鄭嫵媚， 初海平， 王　燕， 王福文△

(1. 山東省醫(yī)學科學院藥物研究所， 2. 濟南大學 山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院， 濟南 250062)

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力竭運動后不同時相大鼠心肌p-p38MAPK、NF-kB、COX-2表達的動態(tài)變化*

鄭嫵媚1,2， 初海平1， 王燕1， 王福文1△

(1. 山東省醫(yī)學科學院藥物研究所， 2. 濟南大學 山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院， 濟南 250062)

目的：觀察急性力竭運動后不同時相大鼠心肌組織p38絲裂原蛋白激酶(p38MAPK)的磷酸化程度、核因子 (NF-kB)和環(huán)氧合酶-2(COX-2) 的動態(tài)變化，探討其對力竭性運動損傷心肌組織的作用。方法：雄性Wistar大鼠60只隨機分為對照組和力竭運動組，力竭運動組再分為運動后0 h組、3 h組、6 h組、12 h組、24 h組5個亞組(n=10)。通過一次性力竭游泳運動建立心肌損傷模型，分別于運動結(jié)束后不同時間點取大鼠左心室心肌組織，Western blot法檢測p-p38MAPK、NF-kB、COX-2蛋白表達。結(jié)果：與對照組相比，力竭運動后不同時間點大鼠心肌組織中p-p38MAPK均顯著增加(P<0.01)，且3 h組最高(P<0.01)； 運動后0 h，大鼠心肌組織中NF-kB和COX-2含量均無明顯改變，其余時間點二者均明顯增加(P<0.05)，NF-kB 含量6 h組顯著高于其它各組(P<0.05)，COX-2含量24 h組顯著高于其它各組(P<0.05)。結(jié)論：一次性急性力竭運動可以激活p38MAPK信號通路，從而活化NF-kB，并上調(diào)COX-2表達，引發(fā)過度炎癥反應(yīng)，提示p-p38MAPK、NF-kB和COX-2在急性力竭運動誘發(fā)心肌損傷的過程中可能起著重要作用。

力竭運動；p-p38MAPK；NF-kB；COX-2；大鼠；心肌細胞

隨著競技體育比賽的日益激烈，過度運動所致的運動性心肌損傷的發(fā)生日益顯著，正成為運動醫(yī)學領(lǐng)域十分關(guān)注的嚴重問題之一。其病理發(fā)生機制極其復(fù)雜，涉及眾多因素，但過度的炎性反應(yīng)是其產(chǎn)生的重要機制之一。環(huán)氧化酶-2(cycloxygenase-2,COX-2)又稱為炎癥誘導(dǎo)酶，是影響體內(nèi)花生四烯酸代謝中最主要的前列腺素合成限速酶。文獻報道通過降低COX-2 mRNA表達，能減少患心血管疾病的風險[1]。新型的COX-2抑制劑莫比可高選擇性的抑制COX-2，能很好地減緩急性運動創(chuàng)傷性炎癥[2]。p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKS)是生物體內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)之一，在機體應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中起著非常重要的調(diào)節(jié)和控治的作用。核因子-kB(nuclear factor kappa B, NF-kB)是在心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞等細胞內(nèi)廣泛存在，活化的NF-kB可以調(diào)節(jié)多種炎癥相關(guān)因子如趨化因子、細胞粘附分子、細胞因子等基因的轉(zhuǎn)錄。 目前，關(guān)于力竭性運動誘發(fā)心肌損傷過程中p-p38MAPK、NF-kB和COX-2的動態(tài)研究少見報道。本實驗通過大鼠負重力竭游泳運動建立心肌損傷動物模型，觀察大鼠一次性力竭運動后不同時相p-p38MAPK、NF-kB、COX-2表達的動態(tài)改變，并探討它們在運動性心肌損傷產(chǎn)生中的作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

p-p38MAPK兔單克隆抗體(美國Cell Signaling, #4511)，NF-kB兔單克隆抗體(美國Cell Signaling, #8242)，COX-2兔單克隆抗體(美國Cell Signaling, #12282)。J-25型高速冷凍離心機，美國 BLCKMEN公司；Victor1420多功能標記儀，美國PERKIN ELMER公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；LAS4000型化學發(fā)光成像儀，日本FUJIFLM公司。

1.2實驗動物

健康雄性Wistar大鼠60只，體重220～250 g，SPF級，購買于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(魯)20130001。實驗期間，實驗動物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，室溫維持在20℃～26℃，保持相對濕度40%～70%，自由飲水。動物室安靜、通風。實驗動物飼料由山東省實驗動物中心提供，由濟南康大飼料有限公司生產(chǎn)，許可證號：SCXK(魯)20130017。

1.3運動性心肌損傷實驗動物模型建立

按照王福文等[3]的方法、條件和標準建立一次性大鼠力竭模型。大鼠尾部負2%體重的負荷進行力竭游泳，游泳時間不能少于3 h。

1.4實驗分組

健康雄性Wistar大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，根據(jù)體重隨機分為安靜對照組和力竭運動組，后者又分為力竭運動后0 h組、3 h組、6 h組、12 h組、24 h組(n=10)。安靜對照組大鼠不做任何運動，力竭性運動組按照建模要求運動。

1.5動物取材

大鼠運動結(jié)束后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h，分別腹腔注射20%烏拉坦(0.2 ml/100 g)麻醉，放血后迅速取下心臟，在左心室同一部位取心肌組織200～250 mg，裝入EP管中，置于-80℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.1Western blot法檢測心肌組織中p-p38MAPK、NF-kB、COX-2 的表達取液氮保存的心臟組織100 mg，在研缽中加入液氮研磨，然后加入含1 mmol/L PMSF的裂解液1 ml研磨均勻，倒入玻璃勻漿器中充分裂解，設(shè)置高速低溫離心機的條件為14 000 r/min、4℃，離心10 min，取上清液，分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。BCA試劑盒測定勻漿上清液的蛋白濃度，按常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳，10%分離膠，5%濃縮膠，p-p38 一抗(1∶1 000)、NF-kB(p50)一抗(1∶1 000)和COX-2 一抗(1∶500)，化學發(fā)光成像儀進行顯影后，應(yīng)用Image J圖像處理系統(tǒng)處理蛋白條帶，進行半定量分析。

1.6統(tǒng)計學分析

2　結(jié)果

2.1各組心肌組織中p-p38MAPK表達

與安靜對照組比較，大鼠力竭運動后不同時間0 h組、3 h組、6 h組、12 h組、24 h組 心肌組織中p-p38MAPK蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，且3 h組最高，隨后明顯降低(P<0.01，圖1, 表1)。

Tab. 1　Effect of acute exhausted exercise on p-p38MAPK, NF-kB and COX-2 in rats-relative ±s， n=10)

p-p38MAPK：p-p38 mitogen-activated protein kinase； NF-kB：Nuclear factor kappa B; COX-2: Cycloxygenase-2

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;?#P<0.05,##P<0.01vs0 h group;?△P<0.05,△△P<0.01vs3 h group;?▲P<0.05,▲▲P<0.01vs6 h group;?○P<0.05vs12 h group

Fig. 1Dynamic change of myocardium p-p38MAPK in different time periods after single bout exhausted exercise in rats

2.2心肌組織中NF-kB表達

與安靜對照組比較，力竭運動組大鼠運動后3 h組、6 h組、12 h組和24 h組 心肌組織中NF-kB蛋白表達均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；運動后0 h組、3 h組和6 h 組NF-kB表達逐次遞增，且6 h組為最高(P<0.01)，隨后逐漸降低(P<0.01,表1, 圖2)

2.3心肌組織中COX-2表達

與安靜對照組比較，力竭運動組大鼠運動后3 h組、6 h組、12 h組和24 h 組心肌組織中COX-2蛋白表達均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，運動后0 h組、3 h組、6 h組 COX-2蛋白表達逐次遞增， 6 h組顯著高于運動后0 h組和 3 h組(P<0.05)，12 h組有所降低， 24 h組達高峰(P<0.05，P<0.01，表1，圖2)

Fig. 2Dynamic change of myocardium NF-kB and COX-2 in different time periods after single bout exhausted exercise in rats

NF-kB：Nuclear factor kappa B; COX-2: Cycloxygenase-2

3　討論

適度運動可以有效地改善心血管功能，而過度運動作為一種應(yīng)激性刺激，會導(dǎo)致心臟功能不全、超微結(jié)構(gòu)損傷、電生理異常等。因此由過度運動尤其是力竭運動或長時間的劇烈運動所引起的心肌損害逐漸成為運動醫(yī)學領(lǐng)域的熱點問題之一。有研究表明，大鼠力竭運動中由于心肌缺血缺氧可致心肌產(chǎn)生一定的損傷，隨后由于血液供應(yīng)的恢復(fù)，可致心肌產(chǎn)生比運動時更嚴重的損傷，這與臨床缺血再灌注損傷相似，因此又稱之為運動性缺血再灌注損傷[4]。王福文等[3]研究表明，力竭性運動不僅可以產(chǎn)生直接的心肌損傷，也可以引起運動延遲性心肌損傷。

眾所周知，炎癥是由炎癥介質(zhì)如花生四烯酸等引起的，機體受到局部損傷或刺激后，在環(huán)氧合酶作用下花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，引起炎癥。COX又名前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶，有COX-1和COX-2兩種亞型，結(jié)構(gòu)酶COX-1在正常生理狀態(tài)下持續(xù)表達，對炎癥介質(zhì)的增加沒有影響；COX-2為誘生性酶，其表達受細胞內(nèi)外各種刺激因素調(diào)節(jié)，與炎癥、疼痛等有密切關(guān)系，可通過催化花生四烯酸促進炎性前列腺素物質(zhì)合成，引起炎癥反應(yīng)和介導(dǎo)炎性細胞毒性。抑制COX-2表達，可減輕心肌炎癥反應(yīng)，減輕心肌缺血再灌注損傷[5]。

COX-2的表達受多個程序調(diào)控，其一可通過p38MAPK信號通路上調(diào)COX-2的表達。p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是最近研究較多的一種調(diào)控炎癥機制的信號通路，磷酸化的p38MAPK是p38MAPK信號通路中介導(dǎo)炎性反應(yīng)的活性物質(zhì)。研究已證實，p38MAPK抑制劑SB203580可明顯降低炎癥因子的產(chǎn)生，從而減少炎癥反應(yīng)[6]。COX-2啟動子的活性可通過p38MAPK特異性抑制劑顯著下調(diào)[7]。本實驗結(jié)果表明，力竭性運動后不同時間心肌組織中p-p38MAPK表達均顯著增加，且3 h p38MAPK磷酸化程度最高，說明力竭性運動可以激活起p38MAPK信號通路。其二是通過NF-kB信號通路對COX-2起調(diào)控作用。NF-kB是對缺氧敏感的炎癥反應(yīng)標志物，它可以調(diào)節(jié)超過60個基因的轉(zhuǎn)錄表達如細胞粘附分子、細胞因子、化學趨化因子等，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等多種生物學過程。

臨床研究表明，NF-kB在心肌缺血再灌注損傷中起著重要作用，NF-kB p65可誘導(dǎo)COX-2表達，誘導(dǎo)和增強炎癥反應(yīng)，在心肌缺血再灌注過程中發(fā)揮重要作用[8]。p38MAPK信號通路和NF-kB信號通路具有相關(guān)性，活化的p38MAPK進入細胞核，激活NF-kB，下調(diào)p38MAPK信號通路可抑制NF-kB的過度激活[9]。p38MAPK在調(diào)節(jié)激活子蛋白-1(transcription activitor 1，AP-1)的活性中起著重要作用，而AP-1是調(diào)節(jié)COX-2表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，抑制NF-kB和AP-1的活性可以控制COX-2的表達[10]。本實驗結(jié)果表明，力竭性運動后3 h p38MAPK磷酸化程度最高，6 h NF-kB達到高峰，滯后于p38MAPK的表達，24 h COX-2達到高峰，滯后于p38MAPK、NF-kB的表達，p38MAPK、NF-kB與COX-2在表達強度上有時相上的先后性。p38MAPK通路可以通過多種間接方式調(diào)節(jié)NF-kB的活化，p38MAPK和NF-kB可能共同參與了COX-2的發(fā)生、發(fā)展過程。說明在力竭運動誘發(fā)心肌損傷的過程中，過度運動可能首先激活p38MAPK信號通路，使p38MAPK磷酸化，然后活化NF-kB，從而調(diào)控且促進COX-2的表達，引發(fā)過度炎性反應(yīng)，造成運動性心肌損傷。因此p38MAPK可能是預(yù)防和治療運動性心肌損傷的新靶點。有研究發(fā)現(xiàn)，給予p38MAPK特異性抑制劑BIRB796后，p38MAPK表達明顯下降，心肌缺血再灌注損傷明顯減輕[11]。劉流[12]等人也發(fā)現(xiàn)，p38MAPK的表達能減少炎性因子生成，抑制炎性反應(yīng)，從而減少心肌缺血再灌注損傷。

總之，一次性力竭運動可以引起心肌p-p38MAPK、NF-kB、COX-2均出現(xiàn)不同程度的升高，且高峰期呈時間依賴式特點，提示p38MAPK信號通路、NF-kB 和COX-2皆介入了運動性心肌損傷的形成過程。

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The dynamic expression changes of myocardium p-p38MAPK, NF-kB and COX-2 in rats after an exhausted exercise

ZHENG Wu-mei1,2, CHU Hai-ping1, WANG Yan1, WANG Fu-wen1△

(1. Institute of Materia Medica, Shandong Academy of Medical Sciences, 2. School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan- Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China)

Objective: To observe the dynamic expression changes of p38 mitogen-activated protein kinase(p38MAPK), nucler facter kappa B (NF-κB) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in myocardial tissue after an exhausted exercise and study the impact of p38MAPK, NF-kB and COX-2 on its myocardial damage. Methods: Sixty Wister male rats were randomly divided into the control group (n=10) and the exhausted exercise group (n=50). Then the exhausted exercise group was further divided into 5 subgroups, namely 0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h after an exhausted exercise(n=10). The myocardial injury animal model was set up by using an exhausted swimming exercise and the expression of p-p38MAPK, NF-kB and COX-2 were examined by Western blot. Results: Compared with the control group, the expression of p-p38MAPK were increased significantly(P<0.01) in all the groups and the 3 h group was the highest(P<0.01); The expression of NF-kB were increased significantly(P<0.05) in all the groups but 0 h (P>0.05) and the 6h group was increased significantly compared with the other groups(P<0.05); The expression of COX-2 were increased significantly(P<0.05) in all the groups but 0 h and the 24 h groups was increased significantly compared with the other groups(P<0.05). Conclusion: p38MAPK was activated in an acute exhausted exercise, p-p38MAPK may play an important role in modulating NF-kB and COX-2 expression and mediating the exhausted exercise induced myocardial damage.

exhaustive exercise;p-p38MAPK;NF-kB;COX-2;rats;myocardial cell

國家科技重大專項子課題(2009ZX09301-013)；山東省自然科學基金項目資助(ZR2009CM089)

2015-06-15

2015-10-12

△Tel: 0531-82919972； E-mail: wangfuwww@tom.com

R965.2

A

1000-6834(2016)01-088-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.023