田　真， 唐　碧， 蔡　鑫， 施　超， 王洪巨， 侯秀杰

(1. 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院超聲科, 山東 濟(jì)寧 272029； 2. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管科，3. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科， 安徽 蚌埠 233004； 4. 阜陽(yáng)市第一人民醫(yī)院心血管科, 安徽 阜陽(yáng)236000)

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缺氧對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞雙孔鉀通道TASK-1影響及非受體酪氨酸激酶的調(diào)節(jié)作用*

田真1， 唐碧2△， 蔡鑫2， 施超3， 王洪巨2， 侯秀杰4

(1. 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院超聲科, 山東 濟(jì)寧 272029； 2. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管科，3. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科， 安徽 蚌埠 233004； 4. 阜陽(yáng)市第一人民醫(yī)院心血管科, 安徽 阜陽(yáng)236000)

目的：探討缺氧對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)向整流酸敏感性雙孔鉀通道(TASK-1)的影響，及非受體酪氨酸激酶(c-Src)對(duì)該過(guò)程的調(diào)節(jié)作用。方法：培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(hPASMCs)：分為正常組、缺氧30 min組、缺氧6 h組、缺氧48 h組及缺氧48 h+PP2組、缺氧48 h+PP3組和缺氧48 h+bpV組，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，RT-PCR及Western blot方法測(cè)定不同組細(xì)胞TASK-1的mRNA及蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：①細(xì)胞周期顯示：與正常對(duì)照組相比，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，S期百分率增加；與缺氧48 h組相比，缺氧48 h+PP2組S期百分率下降；②急性缺氧6 h組TASK-1 mRNA表達(dá)增加，慢性缺氧組TASK-1 mRNA表達(dá)降低，急、慢性缺氧組TASK-1蛋白表達(dá)減少；c-Src抑制劑PP2可促進(jìn)TASK-1 mRNA及蛋白表達(dá)，酪氨酸磷酯酶抑制劑bpV抑制TASK-1蛋白表達(dá)。結(jié)論：缺氧促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，非受體酪氨酸激酶c-Src介導(dǎo)急、慢性缺氧對(duì)雙孔鉀通道TASK-1調(diào)控過(guò)程，可能與缺氧性人肺血管收縮存在一定的相關(guān)性。

人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；缺氧；雙孔鉀通道TASK-1；非受體酪氨酸激酶c-Src

肺源性心臟病的確切機(jī)制尚未闡明，多數(shù)認(rèn)為與肺動(dòng)脈收縮和重構(gòu)所致的肺血管阻力增加有關(guān)[1,2]。近年研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，鉀通道在缺氧性肺血管收縮中發(fā)揮重要作用，相應(yīng)的藥物干預(yù)也納入臨床研究。雙孔鉀通道(TWIK-related acid-sensitive K+; TWIK, for tandem P domains in a weak inwardly rectifying K+，TASK-1)作為一種新近發(fā)現(xiàn)的鉀通道，與缺氧性肺血管收縮發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，成為近年研究的熱點(diǎn)。c-Src是非受體蛋白酪氨酸激酶，近年研究發(fā)現(xiàn)[6,7]其在血管組織高表達(dá)，參與血管收縮、細(xì)胞增殖及缺氧應(yīng)答等生理和病理過(guò)程。Nagaraj C等[8]發(fā)現(xiàn)Src激酶在人肺血管鉀離子通道的功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，這可能是缺氧性肺動(dòng)脈高壓的一個(gè)新機(jī)制。但其在急、慢性缺氧時(shí)人肺動(dòng)脈收縮方面的機(jī)制及作用仍未完全闡明。為此，我們采用經(jīng)典缺氧細(xì)胞培養(yǎng)模型[9]，復(fù)制hPASMCs急、慢性缺氧過(guò)程，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖周期，RT-PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞TASK-1的表達(dá)變化，探討急、慢性缺氧對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞雙孔鉀通道TASK-1的影響，及非受體酪氨酸激酶c-Src對(duì)該過(guò)程的作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

RPBM 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)、胎牛血清(Hyclone公司)和生長(zhǎng)因子(Gibco公司)，胰酶(碧云天生物公司)，Trizol(天根生物公司)，逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒(Fermetas公司)，RIPA裂解液(強(qiáng))(碧云天生物公司)，多克隆羊抗TASK-1抗體(Santa Cruz公司)，兔抗山羊β-actin抗體(武漢博士德生物試劑有限公司)，酪氨酸激酶c-Src抑制劑PP2、PP2類(lèi)似物PP3和酪氨酸磷酯酶抑制劑bpV(德國(guó)merck公司)，血?dú)夥治鰞x(蚌醫(yī)一附院提供)，測(cè)氧儀(RSS-5100型，上海雷磁新涇儀器有限公司生產(chǎn))，無(wú)菌發(fā)酵罐專(zhuān)用空氣過(guò)濾器(sartorius Midisart 2000 17805)，凱基細(xì)胞周期試劑盒，MuseTM流式細(xì)胞分析儀等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)肺動(dòng)脈來(lái)源于安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科肺腫瘤患者切除的肺組織，患者既往無(wú)肺血管疾病或低氧血癥的病史(取用標(biāo)本均獲得病人知情同意，符合蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)規(guī)定)。利用肺動(dòng)脈平滑肌組織塊培養(yǎng)改良法原代培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，步驟如下：在解剖顯微鏡下無(wú)菌分離3～4級(jí)肺小動(dòng)脈(直徑<1 mm)，去除血管周?chē)慕Y(jié)締組織及外膜，沿長(zhǎng)軸剪開(kāi)，顯微鑷輕擦去除內(nèi)皮，再加入1 ml I型膠原酶的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，將肺動(dòng)脈剪成1 mm3左右的組織塊(加入I型膠原酶目的是使組織塊疏松，便于細(xì)胞爬出)，將組織塊種植在25 cm3培養(yǎng)瓶中，予以RPBM 1640培養(yǎng)基+20%胎牛血清+生長(zhǎng)因子，37℃普通CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)傳代，予以1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)，第3至第6代細(xì)胞用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞經(jīng)α-SMA抗平滑肌細(xì)胞抗體免疫組織化學(xué)染色鑒定。

1.2.2缺氧模型建立參照經(jīng)典缺氧模型[9]，自制可封閉的有機(jī)玻璃盒，由厚約8 mm的有機(jī)玻璃粘合而成，分底室和上蓋兩部分，上蓋設(shè)有通氣孔、出氣孔和測(cè)氧孔，將種有hPASMCs的六孔板放入盒內(nèi)，保持密閉，置于37℃恒溫水浴箱內(nèi)，盒內(nèi)通入5%CO2+95%N2的混合氣(氣體經(jīng)sartorius Midisart 2000 17805無(wú)菌發(fā)酵罐專(zhuān)用空氣過(guò)濾器過(guò)濾)，測(cè)氧儀、氧流量計(jì)調(diào)整通氣，使之保持在3%～4%的氧濃度，造模前后用血?dú)夥治鰴z測(cè)培養(yǎng)基內(nèi)PO2、PCO2和pH值。造模前后血?dú)夥治鰞x監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基,結(jié)果如下:常氧組pH(7.35±0.06)，PCO2(5.3±0.3) kPa，PO2(21.2±0.4) kPa；缺氧組pH(7.32±0.07)，PCO2(5.2±0.1) kPa，PO2(3.7±0.4)kPa。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組分為正常組、缺氧30 min組、缺氧6 h組和缺氧48 h組。此外，缺氧48 h組予以酪氨酸激酶c-Src抑制劑PP2、PP2類(lèi)似物PP3和酪氨酸磷酯酶抑制劑bpV孵育，記為缺氧48 h+PP2組、缺氧48 h+PP3組和缺氧48 h+bpV組。

1.2.4流式細(xì)胞分析儀記錄細(xì)胞周期依據(jù)凱基細(xì)胞周期試劑盒操作說(shuō)明，將不同組細(xì)胞予以處理，上機(jī)進(jìn)行分析，細(xì)胞周期結(jié)果由MuseTM細(xì)胞軟件分析。

1.2.5RT-PCR方法檢測(cè)TASK-1的mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)組分別收集約1×106個(gè)細(xì)胞，采用Trizol 一步法提取總RNA，隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的基因TASK-1上游引物：5’-CGGCAAGGTGTTCTGCATG -3’；下游引物：5’-CAAGGTGTTGATGCGCTCG-3’；擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度91 bp。內(nèi)參基因β-actin上游引物：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG -3’；下游引物：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度205 bp。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s變性，59.9℃ 30 s退火，72℃ 60 s延伸，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，樣本置20℃?zhèn)溆谩ASK-1及β-actin的PCR產(chǎn)物各5 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，GIS 凝膠處理系統(tǒng)拍攝記錄，圖像分析軟件對(duì)條帶光密度進(jìn)行掃描，以目的基因與內(nèi)參基因平均光密度比值(TASK-1/β-actin) 進(jìn)行半定量分析。

1.2.6Western blot方法檢測(cè)TASK-1的蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)組分別收集約1×106個(gè)細(xì)胞，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)樣品濃度以總蛋白50 μg 上樣，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，Western封閉液封閉1 h，分別孵育TASK-1、β-actin，一抗4℃過(guò)夜，次日TBST 洗膜3次，每次5 min，分別予以TASK-1、β-actin二抗，37℃室溫孵育1 h，TBST洗膜3 次，每次5 min，millipore顯影液進(jìn)行顯影。凝膠成像系統(tǒng)記錄條帶的光密度，得出TASK-1蛋白表達(dá)量的校正值(即TASK-1條帶與β-actin條帶的凈光密度之比)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1hPASMCs細(xì)胞培養(yǎng)及免疫組織化學(xué)鑒定

原代培養(yǎng)約3～4周可見(jiàn)到組織塊周?chē)鷋PASMCs呈峰谷樣成長(zhǎng)(圖1A)，細(xì)胞經(jīng)α-SMA免疫組化證實(shí)為平滑肌細(xì)胞，純度95%以上(圖1B)。

Fig. 1A: hPASMCs appeared the typical “hill and valley” (×40); B: Immunohistochemical staining for smooth muscle cell(Evision ×200)

2.2不同組hPASMCs細(xì)胞周期的變化

與正常組比較，缺氧30 min組hPASMCs的S期百分率增加(P<0.01)；與缺氧30 min組比較，缺氧6 h組hPASMCs的S期百分率增加(P<0.01)；與缺氧6 h組比較，缺氧48 h組hPASMCs的S期百分率增加(P<0.01)；與缺氧48 h組比較，缺氧48 h+PP2組hPASMCs的S期百分率下降(P<0.01，圖2、表1)。

2.3不同組hPASMCs中TASK-1基因表達(dá)的變化

與正常對(duì)照組比較，缺氧30 min組TASK-1 mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異，而急性缺氧6 h組TASK-1的基因表達(dá)增加(P<0.05)，慢性缺氧48 h組表達(dá)減少(P<0.01)；慢性缺氧48 h+PP2孵育組較48 h組表達(dá)增加(P<0.01，圖3，表2)。

2.4不同組hPASMCs的TASK-1蛋白表達(dá)的變化

與正常對(duì)照組比較，缺氧30 min組、急性缺氧6 h組及慢性缺氧48 h組TASK-1蛋白表達(dá)均明顯減少(P<0.01)；慢性缺氧48 h+PP2孵育組較48 h組表達(dá)增加(P<0.01)，慢性缺氧48 h+PP3孵育組較48 h組表達(dá)無(wú)顯著性差異，慢性缺氧48 h+bpV組孵育組較48 h組表達(dá)下降(P<0.01，圖4，表3)。

Fig. 2Effects of hypoxia on the hPASMCs cycle(n=5)

A: Con； B: Hypoxia 30 min； C: Hypoxia 6 h； D: Hypoxia 48 h； E: Hypoxia 48 h+PP2

GroupPercentageofcellsinSphases(%)Con10.2±0.4Hypoxia30min11.6±0.5**Hypoxia6h13.1±0.2##Hypoxia48h16.9±0.4△△Hypoxia48h+PP213.1±0.3▲▲

**P<0.01vsCon；?##P<0.01vsHypoxia 30 min；?△△P<0.01vsHypoxia 6 h；?▲▲P<0.01vshypoxia 48 h

Fig. 3Effects of hypoxia on the TASK-1 mRNA expression in human pulmonary artery smooth muscle cells(n=5)

1: Con； 2: Hypoxia 30 min； 3: Hypoxia 6 h； 4: Hypoxia 48 h； 5: Hypoxia 48 h+PP2； M: Marker

*P<0.05,?**P<0.01vsCon；?##P<0.01vsHypoxia 48 h

Fig. 4Effects of hypoxia on the TASK-1 protein expression of human pulmonary artery smooth muscle cells(n=5)

1: Con, 2: Hypoxia 30 min, 3: Hypoxia 6 h, 4: Hypoxia 48 h; 5: Hypoxia 48 h+PP2, 6: Hypoxia 48 h+PP3, 7: Hypoxia 48 h+bpV

GroupTASK-1/β-actinCon0.90±0.02Hypoxia30min0.75±0.01**Hypoxia6h0.65±0.01**Hypoxia48h0.49±0.023**Hypoxia48h+PP20.57±0.019##Hypoxia48h+PP30.50±0.014Hypoxia48h+bpV0.46±0.010##

**P<0.01vscon；?##P<0.01vshypoxia 48 h

3　討論

缺氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)是機(jī)體的一項(xiàng)重要代償反應(yīng)，通過(guò)局部肺泡缺氧時(shí)肺小阻力血管收縮實(shí)現(xiàn)通氣-血流重新分配,同時(shí)缺氧可作為信號(hào)啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和重塑。因此肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡失衡在肺血管重塑發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。新近研究發(fā)現(xiàn)[10]，鉀離子通道在平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。缺氧抑制一些鉀通道(如電壓門(mén)控鉀通道和TASK通道)[11.12]，使細(xì)胞膜去極化和鈣離子內(nèi)流，最終導(dǎo)致肺血管收縮[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[12]，鉀通道TASK-1在人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞高表達(dá)，急性缺氧后TASK-1電流減少，c-Src抑制劑PP2孵育后缺氧敏感性TASK-1電流消失，提示c-Src可能介導(dǎo)TASK-1參與缺氧性肺血管收縮[8]。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M經(jīng)典缺氧模型，對(duì)hPASMCs進(jìn)行急、慢性缺氧培養(yǎng)，考慮到急性缺氧膜片鉗研究時(shí)間一般為30 min，而洪志剛[5]等對(duì)急性缺氧時(shí)鼠Kv鉀通道研究為6 h，其表達(dá)結(jié)果存在爭(zhēng)議，本文將急性缺氧分為30 min和6 h組，慢性缺氧組設(shè)為48 h。借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組hPASMCs的細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，hPASMCs的S期百分率增加，處于DNA復(fù)制期細(xì)胞數(shù)增多，提示細(xì)胞增殖力逐漸增加，表明缺氧促進(jìn)hPASMCs的增殖。而孵育c-Src特異性抑制劑PP2抑制缺氧48 h組hPASMCs的S期百分率，處于DNA復(fù)制期細(xì)胞數(shù)減少，這些結(jié)果提示c-Src調(diào)節(jié)缺氧性人肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖過(guò)程。

本文通過(guò)RT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧不同階段人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上均有雙孔鉀通道TASK-1 mRNA的表達(dá)，缺氧30 min組較正常組TASK-1 mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異，缺氧6 h組較正常組TASK-1 mRNA表達(dá)增加，而缺氧48h組較正常組TASK-1 mRNA表達(dá)顯著減少?？梢酝茰y(cè)，短暫缺氧hPASMCs的基因調(diào)控機(jī)制尚未啟動(dòng)，而缺氧6 h組較正常組TASK-1鉀通道基因表達(dá)增加，與洪志剛等[5]對(duì)Kv鉀通道基因的研究相一致。據(jù)既往研究[14]，我們推測(cè)可能是由于短期調(diào)控內(nèi)存在某種轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，通過(guò)microRNA或是磷酸化修飾等過(guò)程調(diào)節(jié)，其具體機(jī)制仍有待我們進(jìn)一步研究。缺氧48 h組較正常組TASK-1 mRNA表達(dá)顯著下降，這表明慢性缺氧抑制TASK-1 mRNA表達(dá)。

采用Western blot技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)雙孔鉀通道TASK-1蛋白亦表達(dá)于缺氧不同時(shí)間段的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，缺氧30 min組較正常組TASK-1蛋白表達(dá)下降；缺氧6 h組較缺氧30 min組TASK-1蛋白表達(dá)下降；缺氧48 h組較缺氧6 h組TASK-1蛋白下降。這些結(jié)果表明缺氧抑制TASK-1蛋白的表達(dá)。

此外，本文發(fā)現(xiàn)，缺氧48 h組予以c-Src抑制劑PP2孵育后，TASK-1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加。缺氧48 h組予以酪氨酸磷酯酶抑制劑bpV孵育后，TASK-1蛋白表達(dá)下降；而無(wú)活性的PP2類(lèi)似物PP3對(duì)其無(wú)影響。這些結(jié)果表明酪氨酸激酶c-Src調(diào)節(jié)雙孔鉀通道TASK-1的表達(dá)，并且介導(dǎo)急、慢性缺氧性人肺血管收縮反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓患者PASMC中Src的磷酸化增加,Src激酶和血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)可共同作用抑制PASMC的有絲分裂和細(xì)胞遷移，抑制肺血管結(jié)構(gòu)重塑[15]。c-Src抑制劑PP2減少白細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)、凋亡性細(xì)胞死亡及血纖維蛋白沉積，有效逆轉(zhuǎn)再灌注后急性肺損傷[16]。Gomes等[17]發(fā)現(xiàn)PP2可導(dǎo)致Kv4.3電流減少，胞內(nèi)給予重組c-Src或bpV可增加該電流。另報(bào)道[18]，在HEK293細(xì)胞中，Src和Kv1.5的共同表達(dá)抑制Kv1.5電流。研究發(fā)現(xiàn)[19]c-Src抑制劑激活鼠冠狀動(dòng)脈細(xì)胞上Kca通道，酪氨酸磷酸酯酶抑制劑抑制Kca通道。Uzun等發(fā)現(xiàn)綿羊肺動(dòng)、靜脈血管環(huán)HPV過(guò)程與酪氨酸激酶功能密切相關(guān)[20]。此外Knock等發(fā)現(xiàn)[21]血管收縮劑所致鼠肺血管張力增加的過(guò)程是Src依賴(lài)性的，PP2抑制HPV，缺氧可以增強(qiáng)Src Tyr-416蛋白磷酸化，并且胞內(nèi)鈣離子濃度增加可被PP2或c-Src siRNA阻斷。Kirkegaard SS等在埃利希腹水瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TASK-2通道表達(dá)，其鉀離子外流受PP2調(diào)節(jié)，并與酪氨酸磷酸化過(guò)程相關(guān)[22]。近年一些研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸激酶可能作用于鉀通道。然而這些研究大多在細(xì)胞系或異源表達(dá)系統(tǒng)使用廣泛抑制劑，并沒(méi)有表明其對(duì)鉀通道產(chǎn)生的生理作用[22]。

前期研究[8]發(fā)現(xiàn)鉀通道TASK-1和c-Src在人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞共表達(dá)，c-Src抑制劑PP2抑制TASK-1電流，提示c-Src可能參與肺動(dòng)脈平滑細(xì)胞TASK-1的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在急、慢性缺氧時(shí)hPASMCs均有TASK-1表達(dá)，且慢性缺氧時(shí)予以PP2孵育后TASK-1表達(dá)顯著增加，bpV對(duì)TASK-1蛋白表達(dá)的作用與PP2相反，而無(wú)活性的PP2類(lèi)似物PP3對(duì)其蛋白表達(dá)無(wú)影響。細(xì)胞周期水平PP2抑制慢性缺氧后hPASMCs增殖。這些結(jié)果表明c-Src通過(guò)調(diào)控鉀通道TASK-1不僅在急性HPV，而且在慢性HPV中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

Knock等[6.21]在鼠肺動(dòng)脈發(fā)現(xiàn)PP2抑制HPV，缺氧通過(guò)磷酸化Src調(diào)節(jié)鉀通道的功能表達(dá)，與先前急性缺氧時(shí)在人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上的研究相一致[8]。這提示c-Src可能通過(guò)磷酸化TASK-1介導(dǎo)缺氧性人肺血管收縮反應(yīng)，對(duì)于其磷酸化位點(diǎn)的表達(dá)仍有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，雙孔鉀通道TASK-1在急、慢性缺氧性人肺血管平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)，酪氨酸激酶c-Src調(diào)節(jié)TASK-1的表達(dá)，可能與缺氧性人肺血管收縮有一定的相關(guān)性。但對(duì)于其相關(guān)信號(hào)通路我們并未完全闡明，其轉(zhuǎn)錄后修飾及磷酸化通路仍有待進(jìn)一步研究。

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The effect of hypoxia on pulmonary artery smooth muscle cells two pore domain potassium channels TASK-1 and the regulation of non-receptor tyrosine kinases

TIAN Zhen1, TANG Bi2△, CAI Xin2, SHI Chao3, WANG Hong-ju2, HOU Xiu-jie4

(1. Department of Ultrasound, The Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272029； 2. Department of Cardiovascular Medicine, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 3. Department of Thoracic Surgery, Bengbu 233004;4. Department of Cardiovascular Medicine, The First People's Hospital of Fuyang, Fuyang 236000, China)

Objective: To investigate the effect of hypoxia on the human pulmonary artery smooth muscle cells two pore domain potassium channels TASK-1 and the regulation of non-receptor tyrosine kinase c-Src in this process. Methods: The cultured human pulmonary artery smooth muscle cells(hPASMCs) were divided into: normal group, hypoxia 30 minute group, hypoxia 6 hours group and hypoxia 48 hour group,and hypoxia 48 hour+PP2 group, hypoxia 48 hour+PP3 group, hypoxia 48 hour+bpV group. Flow cytometry was used to analyze the cell cycle, RT-PCR and Western blot technique were carried out to detect the expression changes of TASK-1 mRNA and protein in different groups. Results: ①Cell Cycle Show: Compared with normal control group, with prolonged hypoxia, the percentages of hPASMCs in S phases of cell cycle were increased. While compared with hypoxia 48 hour group, the percentages of hypoxia 48 hour+PP2 group hPASMCs in S phases of cell cycle were decreased.②The expression of TASK-1 mRNA on hPASMCs in acute hypoxia 6 hour group was increased, while the expression of TASK-1 protein on hPASMCs in the acute and chronic hypoxia group was decreased, and the expression of TASK-1 mRNA on hPASMCs in the chronic hypoxia group was decreased;After pre-incubation of a potent and selective inhibitor of the Src family of protein tyrosine kinases PP2, the expression of TASK-1 mRNA and protein in hypoxia 48 hour group was increased, however after pre-incubation of the inhibitor of the Src family of protein tyrosine phosphatase bpV, the expression of TASK-1 protein in hypoxia 48 hour group was decreased. Conclusion: Hypoxia promotes human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation, and non-receptor tyrosine kinase c-Src may participate in the expression of two pore domain potassium channels TASK-1 regulated by hypoxia. Therefore, we hypothesized that TASK-1 channels and c-Src participatein the acute and chronic hypoxic human pulmonary vasoconstriction.

human pulmonary artery smooth muscle cells;hypoxia;two pore domain potassium channels TASK-1;non-receptor tyrosine kinase c-Src

國(guó)家自然科學(xué)基金(81170046)；教育部“留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金”(第46批)

2015-04-30

2015-10-21

△Tel：15855798487； E-mail: bitang2000@163.com

R543.2

A

1000-6834(2016)01-026-06

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.07