田小霞， 張慧英△， 王黎敏， 李旭炯， 劉　燕， 張麗麗， 畢楊輝

(1. 長治醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 2. 機(jī)能綜合實驗室， 3. 生理學(xué)教研室， 山西 長治 046000)

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復(fù)合致病因素誘導(dǎo)肝硬化大鼠TGF-α和TGF-β1的動態(tài)變化*

田小霞1， 張慧英1△， 王黎敏2， 李旭炯3， 劉燕3， 張麗麗1， 畢楊輝

(1. 長治醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 2. 機(jī)能綜合實驗室， 3. 生理學(xué)教研室， 山西 長治 046000)

目的：觀察復(fù)合致病因素誘導(dǎo)肝硬化大鼠肝組織中轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (TGF-β1)的動態(tài)變化。方法：采用復(fù)合致病因素法復(fù)制大鼠肝硬化模型：首次皮下注射CCl4原液(0.5 ml/100 g·w)，之后每隔3天皮下注射40% CCl4油溶液(0.3 ml /100 g·w)，同時輔以低膽堿、高膽固醇、高脂肪、高醇飲食。隨機(jī)將大鼠分為肝硬化模型4周、6周和8周組，并分別設(shè)立同期正常對照組。檢測各組大鼠血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和同型半胱氨酸(Hcy)的水平；肝組織切片行HE染色，TGF-α和TGF-β1的免疫組化染色。結(jié)果：與相應(yīng)的同期正常對照組比較，大鼠血漿中ALT、內(nèi)毒素、TNF-α和Hcy水平在肝硬化模型4周、6周和8周組均逐漸顯著升高(P<0.05)；肝組織中TGF-α的表達(dá)在肝硬化模型4周組明顯增加(P<0.05)，而肝組織中TGF-β1的表達(dá)則隨著肝硬化病程的進(jìn)展持續(xù)顯著增加(P<0.05)。結(jié)論：在肝硬化形成過程中，TGF-α的表達(dá)先增加后被抑制，TGF-β1的表達(dá)持續(xù)增加，導(dǎo)致肝細(xì)胞再生先增強(qiáng)后被抑制，而肝纖維化程度不斷加重，最終發(fā)生肝硬化。TGF-α和TGF-β1的這一特征性動態(tài)變化可能與內(nèi)毒素血癥、TNF-α水平增高以及高同型半胱氨酸血癥有關(guān)。

肝硬化；肝再生；肝纖維化；TGF-α；TGF-β1；大鼠

肝臟在受到損傷或切除時具有強(qiáng)大的再生能力，肝再生包括肝細(xì)胞、非實質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的再生。如果細(xì)胞外基質(zhì)成分的生長與肝細(xì)胞的再生失平衡，即細(xì)胞外基質(zhì)成分過度生長，而肝細(xì)胞再生受抑制，就會導(dǎo)致肝臟發(fā)生纖維化乃至硬化[1]。轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factor-α, TGF-α)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)參與肝再生的增殖、凋亡和纖維增生[2]，在維持受損肝臟再生平衡中發(fā)揮重要作用。在前期的實驗中觀察到與正常對照組相比，肝硬化模型8周組動物血漿和肝組織勻漿中TGF-α的含量無明顯變化，而TGF-β1的含量明顯升高[3]，提示TGF-α和TGF-β1的失平衡在影響肝臟疾病走向中起作用。本次實驗以復(fù)合致病因素誘導(dǎo)的肝硬化大鼠為研究對象，觀察肝組織中TGF-α和TGF-β1在模型4周，6周和8周的動態(tài)變化，并初步探討影響這一變化的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑

CCl4(分析純)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；膽固醇購自天津市化學(xué)試劑公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transferase，ALT)、內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的ELISA檢測試劑盒購自上海藍(lán)基生物科技有限公司；兔抗大鼠TGF-α多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，免疫組化染色SP檢測試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；市售品牌白酒；市售玉米面和豬油。

1.2實驗動物分組及標(biāo)本制備

健康雄性SD大鼠36只，清潔級，體重180～220 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。隨機(jī)將大鼠分為肝硬化模型組和正常對照組。肝硬化模型組動物采用復(fù)合致病因素法復(fù)制[4]：以摻入膽固醇(飼料重量0.5%)的玉米面做飼料，前2周摻入豬油(飼料重量20%)，首次皮下注射CCl4原液(0.5 ml/100 g·w)，之后每隔3天皮下注射40% CCl4油溶液(0.3 ml/100 g·w)，以4%(體積比)乙醇作為飲用水。正常對照組動物飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料和礦物質(zhì)飲用水。

將肝硬化模型組動物和正常對照組動物隨機(jī)分為三批，分別于造模第4周末、6周末和8周末，全麻、無菌、無內(nèi)毒素條件下取材。腹主動脈采集血液，3 000 r/min離心15 min后，吸取血漿，置-80℃保存?zhèn)溆茫幻看稳「闻K同一區(qū)域組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，組織切片用于HE染色和免疫組化染色。

1.3血漿中指標(biāo)檢測

嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說明，分別測定血漿中ALT、內(nèi)毒素、TNF-α和Hcy水平。

1.4肝組織病理學(xué)

以石蠟包埋的肝組織標(biāo)本制備4 μm厚連續(xù)切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)改變。

1.5肝組織免疫組化染色及結(jié)果判斷

采用免疫組化SP法檢測肝組織中TGF-α和TGF-β1蛋白表達(dá)情況。主要步驟：組織切片常規(guī)脫蠟至水，微波修復(fù)抗原，分別滴加兔抗大鼠TGF-α (1∶300)和TGF-β1(1∶100)多克隆抗體，4℃冰箱孵育過夜，分別滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對照。

免疫組化切片以有棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，以不著色為陰性。采用Image pro plus醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行半定量分析，每張切片隨即選取10個視野(×400)，分別計算陽性染色細(xì)胞占視野總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1血漿中ALT、內(nèi)毒素、TNF-α和Hcy水平變化

與相應(yīng)的同期正常對照組相比，大鼠血漿中ALT、內(nèi)毒素、TNF-α和Hcy水平在肝硬化模型4周、6周和8周組均顯著升高(P<0.05)，8周組顯著高于4周組(P<0.05)，8周組Hcy水平也顯著高于6周組(P<0.05，表1)。

Tab.

ALT：Alanine transferase; TNF-α：Tumor necrosis factor-α; Hcy: Homocysteine

*P<0.05vscontrol at the same time；?#P<0.05vsmodel 4thweek；?△P<0.05vsmodel 6thweek

2.2肝組織病理學(xué)改變

各正常對照組：肝小葉結(jié)構(gòu)規(guī)整，肝細(xì)胞索排列整齊，板間可見不規(guī)則肝竇。肝硬化模型4周組：損傷呈區(qū)域性分布，肝細(xì)胞脂肪變性明顯，肝細(xì)胞索排列紊亂；模型6周組：損傷區(qū)域較4周組明顯擴(kuò)大，部分區(qū)域小葉結(jié)構(gòu)消失，可見增生的條索狀纖維；模型8周組：大量纖維組織增生形成纖維間隔，分割正常的小葉結(jié)構(gòu)，有假小葉形成(圖1)。

Fig. 1Pathological changes of liver tissues (HE ×100)

4N，6N，8N：Normal control at the 4th，6th，8thweek； 4M，6M，8M：Liver cirrhosis at the 4th，6th，8thweek

2.3肝組織中TGF-α蛋白的表達(dá)

正常肝組織幾乎未見陽性染色。肝硬化模型組可見肝細(xì)胞、肝竇血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝竇旁的間質(zhì)細(xì)胞有表達(dá)，陽性染色細(xì)胞數(shù)在模型4周組最多，6周組明顯減少，8周組與正常對照組相同(圖2)。對染色結(jié)果做半定量分析：與相應(yīng)的正常對照組相比，陽性染色細(xì)胞占視野總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)在肝硬化模型4周組顯著增加，在模型6周和8周組變化不顯著(表2)。

Fig. 2Expression of TGF-α protein in liver tissues detected(Immunohistochemistry ×400)

4N，6N，8N：Normal control at the 4th，6th，8thweek； 4M，6M，8M：Liver cirrhosis at the 4th，6th，8thweek

2.4肝組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)

正常肝組織幾乎未見陽性染色。肝硬化模型組可見變性肝細(xì)胞周圍的肝竇血管內(nèi)皮細(xì)胞，肝竇旁的間質(zhì)細(xì)胞，纖維間隔內(nèi)的間質(zhì)細(xì)胞，增生的膽管上皮細(xì)胞有陽性染色，陽性染色量隨肝硬化病程進(jìn)展逐漸明顯增加(圖3)。對染色結(jié)果做半定量分析：與相應(yīng)的正常對照組相比，陽性染色細(xì)胞占視野總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)在模型4周、6周和8周組逐漸顯著增加(P<0.05，表2)。

Fig. 3Expression of TGF-β1 protein in liver tissues detected(Immunohistochemistry ×400)

4N，6N，8N：Normal control at the 4th，6th，8thweek； 4M，6M，8M：Liver cirrhosis at the 4th，6th，8thweek

GroupTGF-α(%)TGF-β1(%) Control4thweek6thweek8thweekModel4thweek6thweek8thweek1.2±0.51.3±0.31.4±0.68.7±0.9*4.1±0.82.3±0.60.5±0.20.6±0.20.5±0.36.3±1.2*11.6±2.1*#15.11±2.3*#△

TGF-α：Tumor necrosis factor-α; TGF-β1: Transforming growth factor-β1

*P<0.05vscontrol at the same time；?#P<0.05vsmodel 4thweek；?△P<0.05vsmodel 6thweek

2.5相關(guān)性分析

大鼠血漿中內(nèi)毒素水平分別與血漿中TNF-α水平和Hcy水平呈正相關(guān)(P<0.01)；肝組織中TGF-α的表達(dá)與肝組織中TGF-β1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

3　討論

肝再生過程是一個復(fù)雜的被精確調(diào)控的過程，在這一過程中，TGF-α和TGF-β1相互協(xié)調(diào)，參與肝再生的啟動和終止。如果它們之間的平衡被破壞，作為肝細(xì)胞增殖分化過程中的有絲分裂原TGF-α過度減少，而作為肝纖維化形成過程中最強(qiáng)有力的細(xì)胞因子TGF-β1過度增加，就會導(dǎo)致肝細(xì)胞再生延遲或速度減慢，纖維組織過度增生，最終發(fā)生肝纖維化乃至肝硬化[5，6]。

復(fù)合致病因素利用CCl4慢性中毒，低膽堿、高膽固醇、高脂肪、高醇飲食等因素導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥-纖維化-硬化，與人類多種慢性肝病最終發(fā)展為肝硬化的各個階段相吻合，更接近臨床[4]。TGF-α是肝細(xì)胞增殖分化過程中必不可少的有絲分裂原，能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的分化、生長、再生[7]。TGF-β1是目前認(rèn)為作用最強(qiáng)的促肝纖維化形成的關(guān)鍵細(xì)胞因子[8]。本項研究顯示：與正常對照組相比，肝組織中TGF-α的表達(dá)只有在肝硬化模型4周組顯著增加，而TGF-β1的表達(dá)在模型4周、6周和8周組持續(xù)顯著增加，而且肝組織中TGF-α與TGF-β1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示可能由于TGF-β1生成增加，纖維組織過度增生，導(dǎo)致肝細(xì)胞局部微環(huán)境發(fā)生改變，通過某種機(jī)制使TGF-α生成減少，肝細(xì)胞再生過程受抑制。Nakamura等研究顯示，在二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)誘導(dǎo)肝損傷大鼠模型采用抗TGF-β分子干預(yù)治療后，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞再生水平提高肝細(xì)胞凋亡減少，同時肝臟內(nèi)TGF-α等生長因子的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[9]。

本項研究中肝硬化大鼠血漿中內(nèi)毒素、TNF-α和Hcy水平隨病程進(jìn)展逐漸顯著升高，血漿內(nèi)毒素水平分別與血漿TNF-α和Hcy水平呈正相關(guān)。提示內(nèi)毒素血癥可能通過釋放TNF-α以及高同型半胱氨酸血癥，進(jìn)一步加重肝損傷。另有研究報道內(nèi)毒素可加強(qiáng)TGF-β1抑制肝再生，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和促進(jìn)竇周纖維化的作用[10]。TNF-α既可以增加肝細(xì)胞對TGF-α的敏感性，使肝細(xì)胞迅速進(jìn)入增殖周期，還可以激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)產(chǎn)生TGF-β1[11]，TNF-α作為多效性的細(xì)胞因子，在肝細(xì)胞再生和纖維組織增生中的作用更為復(fù)雜。Hcy可引起短暫性的大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成，通過激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶以及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號通路，促進(jìn)TGF-β1等促纖維化的細(xì)胞因子表達(dá)[12]；Hcy還可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑上調(diào)TRB3的表達(dá)，引起肝細(xì)胞周期G1期停滯，從而抑制肝細(xì)胞增殖[13]。因此，在肝受損區(qū)域，由諸多因素構(gòu)成的微環(huán)境中，內(nèi)毒素血癥及其相伴產(chǎn)生的TNF-α水平增高，以及高同型半胱氨酸血癥可能通過影響TGF-α和TGF-β1之間的平衡，調(diào)控肝細(xì)胞再生和細(xì)胞外基質(zhì)成分的增生，參與肝纖維化、肝硬化的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，在肝硬化形成過程中，TGF-α的表達(dá)先增加后被抑制，TGF-β1的表達(dá)持續(xù)增加，導(dǎo)致肝細(xì)胞再生先增強(qiáng)后被抑制，纖維化程度不斷加重，最終發(fā)生肝硬化。大鼠肝臟TGF-α和TGF-β1的這一特征性動態(tài)變化可能與內(nèi)毒素血癥及其相伴產(chǎn)生的TNF-α水平增高，以及高同型半胱氨酸血癥有關(guān)，因此降低血漿內(nèi)毒素水平和維持Hcy在正常范圍內(nèi)，對于調(diào)控肝細(xì)胞再生和細(xì)胞外基質(zhì)增生的平衡具有重要意義。

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Dynamic changes of TGF-α and TGF-β1 in rats with liver cirrhosis induced by multiple pathogenic factors

TIAN Xiao-xia1, ZHANG Hui-ying1△, WANG Li-min2, LI Xu-jiong3, LIU Yan3, ZHANG Li-li1, BI Yang-hui

(1. Department of Pathophysiolog, 2. Funcitional Integrative Laboratory,3. Department of Physiology, Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China)

Objective: To explore the dynamic changes of transforming growth factor-α (TGF-α) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) of liver cirrhosis induced by multiple pathogenic factors in rats. Methods: Animals in the cirrhosis group were fed a mixture of maize flour, lard, cholesterol and alcohol plus subcutaneously injection with carbon tetrachloride (CCl4), the CCl4(0.5ml /100g·w) was injected at the first day of experiment and the 40% CCl4oil solution (0.3 ml /100 g·w) was injected at an interval of three days. The thirty-six male SD rats were randomly divided into liver cirrhosis group of the 4th, 6thand 8thweek, and normal control group of the 4th, 6thand 8thweek. The contents of alanine transferase (ALT), endotoxin, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and homocysteine (Hcy) in plasma were evaluated. Histopathological changes of the liver were observed under microscope with the staining of HE.The expressions of TGF-α and TGF-β1 were analyzed by the method of immunohistochemistry. Results: Compared with the corresponding normal control group, the levels of ALT, endotoxin, TNF-α and Hcy in plasma were gradually significantly increased in liver cirrhosis group of the 4th, 6thand 8thweek (P<0.05); the expression of TGF-α in the liver tissues was significantly increased at the 4thweek (P<0.05); the expression of TGF-β1 in the liver tissues was gradually significantly increased in every model group (P<0.05). Conclusion: In the formation process of cirrhosis, the expression of TGF-α was increased in liver of cirrhosis group at the 4th week, and later it was suppressed; the expression of TGF-β1 was continuously increased.The characteristic dynamic changes of TGF-α and TGF-β1 might be related to sustained endotoxemia, the high level of TNF-α and hyperhomocysteinemia.

liver cirrhosis；liver regeneration；liver fibrosis；TGF-α；TGF-β1;rats

國家自然科學(xué)基金資助項目(81070339)；山西省國際科技合作計劃資助項目(2010081068)；山西省回國留學(xué)人員科研基金資助項目(211-091)；山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目(2014308)

2015-04-28

2015-10-19

△Tel：13633555266； E-mail：zhanghy2001@163.com

R363

A

1000-6834(2016)01-065-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.017