李曉鵬， 趙倩倩， 楊　嵐， 李海清， 崔香麗

(山西醫(yī)科大學生理學系， 省部共建細胞生理學重點實驗室， 太原 030001)

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β3腎上腺素能受體對大鼠胸主動脈平滑肌舒縮活動的影響及其機制*

李曉鵬， 趙倩倩， 楊嵐， 李海清， 崔香麗△

(山西醫(yī)科大學生理學系， 省部共建細胞生理學重點實驗室， 太原 030001)

目的：觀察激動β3-腎上腺素能受體(β3-AR)對大鼠胸主動脈平滑肌舒縮活動的影響及其可能機制。方法：30 mmol/L高鉀生理鹽溶液預收縮去內(nèi)皮大鼠離體胸主動脈后，觀察β3腎上腺素能受體激動劑BRL37344(BRL)對主動脈舒縮活動的影響。用SR59230A (SR)、普萘洛爾(Pra)、L-NNA、H-89以及Iberiotoxin (IBTX)預孵主動脈平滑肌，探討其可能存在的作用機制;應用免疫組織化學法，觀察β3-AR在大鼠胸主動脈的分布。結(jié)果：①BRL對預收縮的去內(nèi)皮大鼠胸主動脈產(chǎn)生顯著的舒張作用，舒張百分比為(10.59±0.79)%；② 大鼠胸主動脈組織切片中可以觀察到β3-AR在內(nèi)皮和平滑肌層都有表達；③ 給予Pra后，BRL對血管的舒張百分比無顯著性變化; SR能明顯拮抗BRL的血管舒張作用；④ 用L-NNA阻斷NOS或者H-89抑制PKA后，BRL對血管的舒張作用有不同程度的減弱；⑤ IBTX阻斷大電導鈣依賴性鉀通道后，BRL對血管的舒張作用減小。結(jié)論：激動β3-AR產(chǎn)生血管舒張作用，平滑肌β3-AR的作用與NOS以及PKA信號轉(zhuǎn)導途徑有關(guān)，是通過影響大電導Ca2+依賴性鉀通道(BK通道)來實現(xiàn)的。

大鼠；β3腎上腺素能受體；主動脈；平滑肌；NOS；PKA；Ibriotoxin

1989年β3-AR作為區(qū)別于β1、β2受體的新型腎上腺素能β受體被成功克隆，之后相繼在體內(nèi)多種組織如脂肪組織、循環(huán)、呼吸、泌尿和生殖等系統(tǒng)中均有發(fā)現(xiàn)。在正常心肌組織，β3-AR介導負性肌力作用，使心臟的收縮能力下降[1]，在心力衰竭的心肌組織則可能會因為心衰程度的不同產(chǎn)生負性或正性的肌力作用[2]；在小腸、子宮和膀胱平滑肌中，β3-AR同樣也能介導平滑肌的負性肌力作用，引起小腸、子宮和膀胱平滑肌的舒張[3-5]，對于β3-AR在血管的分布則有種屬和部位的差異。對于大鼠胸主動脈，Trochu JN等的研究發(fā)現(xiàn)SR58611和CGP12177能引起大鼠胸主動脈劑量依賴性的舒張，且去除內(nèi)皮這種舒張作用明顯減弱，提示β3-AR主要存在于胸主動脈內(nèi)皮層，受體的激動能產(chǎn)生血管舒張作用[6]；Brawley L等的研究應用多種β受體激動劑如異丙腎上腺素、CGP12177、ZD2079等同樣證明了大鼠胸主動脈存在β1、β2受體以及非典型腎上腺素能β受體(β3、β4)的存在，這些受體協(xié)同產(chǎn)生舒張血管的作用[7]。在心肌組織，β3-AR的激動能活化Gi蛋白，繼而激活NOS-NO途徑作用(主要是通過eNOS)于L型Ca2+通道等靶點通過影響心肌細胞膜電位以及興奮收縮耦聯(lián)過程從而實現(xiàn)負性肌力作用[8]，而且能夠通過降低β1受體的谷胱甘肽化以及鈉鉀泵的激活實現(xiàn)嚴重心力衰竭時轉(zhuǎn)運出細胞內(nèi)部多余的Na+起到正性肌力作用以及保護心肌細胞和代償作用[9]。在膀胱平滑肌，β3-AR的激動能夠增大BK通道STOC(自發(fā)的短暫的外向BK通道電流)開放頻率，使膜電位超極化而舒張平滑肌[10]。對于大鼠胸主動脈內(nèi)皮和平滑肌層到底有無功能性的腎上腺素能β3受體存在一定的爭議，僅僅只針對大鼠胸主動脈平滑肌層有無β3-AR的研究相對較少，其下游信號轉(zhuǎn)導途徑以及離子通道靶點的研究也不甚明確，本課題組旨在研究去內(nèi)皮大鼠胸主動脈平滑肌層中β3-AR是否有分布、其在血管舒縮活動中的作用及可能的信號轉(zhuǎn)導機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物清潔級SD大鼠，雄性，180～220 g，100只，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心(SCXK(京)2009～0019)提供。大鼠在12 h∶12 h明暗交替、室溫 22℃～25℃、濕度50%～60%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食與飲水，受試動物在動物觀察室內(nèi)飼養(yǎng)兩周后開始實驗。

1.1.2試劑ACh((CH3)3N+CH2CH2OCOCH3C l-)、BRL37344(±)-(R,R)-[4-[2-[[2-(3-Chlorophenyl)-2-hydroxyethyl]amino]propyl]phenoxy]acetic acid sodium hydrate)、Propranolol((R)-1-(異丙基氨基)-3-(1-萘氧基)-2-丙醇鹽酸鹽C10H7OCH2CH(OH)CH2NHCH(CH3)2·HCl)、SR59230A(3-(2-Ethylphenoxy)-1-[[(1S)-1,2,3,4-tetrahydronaphth-1-yl]amino]-(2S)-2-propanol oxalate salt)、L-NNA(L-NNA N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid NG-NO2-L-Arg)、H-89(N-[2-(p-Bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide dihydrochloride)、IBTX(C179H276N50O56S7)、DMSO均購于美國Sigma公司。其他試劑購自上海生工生物工程有限公司。β3受體抗體購自上海博研生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠胸主動脈環(huán)實驗

1.2.1.1大鼠胸主動脈環(huán)的制備及內(nèi)皮完整性檢測：取SD大鼠，斷頭處死，迅速打開胸腔，分離胸主動脈，將取下的胸主動脈放入4℃的生理鹽液(PSS液)(NaCl 144，KCl 5.8，MgCl21.2，CaCl22.5，Glucose 11.1，HEPES 5，單位mmol/L,以1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4)，小心剪去血管周圍的脂肪組織和結(jié)締組織，將胸主動脈剪成3～4 mm的血管環(huán)，若去內(nèi)皮時則用與血管內(nèi)徑相適應的棉棒從管腔擦過，然后用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管環(huán)，水平懸掛于10 ml浴槽中，下方固定，上方通過一根細鋼絲懸掛于張力換能器。應用Powerlab生物信號采集系統(tǒng)記錄血管張力。浴槽中注有37.5℃、通入100%O2、pH調(diào)節(jié)為7.4的PSS液。調(diào)整血管位置至水平，使其各部分所受張力平衡，其后調(diào)節(jié)前負荷至2 g，平衡1 h，期間每15 min換一次PSS液。待血管張力穩(wěn)定后，每組血管環(huán)均用30 mmol/L KCl PSS液刺激兩次，當血管環(huán)對刺激穩(wěn)定即兩次同樣的刺激所引起的收縮幅度差距小于10%時，換液兩次。需要檢驗內(nèi)皮完整性時，用10-5mol/L去甲腎腺素溶液刺激血管，收縮達到平臺期后，加入ACh(浴槽內(nèi)終濃度為10 μmol/L)檢驗血管內(nèi)皮完整程度，若ACh引起的舒張程度大于70%，則認為內(nèi)皮保存完整；若ACh引起的舒張程度小于預收縮的5%時，認為內(nèi)皮已完全去除。

1.2.1.2各種藥物在血管環(huán)實驗中的應用已檢驗合格的大鼠正常以及去內(nèi)皮胸主動脈，經(jīng)30 mmol/L KCl PSS液刺激達到平臺期后，累積加入BRL37344使浴槽中的終濃度依次遞增為10-7mol/L、3×10-7mol/L、10-6mol/L、3×10-6mol/L、10-5mol/L，記錄不同濃度下血管環(huán)的張力，計算張力變化值，計算各個濃度下舒張百分比(設(shè)定30 mmol/L KCl PSS引起的最大收縮幅度為100%，加入藥物后引起的血管舒張幅度與KCl誘導的最大幅度的比率即為舒張百分比)。同樣的方法記錄一次性加入BRL37344使浴槽中終濃度為10-5mol/L時的血管張力，并計算舒張百分比。對于Pra、SR59230A、L-NNA、H-89以及IBTX這些阻斷劑和抑制劑，在預收縮前先孵育10 min，預收縮達到平臺期后加入10-5mol/L的BRL37344，記錄血管張力并計算舒張百分比。

1.2.1.3溶劑時間對照已檢驗合格的大鼠正常以及去內(nèi)皮胸主動脈，經(jīng)30 mmol/L KCl PSS液刺激穩(wěn)定后加入0.1 μl DMSO(BRL37344和SR59230A初步溶解所用)作為溶劑對照，終體積濃度為0.2‰。待張力曲線穩(wěn)定20 min作為溶劑時間對照。

1.2.2免疫組織化學法斷頭處死大鼠后，迅速剪下胸主動脈置于4℃的PSS液，仔細剝離血管周圍的脂肪和結(jié)締組織，浸入福爾馬林溶液進行固定。其后進行蠟塊包埋，切片厚度5 μm，再經(jīng)過脫蠟、抗原修復、孵育兔抗鼠抗β3受體抗體一抗、二抗試劑盒、加SABC封閉以及DAB顯色劑顯色后，鏡下觀察β3受體的表達。

1.3統(tǒng)計

2　結(jié)果

2.1大鼠胸主動脈環(huán)內(nèi)皮完整性檢測

加入終濃度為10 mmol/L的乙酰膽堿后，內(nèi)皮完整的大鼠胸主動脈環(huán)血管環(huán)立即出現(xiàn)明顯的舒張效應，且在5 min內(nèi)達到平臺期，舒張百分比不小于70%；用棉棒擦去內(nèi)皮的大鼠胸主動脈環(huán)張力曲線則保持平穩(wěn)，并無衰減跡象，10 min內(nèi)舒張百分比小于5%(圖1)。

Fig. 1Checking the endothelium integrity of rat thoracic aorta rings

2.2BRL37344對KCl預收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮大鼠胸主動脈環(huán)的影響

BRL37344對內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮大鼠胸主動脈產(chǎn)生劑量依賴性的舒張作用，與內(nèi)皮完整組相比，BRL對去內(nèi)皮大鼠胸主動脈環(huán)產(chǎn)生的舒張量效曲線Emax明顯減弱(P<0.01)量效曲線右移。內(nèi)皮組和去內(nèi)皮組BRL產(chǎn)生的最大舒張百分比Emax分別為(24.51±0.55)、(11.86±2.20)(圖2)。

2.3SR59230A和Propranolol對BRL37344舒張作用的影響

一次性加入BRL37344，使浴槽中終濃度為10 μmol/L，30 min內(nèi)其對血管產(chǎn)生明顯的舒張作用，且達到平臺期，舒張百分比為(10.59±0.79)；預孵SR59230A(選擇性β3-AR阻斷劑)后，BRL對血管的舒張效應受到明顯抑制(P<0.01)，舒張百分比為(1.63±0.58)；預孵Propranolol(β1、β2受體阻斷劑)后，BRL對血管的舒張效應基本無變化(P>0.05),舒張百分比為(10.41±0.85)(圖3)。

Fig. 2The effect of BRL37344 on the thoracic aorta rings pre-contracted by KCl with or without endothelium (n=7)

**P<0.01vsendothcllum

Fig. 3BRL37344 relaxes thoracic aorta smooth muscle via activation of β3adrenoceptors(n=6)

A：BRL； B：BRL37344 relaxes thoracic aorta smooth muscle in presence of Pra; C：SR inhibits the relaxation effect of BRL； D：Action of BRL on thoracic aorta smooth muscles in presence of Pra and SR

**P<0.01vsBRL group

2.4預孵H-89和L-NNA后，BRL37344對預收縮去內(nèi)皮大鼠胸主動脈環(huán)的影響

為了探究β3-AR的信號轉(zhuǎn)導機制，本實驗采用預孵H-89(PKA抑制劑)、L-NNA(NOS抑制劑)后，BRL的舒血管效應有了不同程度的減弱(P<0.05，P<0.01，圖4)，且L-NNA對BRL37344的影響更大，其舒張百分比分別為(7.84±0.80)、(3.68±0.47)。

2.5預孵IBTX后，BRL37344對預收縮去內(nèi)皮大鼠胸主動脈環(huán)的影響

預孵IBTX(選擇性大電導鈣離子依賴性鉀通道阻斷劑)，使浴槽中終濃度為200 nmol/L，高鉀刺激血管待張力穩(wěn)定后加入終濃度為10 μmol/L的BRL37344，這時血管張力降低較顯著，BRL產(chǎn)生的血管舒張百分比較單獨加入BRL減小，這提示預孵IBTX阻斷BK通道能夠明顯阻斷 BRL對血管的舒張效應(P<0.01)，預孵IBTX后BRL產(chǎn)生的血管舒張百分比(4.57±0.30)(圖5)。

Fig. 4Relaxation of β3-AR on thoracic aorta smooth muscle are related to activation of NOS and PKA signaling pathway (n=6)

*P<0.05，**P<0.01vsBLR group

Fig. 5β3adrenoceptors relax aorta smooth muscle via activation of large-conductance Ca2+-dependent potassium channels (n=6)

**P<0.01vsBLR group

2.6溶劑對本實驗結(jié)果的影響

加入DMSO 30 min，可觀察到血管張力曲線平穩(wěn)，基本不發(fā)生衰減，舒張百分比為(0.007±0.002)，且與各組實驗結(jié)果相比，統(tǒng)計學差異顯著(P<0.01，表1)。

Tab. 1Relaxation percentage of BRL37344 on thoracic aorta smooth muscle

GroupRelaxation(%) nControl0.007±0.0025BRL10.59±0.79**6SR+BRL1.63±0.58**6

**P<0.01vscontrol group

3　討論

本實驗通過形態(tài)學和功能學研究證明了β3-AR在大鼠胸主動脈內(nèi)皮和平滑肌層均有存在，激動β3-AR能產(chǎn)生舒張血管的效應。β3-AR最早發(fā)現(xiàn)于脂肪細胞，主要參與脂肪組織甘油三酯的降解。其后逐漸被發(fā)現(xiàn)在很多系統(tǒng)中都有分布。在心肌組織中β3-AR激活能夠產(chǎn)生心肌的負性肌力作用[11]。對大鼠胸主動脈β3-AR的研究有兩種截然不同的觀點：一種認為大鼠胸主動脈中存在有功能的β3-AR，且能產(chǎn)生血管舒張作用；另一種觀點是大鼠胸主動脈中并不存在有生物活性的β3-AR，異丙腎上腺素的作用不能被β1、β2受體阻斷劑阻斷是因為可能阻斷了α受體[12]。因此大鼠胸主動脈有無功能性的β3-AR仍不明確。本實驗應用選擇性β3-AR激動劑BRL37344，觀察到BRL37344對內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的胸主動脈都能夠產(chǎn)生有劑量依賴性的舒張效應，且BRL37344對去內(nèi)皮的胸主動脈環(huán)產(chǎn)生的血管舒張作用明顯較內(nèi)皮完整的胸主動脈環(huán)降低，提示在大鼠胸主動脈的內(nèi)皮和平滑肌層都可能存在有生物活性的β3-AR，且內(nèi)皮所產(chǎn)生的舒張作用在β3-AR受體激動產(chǎn)生的血管舒張效應中占主要作用。BRL37344在大劑量應用時有激動β1受體的作用，為了排除β1受體對實驗結(jié)果的干擾，本文采用較高濃度的β3-AR阻斷劑SR59230A以及β1、β2受體阻斷劑Propranolol預孵主動脈血管。預孵SR59230A阻斷β3-AR，BRL37344舒張血管的作用明顯受到拮抗；而預孵Propranolol阻斷了β1、β2受體，BRL37344對血管的舒張百分比無顯著改變，提示BRL37344對大鼠胸主動脈平滑肌層的作用是通過激動β3-AR來實現(xiàn)的，與β1、β2受體無關(guān)(圖3)。累積濃度的BRL37344所產(chǎn)生的濃度梯度也存在時間依賴性，濃度越高，達到最大效應的時間也越長?？紤]到存在時間衰減的問題，本實驗采用一次性加入同等濃度的BRL37344，以排除時間衰減造成的誤差。結(jié)果顯示一次性加入終濃度為10 μmol/L的BRL37344，血管張力曲線在30 min內(nèi)即可達到平臺期。本實驗同樣在高鉀刺激的基礎(chǔ)上加入DMSO(溶解BRL37344相同劑量)，觀察到血管張力平穩(wěn)，不存在溶劑對實驗結(jié)果的干擾。

在心肌組織中，β3-AR的激動能使NO的含量增加，其后作用于許多能夠影響心肌細胞膜電位的離子通道[13]，如鈉鉀泵等[14]，使心肌收縮能力減弱。在大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞中，Gi的活化會激活NOS途徑，引起平滑肌的舒張。有研究表明胸主動脈內(nèi)皮細胞β3-AR的下游信號分子也為NOS。在人膀胱平滑肌β3受體的研究中，也發(fā)現(xiàn)β3-AR激動能夠影響膀胱平滑肌細胞中PKA的活化[10]；在大鼠門靜脈平滑肌細胞中，β3-AR興奮可以通過激活Gαs激活cAMP/PKA通路[15]。而β3-AR激動后也能影響胞內(nèi)cAMP水平[16]，而且β3-AR與β1受體有一定的同源性，因此推測大鼠胸主動脈平滑肌細胞β3-AR的信號轉(zhuǎn)導途徑可能也與PKA有關(guān)。本實驗應用NOS抑制劑L-NNA和PKA抑制劑H-89觀察到BRL產(chǎn)生的血管舒張百分比較單純應用BRL組均有不同幅度的下降, 提示β3-AR激動后產(chǎn)生的血管舒張作用與NOS和PKA信號轉(zhuǎn)導途徑有關(guān)。

膜電位的調(diào)節(jié)是血管張力的主要調(diào)節(jié)因素，鉀通道的開閉可以影響膜電位去極化或者超極化，進而調(diào)節(jié)血管舒縮活動。在膀胱平滑肌，激動β3-AR通過增加BK通道的開放頻率使膜電位超極化而舒張平滑肌；在肺血管床中，β3-AR可以通過NO的釋放增加和激活BK通道、KCa鉀通道而舒張血管[16]。可見BK通道在平滑肌舒縮活動的調(diào)節(jié)中有著很大的作用。本實驗選用BK通道抑制劑IBTX作用于血管平滑肌，觀察BRL37344對去內(nèi)皮大鼠胸主動脈的作用，觀察到預孵IBTX后， BRL37344的舒血管效應降低。提示BRL37344的作用與BK通道的活性有關(guān)，激動β3-AR引起血管平滑肌舒張是通過BK通道的開放實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證明在平滑肌層中的β3-AR可以通過PKA和NOS途徑，并可能影響B(tài)K通道來實現(xiàn)平滑肌的舒張效應。本研究為臨床上高血壓心力衰竭等疾病的治療提供了靶點。但NOS和PKA信號轉(zhuǎn)導途徑是如何影響B(tài)K通道以及BK通道的活性會如何變化還需進一步研究。

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Effects of β3adrenoceptors on the contractility of rat thoracic aorta smooth muscle and the mechanism

LI Xiao-peng, ZHAO Qian-qian, YANG Lan, LI Hai-qing, CUI Xiang-li△

(Department of Physiology, Shanxi Medical University, Cell Physiology Key Laboratory of Provice and Ministry, Taiyuan 030001, China)

Objective: To observe the effect of β3adrenoceptors (β3-AR) activation on rat thoracic aorta smooth muscle contractility and the possible related mechanism. Methods: The endothelium removed thoracic aorta was pre-contracted with 30 mmol/L KCl physiological saline solution (PSS). Then the tension of the thoracic aorta was recorded in presence of BRL37344 (BRL) to determine the action of β3-AR. The tension of the thoracic aorta was also recorded in the presence of Propranolol (PRA), SR59230A (SR), L-NNA, H-89 and Iberiotoxin (IBTX) respectively to reveal the underling mechanism of β3-AR activation on rat vascular smooth muscle. Immunohistochemistry was adopted to confirm the existence and the distribution of β3-AR in rat thoracic aorta. Results: The results showed that:①The thoracic aorta was relaxed by β3-AR activation, with a relaxation percentage of (10.59±0.79). ②β3-AR was expressed in both endothelial and smooth muscle layer in thoracic aorta sections of rats. ③ PRA did not block the effect of BRL on the thoracic aorta. The relaxation actions of BRL could be antagonized by pre-incubating the thoracic aorta with SR. ④ L-NNA (a NOS inhibitor) and H-89 (a PKA inhibitor) reversed the relaxation effect of BRL on vascular smooth muscle. ⑤The effect of BRL was decreased after application of Ibriotoxin (IBTX), a large conductance calcium dependent potassium channel blocker. Conclusion: The results confirmed that activation of β3-AR led to relaxation of thoracic aorta smooth muscle. The relaxation action of β3-AR on smooth muscle of rat thoracic aorta was related to activation of NOS and PKA signaling pathway. Large conductance Ca2+-K+channels were involved in the relaxation action of β3-AR activation on rat thoracic aorta smooth muscle.

β3adrenoceptors;aorta;smooth muscle;NOS;PKA;Ibriotoxin

山西省自然科學基金(2012011040-8)；山西醫(yī)科大學科技創(chuàng)新基金([2012]11號)

2015-04-03

2015-06-15

△Tel: +86-0351-4135075; E-mail: cuixlcxl@sina.com

R331.3

A

1000-6834(2016)01-069-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.018