張　峰， 沈　禮， 梁國(guó)慶， 孫　霞△

(1. 杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系， 2. 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 浙江杭州310012)

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Calbindin和Parvalbumin在C57BL/6J kit基因突變小鼠聽覺傳導(dǎo)通路中的表達(dá)*

張峰1， 沈禮1， 梁國(guó)慶2， 孫霞1△

(1. 杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系， 2. 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 浙江杭州310012)

目的：觀察鈣結(jié)合蛋白(CB)和小清蛋白(PV)在C57BL/ 6J野生型小鼠與kit基因突變型小鼠(kit+/kitW-2Bao)聽覺傳導(dǎo)通路上的表達(dá)。方法：取kit突變型小鼠和野生型小鼠各6只，水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌流固定，取大腦進(jìn)行冠狀位冰凍切片。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，觀察CB和PV兩種蛋白在小鼠聽覺傳導(dǎo)通路上的表達(dá)差異。結(jié)果：PV在野生型小鼠的腹側(cè)耳蝸前核(AVCN)、腹側(cè)耳蝸后核(PVCN)、下丘(IC)以及聽皮層(AC)均有明顯表達(dá)。CB在野生型小鼠的PVCN和斜方體核(Tz)有明顯表達(dá)，在AC僅在2～3層有極少量表達(dá)。kit基因突變引起PV在PVCN、IC和AC的表達(dá)減少(P<0.01)，而Tz的表達(dá)增加(P<0.01)。CB在基因突變小鼠PVCN表達(dá)消失，AC的表達(dá)增加(P<0.01)。結(jié)論：PV和CB在野生型和突變型小鼠的聽覺傳導(dǎo)通路的表達(dá)存在明顯差異。kit基因突變可引起PVCN、IC、Tz和皮層的PV表達(dá)變化，PVCN、AC的CB表達(dá)變化，表明kit基因突變對(duì)聽覺通路高級(jí)中樞功能活動(dòng)有一定的影響。

小鼠；kit基因；Calbindin；Parvalbumin

kit是一個(gè)與發(fā)育相關(guān)的基因，其編碼的蛋白質(zhì)是位于細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶受體，功能十分復(fù)雜，控制著黑色素細(xì)胞、血細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞、聽毛細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及小腸Cajal細(xì)胞等的發(fā)育[1]。研究資料表明，kit 基因突變可以影響內(nèi)耳血管紋中黑色素細(xì)胞的功能，導(dǎo)致內(nèi)淋巴電位消失，進(jìn)而影響聽毛細(xì)胞的感音功能[2,3]。但對(duì)于kit基因突變是否也能夠影響高級(jí)聽覺中樞的功能，目前尚未見報(bào)道。

鈣結(jié)合蛋白(Calbindin, CB)和小清蛋白(Parvalbumin, PV)是細(xì)胞內(nèi)對(duì)鈣離子具有高度選擇性結(jié)合位點(diǎn)的鈣結(jié)合蛋白。CB和PV廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，主要參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)、緩沖有重要作用[4]。在哺乳類動(dòng)物的腦里，CB和PV表達(dá)在具有互補(bǔ)功能的不同腦區(qū)，提示其表達(dá)和鈣依賴的調(diào)節(jié)活動(dòng)有關(guān)[5]。如在聽覺系統(tǒng)中，研究發(fā)現(xiàn)CB和PV是互補(bǔ)表達(dá)在丘腦的不同區(qū)域。PV 主要分布在丘系即內(nèi)側(cè)膝狀體的腹側(cè)部，CB 則主要分布在非丘系即內(nèi)側(cè)膝狀體背側(cè)部和內(nèi)側(cè)部[5]?？紤]到CB 和PV在聽覺系統(tǒng)的不同表達(dá)以及其所代表的功能差異，本實(shí)驗(yàn)擬采用kit基因W-2Bao突變系小鼠[6,7]，通過免疫組化方法觀察kit基因突變小鼠聽覺傳導(dǎo)通路中CB和PV兩種蛋白表達(dá)上的變化來研究此影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

C57BL/6J(B6)成年野生型小鼠，kit基因突變型成年小鼠(kit+/kitW-2Bao)，由杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重20～30 g，雌雄不拘。Calbindin(小鼠單克隆抗體ab82812)，Parvalbumin(兔多克隆抗體ab11427),購(gòu)自Abcam公司。相應(yīng)二抗試劑和DAB染色試劑盒均購(gòu)自博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2免疫組織化學(xué)染色

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用0.9%的生理鹽水經(jīng)心臟灌流排血，后用4℃ 4%的多聚甲醛灌流固定，灌流結(jié)束后將大腦從顱骨中取出。將取出的大腦浸泡在4%的多聚甲醛溶液中后固定4 h。隨后浸泡在30%蔗糖溶液中1～2 d，直至腦組織沉在溶液中。將浸糖后的腦組織修塊后，用冰凍切片機(jī)做冠狀位切片，切片厚度為40 μm，每只小鼠取三套切片，一套染CB，一套染PV，一套留下備用。

將切片用PBS液清洗三次，每次5 min。以1∶200稀釋度孵育CB，1∶2 000的稀釋度孵育PV，室溫下過夜。隨后，PBS液清洗三次，每次5 min。CB組加生物素化羊抗兔IgG， PV組加抗鼠IgG，室溫下震蕩孵育2 h。2 h后用PBS液清洗三次，每次5 min。用DAB試劑盒進(jìn)行染色，將切片按順序貼在賴氨酸處理過的載玻片上。待切片干燥后脫水脫脂封片[8]。

1.3結(jié)果判斷

細(xì)胞質(zhì)中有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞,每只小鼠相應(yīng)核團(tuán)隨機(jī)取3張切片,在10倍目鏡下計(jì)數(shù)核團(tuán)內(nèi)一個(gè)視野的CB和PV免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元的數(shù)量，取其平均數(shù)[9]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1PV與CB在野生型小鼠和kit基因突變小鼠耳蝸核(cochlear nucleus, CN)中的表達(dá)PV在野生型小鼠的腹側(cè)耳蝸前核(ventral cochlear nucleus, anterior part, AVCN)和腹側(cè)耳蝸后核(ventral cochlear nucleus, posterior part, PVCN)均有表達(dá)，而在kit基因突變小鼠，在AVCN依然有PV表達(dá)，而在PVCN，表達(dá)明顯減少，只在頂部有少量表達(dá)(P<0.01)。CB在野生型小鼠的PVCN陽性表達(dá)為72.5±19.71，AVCN幾乎不表達(dá)或僅有極少量的表達(dá)。在kit基因突變小鼠，CB在PVCN細(xì)胞的陽性表達(dá)幾乎消失(P<0.01)，在AVCN仍舊無表達(dá)(圖1，表1)。

Fig. 1Expression of CB and PV in the CN of wild type and kit gene mutant mice(Scale bar=100 μm)

A: Expression of PV in wild type mice； B: Expression of PV in kit gene mutant mice； C: Expression of CB in wild type mice； D: Expression of CB in kit gene mutant mice； AVCN: Ventral cochlear nucleus, anterior part; PVCN: Ventral cochlear nucleus, posterior part

GroupCBPVAVCNPVCNAVCNPVCNWildtype2.34±2.4872.5±19.71148.3±40.3136±31.81Kitgenemutated4.21±2.812.66±2.5**151.8±35.4326.5±8.87**

CB: Calbindin; PV: Parvalbumin; AVCN: Ventral cochlear nucleus, anterior part; PVCN: Ventral cochlear nucleus, posterior part

**P<0.01vswild type mice

2.2野生型小鼠和kit基因突變小鼠下丘IC中，PV與CB的表達(dá)

在野生型小鼠的IC區(qū)域，PV有明顯的表達(dá)，在kit基因突變小鼠， PV陽性細(xì)胞在IC的表達(dá)，出現(xiàn)明顯減少的結(jié)果(P<0.01)。在野生型小鼠和kit基因突變小鼠的IC均檢測(cè)不到CB陽性細(xì)胞(圖2，表2)。

Fig. 2Expression of CB and PV in the IC of wild type and kit gene mutant mice(Scale bar = 100 μm)

A: Expression of PV in wild type mice; B: Expression of PV in kit gene mutant mice; C: Expression of CB in wild type mice; D: Expression of CB in kit gene mutated mice; CB: Calbindin; PV: Parvalbumin; IC: Inferior colliculus

2.3CB與PV在野生型和kit基因突變小鼠Tz的表達(dá)

PV在野生型小鼠Tz表達(dá)為6.67±4.68，而kit基因突變小鼠的表達(dá)明顯增加(P<0.01)。CB在野生型和kit基因突變小鼠的Tz表達(dá)沒有變化 (圖3，表2)。

Fig. 3Expression of CB and PV in the Tz of wild type and kit gene mutant mice(Scale bar = 100 μm)

A: Expression of PV in wild type mice; B: Expression of PV in kit gene mutant mice; C: Expression of CB in wild type mice; D: Expression of CB in kit gene mutant mice; Tz: Trapezoid body; CB: Calbindin; PV: Parvalbumin

2.4CB與PV在野生型小鼠和kit基因突變小鼠皮層中的表達(dá)

在野生型小鼠，PV 主要表達(dá)在聽覺皮層的3～6層，在2層僅有少量的PV陽性細(xì)胞。在kit基因突變小鼠，PV在聽皮層的表達(dá)和野生型小鼠相比明顯減少(P<0.01)且主要集中在3～4層。 CB在野生型小鼠聽皮層的表達(dá)主要分布在2～3層。kit基因突變引起CB在皮層的陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量增加，且增加的陽性細(xì)胞分布的區(qū)域主要在3～5層(P<0.01,圖4，表2)。

Fig. 4Expression of CB and PV in the auditory cortex of wild type and kit gene mutant mice(Scale bar=100 μm)

A: Expression of PV in wild type mice; B: Expression of PV in kit gene mutant mice; C: Expression of CB in wild type mice; D: Expression of CB in kit gene mutant mice; Au: Auditory cortex; CB: Calbindin; PV: Parvalbumin

3　討論

kit是一種原癌基因，其編碼的蛋白質(zhì)是位于細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶受體，其配體是干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(stem cell factor，SCF)。kit蛋白功能的突變會(huì)導(dǎo)致各種不同種類、不同程度的發(fā)育異常。在人類及小鼠，kit基因突變可以影響紅細(xì)胞、生殖細(xì)胞及內(nèi)耳的正常發(fā)育,并導(dǎo)致遺傳性的“花斑馬”白化病[1,2]。本研究所用突變小鼠kit+/kitW-2Bao的突變位點(diǎn)位于kit基因ORF第1229位，由G轉(zhuǎn)換成T，此變化導(dǎo)致kit蛋白第410位的氨基酸由V→F，引起突變局部由β折疊轉(zhuǎn)變成α卷曲。從kit蛋白的結(jié)構(gòu)來看,位于膜外第5個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)此類突變可以影響內(nèi)耳的發(fā)育，從而影響聽覺功能[6,7,10]。

Ca2+是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，參與神經(jīng)細(xì)胞的多種功能活動(dòng)，其功能的發(fā)揮需要鈣結(jié)合蛋白CB和PV的共同參與。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，PV主要表達(dá)在氨基丁酸能中間神經(jīng)元中，在大腦皮層主要是枝形吊燈狀和藍(lán)狀細(xì)胞[11]。已有的研究結(jié)果表明，在大鼠、小鼠、兔子、貓和猴子的聽覺傳導(dǎo)通路，CB和PV有不同的表達(dá)模式，PV主要在聽覺的“核心”系統(tǒng)表達(dá)而CB在周圍表達(dá)[5,12]。在本研究中，野生型小鼠PV和CB的表達(dá)也具備同樣的模式。在野生型小鼠聽覺傳導(dǎo)通路中，PV在耳蝸核的AVCN、PVCN均有明顯表達(dá)，在下丘IC有表達(dá)，在聽覺皮層，PV在聽皮層的表達(dá)主要在3～6層。CB僅僅在耳蝸核PVCN的頂端和腹側(cè)有少量表達(dá)。CB在皮層的表達(dá)較PV少，且主要分布在皮層的2～3層。

Tab.

Cort: Cortex; IC: Inferior colliculus; Tz: Trapezoid body; CB: Calbindin; PV: Parvalbumin

**P<0.01vswild type mic

研究資料表明，kit 基因突變可以影響內(nèi)耳血管紋中黑色素細(xì)胞的功能，導(dǎo)致內(nèi)淋巴電位消失，進(jìn)而影響聽毛細(xì)胞的感音功能[2,3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，kit基因突變可以減少PV和CB在PVCN的表達(dá)，減少PV在IC的表達(dá)，但可增加PV在Tz的表達(dá)。與PV在CN的表達(dá)相比，CB在野生型小鼠的PVCN有少量表達(dá)，kit基因突變也可減少CB在PVCN的表達(dá)。表明在腦干水平kit基因突變可引起PV和CB的表達(dá)變化。

研究已知，來自內(nèi)側(cè)膝狀體腹側(cè)核(ventral part of medial geniculate body, MGv)的投射纖維終止在聽皮層的3/4層，聽皮層的第5和6層細(xì)胞發(fā)出下行投射分別到IC和MGv。在小鼠的聽覺皮層大多數(shù)PV表達(dá)陽性的細(xì)胞屬于抑制性的中間神經(jīng)元,但也有少量的錐體細(xì)胞表達(dá)。PV在皮層和內(nèi)側(cè)膝狀體的陽性表達(dá)區(qū)域也反應(yīng)了其在結(jié)構(gòu)上的一致性，即主要和皮層下的聽覺結(jié)構(gòu)相關(guān)。CB表達(dá)陽性的細(xì)胞主要在2、3層，主要是皮層內(nèi)的相互投射以及投射到對(duì)側(cè)的皮層[13]。研究發(fā)現(xiàn)在皮層發(fā)育的晚期，PV陽性和CB陽性的神經(jīng)元分布依然會(huì)發(fā)生改變，提示神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成與后期經(jīng)驗(yàn)依賴的可塑性發(fā)展有關(guān)[13]。本實(shí)驗(yàn)中kit基因突變引起的PV和CB表達(dá)的改變，表明kit基因突變對(duì)聽覺通路高級(jí)中樞的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PV和CB在kit基因突變小鼠中的表達(dá)模式，有助于了解kit基因在聽覺通路的作用機(jī)制。本文提出kit基因可能影響聽覺中樞的功能，有助于對(duì)相關(guān)疾病機(jī)制的了解。

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The expression of Calbindin and Parvalbumin in auditory pathway of kit gene mutated C57BL/6J mouse

ZHANG Feng1, SHEN Li1, LIANG Guo-qing2, SUN Xia1△

(1. Hangzhou Normal University School of Medicine， 2. College of Life and Environmental Sciences,Hangzhou Normal University, Hangzhou 310012, China)

Objective: To observe the expressions of Calbindin(CB) and Parvalbumin(PV), the two calcium-binding protein, in auditory pathway in mice of wild type C57BL/ 6J and kit+/kitW-2Bao, a kit gene mutant. Methods: Six mutated kit gene kit+/kitW-2Bao mice and 6 wild type C57BL/6J (B6)mice were anaesthetized i.p. with chloral hydrate. After the mice were fixed by heart perfusion, the brains were removed and coronal sections were cut with a freezing microtome. Results: We found that wild type mice had significant expressions of PV on ventral cochlear nucleus, anterior part (AVCN), ventral cochlear nucleus, posterior part (PVCN), inferior colliculus (IC) and auditory cortex (AC). CB was expressed in wild type mice on PVCN and nucleus of the trapezoid body (Tz). The mutant of kit gene induced the less expression of PV on PVCN, IC and AC (P<0.01)，but increased the expression of Tz (P<0.01). CB could not be observed on PVCN in mutant mice, and the expression of AC was increased(P<0.01). Conclusion: CB and PV has differential expression level in auditory pathway. Since mutated kit gene can affect expression of PV on PVCN, IC, Tz and AC, as well as CB on PVCN and AC, it suggests that the mutation of kit gene can affect the advanced function of central nervous system in auditory pathway.

mouse；kit gene；Calbindin；Parvalbumin

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171060)；杭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(20100333T07)

2015-02-25

2015-10-16

△Tel：13094813900； E-mail：sunxiasun@gmail.com

Q189

A

1000-6834(2016)01-022-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.006