA3.0-H4，0.01 μg/μl)，5 μl Taq DNA buffer，0.5 μl Taq DNA聚合酶，40.5 μl 滅菌的超純水。PCR擴增人組蛋白H4 cDNA反應條件為：95℃ 預變性2 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán)；72℃ 延伸5 min。PCR擴增人CRBN cDNA的模板為(pcDNA3.0-CRBN，0.01 μg/μl)，反應條件除了在30個循環(huán)中72℃ 90 s之外其余條件均相同，將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠中電泳后切膠回收，加入50 μl回收。

1.2.3菌液PCR鑒定轉(zhuǎn)化子的陽性率從轉(zhuǎn)化平板中分別挑取10個克隆于500 μl LB中培養(yǎng)6 h左右待培養(yǎng)液變混濁，取1 μl至24 μl含相應引物的Premix PCR反應體系中，PCR反應條件與1.2.2相同，PCR反應結束后，取6 μl于1%瓊脂糖凝膠中電泳，根據(jù)陽性條帶出現(xiàn)的機率估算轉(zhuǎn)化子的陽性率。

1.2.4基于Xcm I識別序列和pCDNA3骨架的T載體的構建取1 μg pCDNA3載體用BamH I+EcoR I雙酶切，37℃反應5 h后進行0.7%瓊脂糖凝膠中電泳后切膠回收，加入50 μl回收；將含Xcm I識別序列的正反向引物用pcDNA3.0-H4為模板擴增后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收300 bp左右的特異片段，將pCDNA3載體酶切片段和PCR片段按摩爾比1∶3的比例進行連接、轉(zhuǎn)化，菌液PCR鑒定陽性克隆，隨機挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒分別用BamH I+EcoR I雙酶切和Xcm I單酶切分析切出的片段大小，鑒定正確的質(zhì)粒進一步用T7引物進行序列分析確證，該質(zhì)粒命名為pCDNA3-XcmI-H4-XcmI，將該質(zhì)粒用Xcm I酶切后回收5.4 kb大小的片段即為T載體。

1.2.5T載體和PCR片段連接的條件優(yōu)化將T載體用Xcm I酶切后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收大小為5.4 kb的片段，與用下列不同方案獲得片段按摩爾比1∶3的比例進行連接、轉(zhuǎn)化，菌液PCR鑒定陽性克隆、擴增。PCR擴增人組蛋白H4 cDNA分別用一對磷酸化和非磷酸化引物；PCR擴增人CRBN cDNA分別用一對磷酸化和非磷酸化引物，同時設一組在用磷酸化擴增、純化后再用Taq酶處理，反應體系為：35 μl純化的PCR產(chǎn)物，5 μl ThermoPol 緩沖液, 0.5 μl Taq DNA聚合酶，2 μl dATP (10 mmol/L)和7.5 μl滅菌的純水，72℃反應。

2　結果

2.1pCDNA3-XcmI-H4-XcmI質(zhì)粒及T載體的構建

將5’和3’端分別含有BamH I、Xcm I以及Xcm I、EcoR I識別位點的人組蛋白H4 cDNA片段用BamH I+EcoR I雙酶切后與用同樣雙酶切處理的pCDNA3片段連接轉(zhuǎn)化后，菌液PCR初步鑒定陽性克隆，提取質(zhì)粒，在分別用BamH I+EcoR I雙酶切和Xcm I單酶切鑒定(圖1)，空載體pCDNA3用BamH I+EcoR I雙酶切后僅有5.4 kb片段大小的單一條帶(圖1，第2泳道)，表明pCDNA3載體含有BamH I或EcoR I識別位點且這兩個位點之間沒有大的片段，而pCDNA3-XcmI-H4-XcmI質(zhì)粒用這兩個酶消化后得到了5.4 kb大小的片段以及300 bp左右大小的片段(圖1，第3泳道)，表明人組蛋白H4 cDNA片段已經(jīng)插入至pCDNA3載體的BamH I和EcoR I位點之間； pCDNA3載體用Xcm I處理并電泳后其DNA帶型與未經(jīng)酶切的pCDNA3載體一致(圖1，第4泳道)，說明在pCDNA3載體中沒有Xcm I識別位點，而pCDNA3-XcmI-H4-XcmI質(zhì)粒用Xcm I處理后得到5.4 kb大小的片段以及300 bp左右大小的片段(圖1，第5泳道)，表明該質(zhì)粒引入了兩個Xcm I位點，且在這兩個位點之間含有300 bp的片段，結果與預期一致。將該質(zhì)粒用T7引物測序后，序列完全正確。將pcDNA3-XcmI-H4-XcmI質(zhì)粒用Xcm I酶切后回收5.4 kb即為T載體，其DNA雙鏈兩端的5’端均含有突出的“T”。

2.2T載體與人組蛋白H4 cDNA PCR片段的連接及其條件的優(yōu)化

在實驗初期，用未磷酸化的引物擴增H4 cDNA片段并與T載體按摩爾比3∶1比例連接，轉(zhuǎn)化后挑取10個轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，取1 μl菌液用T7+SP6引物進行PCR和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果見圖2A，在10個PCR產(chǎn)物中有6個出現(xiàn)陽性條帶，表明此時陽性率僅為60%，為進一步提高連接效率，同時考慮到PCR產(chǎn)物的5’端如果具有磷酸基團則可以與T載體3’端T的羥基連接從而增強連接效率。因此在PCR擴增前先將引物進行磷酸化，在擴增并與T載體連接，菌液PCR后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖2B，在10個PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)陽性條帶，表明此時陽性率達到100%。將陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用T7引物進行測序，結果表明插入的片段為人組蛋白H4 cDNA，且在靠近T7引物序列的接頭處含有“T”(圖3A)，在靠近SP6引物序列的接頭處含有“A”(圖3B)。

Fig. 1Restriction endonuclease analylsis of recombinant pcDNA3-XcmI-H4-XcmI plasmids

1: pcDNA3-XcmI-H4-XcmI plasmids without any restriction endonuclease digestion; 2: pcDNA3.0 plasmid digested with BamH I+EcoR I; 3: pcDNA3-XcmI-H4-XcmI plasmid digested with BamH I + EcoR I; 4: pcDNA3.0 plasmid digested with Xcm I; 5: pcDNA3-XcmI-H4-XcmI plasmid digested with Xcm I; 6: purified T vector plasmid; M: 2 000 bp DNA marker

Fig. 2Determination of the positive rates of the transformants in both of the non-phosphorylated group

A: Phosphorylated group; B: By routine PCR with T7+SP6 primer pair set; Lane 1-10: Amplification of H4 cDNA with the templates of cultured bacteria transformed with the ligation solution containing T-vector and the amplified coding sequence of human histone H4 cDNA; M: 2000 bp DNA marker

2.3T載體與人CRBN cDNA PCR片段的連接及其條件的優(yōu)化

考慮到H4 cDNA PCR片段較小，僅為300 bp左右，較容易連接至載體，我們進一步擴增較大長度的DNA片段并將之與T載體連接。實驗中以本實驗室的pCDNA3-CRBN為模板擴增人CRBN cDNA片段(長度為1.3 kb左右)，首先比較了引物未發(fā)生磷酸化及磷酸化對連接效率的影響，未磷酸化組的轉(zhuǎn)化子中，10個PCR產(chǎn)物中僅有2個為陽性(圖4A)，其陽性率為20%，而磷酸化組的10個隨機挑選的轉(zhuǎn)化子中有5個出現(xiàn)陽性的1.4 kb大小的條帶，其陽性率為50%(圖4B)，雖然和未磷酸化組相比有顯著提高，但是陽性率仍然不高。為此，將磷酸化組的PCR片段回收后用Taq酶和dATP進一步處理，將處理并純化后的產(chǎn)物再與T載體按摩爾比3∶1比例連接，轉(zhuǎn)化后用菌液PCR進行鑒定，結果見圖4C，可以看出隨機挑選的10個轉(zhuǎn)化子中有9個出現(xiàn)長度約為1.4 kb大小的片段，其陽性率達到90%，可基本滿足普通實驗的需要。將陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用T7和SP6引物進行測序，結果表明插入的片段為CRBN cDNA，且在靠近T7引物序列的接頭處含有T(圖5A)，在靠近SP6序列的接頭處含有“A”(圖5B)，(用SP6反向引物測序時，序列與原序列互補，故用方框標記的是“T”)。

Fig. 3DNA sequencing results of the plasmid extracted from transformants of the ligation mixture containing T-vector and the amplified coding sequence of human histone H4 cDNA by T7 primer showing the appearance of “T”

(A) near the 5’ end of the junction and “A” in the 3’ end of the junction (B)

3　討論

T載體克隆由于不受限制性內(nèi)切酶識別序列的限制且操作簡單、經(jīng)濟而廣泛應用于各種用途的分子克隆實驗中。比如經(jīng)特定實驗篩選出的差異DNA片段的測序(甲基化片段、特定抗體的染色質(zhì)免疫共沉淀片段等)、融合蛋白在原核或真核細胞中的表達、基因敲低、啟動子大片段的克隆、抗體庫的構建等[7-10]，在如何制備T載體的問題上已有廣泛和深入的報道[11，12]。但在如何優(yōu)化T載體與插入片段的連接條件問題上的研究相對較少。但是這個問題很重要，因為最終連接的效率不僅僅取決于制備的T載體本身的質(zhì)量，還與待連接片段的質(zhì)量相關。

Fig. 4Determination of the positive rates of the transformants in non-phosphorylated group

A: Phosphorylated group; B: Phosphorylated plus retreatment with Taq group; C: By routine PCR with T7+SP6 primer pair set; Lane 1-10: Amplification of CRBN cDNA with the templates of cultured bacteria transformed with the ligation solution containing T-vector and the amplified coding sequence of human CRBN cDNA; M: 2 000 bp DNA marker

Fig. 5DNA sequencing results of the plasmid extracted from transformants of the ligation mixture containing T-vector and the amplified coding sequence of human CRBN cDNA by T7 and SP6 primer showing the appearance of “T” (A) near the 5’ end of the junction and “A” in the 3’ end of the junction (B)

有關T載體的制備已有很多報道。在本實驗中我們首先在pCDNA3載體中插入了兩端含Xcm I識別序列的人組蛋白H4 cDNA 片段，得到pCDNA3-XcmI-H4-XcmI質(zhì)粒，該質(zhì)粒用Xcm I酶切之后即可得到載體雙鏈DNA兩端的3’端均含T的片段和H4 cDNA 片段，進一步回收大片段即為T載體。該方案的優(yōu)點在于用Xcm I處理pCDNA3-XcmI-H4-XcmI質(zhì)粒制備T載體時，經(jīng)酶切后的T載體片段與少量的未發(fā)生酶切的pCDNA3-XcmI-H4-XcmI質(zhì)粒相差300 bp，經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳后可以分開從而避免了原始質(zhì)粒的污染；此外通過引物設計，只要該質(zhì)粒的兩個Xcm I位點被切割，切割后的DNA片段的兩端就能夠產(chǎn)生突出的T，如果只有一個位點發(fā)生切割，由于其片段較大而再瓊脂糖凝膠電泳時會與T載體分離，這些都保證了T載體的質(zhì)量。

本研究通過幾個對照實驗逐步發(fā)現(xiàn)了影響T載體與DNA插入片段連接效率的重要因素。在插入人組蛋白H4 cDNA時，用普通未磷酸化的引物進行擴增時，發(fā)現(xiàn)T載體與其連接效率僅為50%，后來又對連接比例、感受態(tài)的類別進行了變換，發(fā)現(xiàn)均不能提高連接效率(結果未顯示)，考慮到T載體的3’端為羥基，而用未磷酸化引物擴增的DNA片段的5’端也為羥基，T4DNA連接酶不能將二者連接，因此，在PCR擴增前首先將正反向引物的5’端分別磷酸化，此時PCR擴增后的片段在與T載體連接后轉(zhuǎn)化子的陽性率達到100%。在將長度為1 300 bp的PCR片段與T載體連接時，同樣發(fā)現(xiàn)引物經(jīng)磷酸化后其PCR擴增片段與T載體的連接效率由20%提高到50%，說明引物的磷酸化確實是影響連接效率的重要因素之一。但是50%的連接效率還是太低，考慮到在PCR過程中Taq DNA聚合酶雖然在每輪PCR結束后可優(yōu)先在PCR產(chǎn)物的3’端加入一個“A”，但是隨著DNA片段長度的增加，其在PCR產(chǎn)物的3’端加入“A”的效率會逐漸降低。因此，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后需再用Taq DNA聚合酶和dATP對其處理以提高其3’端加入“A”的效率。實驗結果表明，經(jīng)該步處理后，連接效率由50%提高至90%，表明該步驟在將長片段DNA PCR擴增產(chǎn)物連接至T載體的過程中發(fā)揮重要作用，這也提示可以將待擴增的DNA片段先用高保真的DNA聚合酶擴增，而后再用普通的Taq DNA聚合酶和dATP對其處理以高效地和T載體連接。這樣既保證了DNA序列的正確同時又有利于連接的高效率，在分子克隆實驗中將非常有用。

為增加T載體與DNA片段后篩選出的幾率，大多實驗通過藍白篩選實驗進行初篩。一方面使實驗過程變得復雜，同時該實驗依賴于藍白篩選標記基因--LacZ基因的存在，對于不含該基因的目標載體則無法進行T載體的克隆，而且即便是白色的克隆，其是否為陽性仍需要進行PCR或測序進一步驗證[13-15]。本實驗通過對連接反應條件的優(yōu)化表明要增加T載體與DNA插入片段的連接效率，一方面需要高質(zhì)量的T載體，同時插入片段DNA兩端5’的磷酸化與否及其3’端突出A的比例對連接效率發(fā)揮重要作用。如果這些條件都得到優(yōu)化，可以達到不低于90%的連接效率。

[1]Zhou MY, Gomez-Sanchez CE. Universal TA Cloning[J].CurrIssuesMolBiol, 2000, 2(1): 1-7.

[2]Marchuk D, Drumm M, Saulino A,etal. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products[J].NucleicAcidsRes, 1990, 19(5): 1154.

[3]Holton TA, Graham MW. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors[J].NucleicAcidsRes, 1990, 19(5): 1156.

[4]Gu J, Ye C. pYEMF, a pUC18-derived XcmI T-vector for efficient cloning of PCR products[J].MolBiotechnol, 2011, 47(3): 229-233.

[5]You L, Luo J, Wang A,etal. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells[J].MolBiolRep, 2010, 37(6): 2757-2765.

[6]Jeung JU, Cho SK, Shim KS,etal. Construction of two pGEM-7Zf(+) phagemid T-tail vectors using AhdI-restriction endonuclease sites for direct cloning of PCR products[J].Plasmid, 2002, 48(2): 160-163.

[7]盧銀平, 郭濤, 祝建芳, 等. 通用表達型T載體的構建與真核基因的快速克隆表達[J]. 實用醫(yī)學雜志, 2009, 25(22): 3740-3742.

[8]Lv Y, Wang T, Yuan S,etal. T-vector and in vivo recombination as tools to construct a large antibody library of breast cancer[J].Hybridoma(Larchmt), 2010, 29(3): 251-254.

[9]Luo K, Harding SA, Tsai C. A modified T-vector for simplified assembly of hairpin RNAi constructs[J].BiotechnolLett, 2008, 30(7): 1271-1274.

[10]Goda N, Tenno T, Takasu H,etal. The PRESAT-vector: asymmetric T-vector for high-throughput screening of soluble protein domains for structural proteomics[J].ProteinSci, 2004, 13(3): 652-658.

[11]Jo C, Jo SA. A simple method to construct T-vectors using XcmI cassettes amplified by nonspecific PCR[J].Plasmid, 2001, 45(1): 37-40.

[12]Zhao Y, Liu Z, Yu S,etal. Construction of a High Efficiency PCR Products Cloning T Vector Using pGEM-5zf (+). Avicenna[J].AvicennaJMedBiotechnol, 2009, 1(1): 37-39.

[13]Shimada T, Yamamoto K, Ishihama A. Novel Members of the Cra Regulon Involved in Carbon Metabolism in Escherichia coli[J].JBacteriol, 2011, 193(3): 649-659.

[14]Walrad PB, Hang SY, Gergen JP. Hairless is a cofactor for Runt-dependent transcriptional regulation[J].MolBiolCell, 2011, 22(8): 1364-1374.

[15]Li ZF, Blissard GW. Cellular VPS4 Is Required for Efficient Entry and Egress of Budded Virions of Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus[J].JVirol, 2012, 86(1): 459-472.

Construction of T vectors based on Xcm I recognition site and optimization of PCR fragments for ligation

ZHANG Yi-qiao1, ZHANG Yan-fang1+, LONG Chao-liang1, LI Chun-yue1, LONG Xue-hui1,CUI Wen-yu2, ZHANG Hao1△, WANG Hai1△

(1. Institute of Health and Environmental Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850;2. Beijing Thadweik Academy of Medicine, Beijing 100039, China)

Objective: To construct T vectors based on Xcm I recognition site and optimize the PCR fragments for its ligation. Methods: We firstly cloned the human histone H4 cDNA containing one Xcm I recognition site at both its 5’ and 3’ end into pCDNA 3.0 vector and then generated T vector with pCDNA 3.0 backbone by cutting the recombinant plasmid with Xcm I. To increase the ligation efficiency, the primers were firstly phosphorylated before DNA fragments amplification and then the PCR products were treated with Taq DNA polymerase and dATP after PCR amplification. Two DNA fragments with the length of 312 bp and 1 329 bp were ligated to it and the ligation mixture was transformed into E.coli DH5α competent cells and the positive rates of the transformants were evaluated by PCR and DNA agarose gel electrophoresis. Results: Our results showed that the T vector produced by our method could ligate to the target DNA fragments with high efficiency. Besides, the phosphorylation state of the primers used for PCR amplification is also an important factor determining the cloning efficiency. What’s more, as for longer DNA fragments, retreatment with Taq DNA polymerase and dATP after PCR amplification and purification could improve the ligation efficiency significantly. Conclusion: Our protocol may overcome the dependence on blue/white screening to get positive clones and provide a potent way to generate T vectors and ligate them to the target PCR fragment.

Xcm I, T vector, phosphorylation, dATP

國家重點基礎研究發(fā)展計劃資助(973計劃)(2012CB518200)；+：共同第一作者

2015-03-31

2015-10-21

△Tel：010-66932651； E-mail: wh9588@sina.com， zhanghal197@hotmail.com；?+：共同第一作者

Q786

A

1000-6834(2016)01-046-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.012