蘇利強(qiáng)　曾志強(qiáng)　鄒業(yè)兵

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【實(shí)驗(yàn)研究】

金櫻子對疲勞大鼠免疫細(xì)胞共刺激信號通路及免疫平衡作用的研究*

蘇利強(qiáng)1曾志強(qiáng)2鄒業(yè)兵1

共刺激分子是認(rèn)識(shí)和治療免疫性疾病的有效靶點(diǎn)。中醫(yī)理論證明金櫻子可以補(bǔ)血易精，減輕或緩解疲勞，本研究運(yùn)用中醫(yī)、中藥理論探討金櫻子在預(yù)防疲勞方面的作用，金櫻子以調(diào)節(jié)機(jī)體功能為主而非對抗，這種調(diào)節(jié)效應(yīng)具有雙向性和整體性。本研究以疲勞大鼠為模型，金櫻子作為干預(yù)手段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金櫻子可以矯正過度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的免疫失衡，通過提高INF-γ的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞免疫功能提高，這一過程可能與金櫻子上調(diào)B7-1的表達(dá)有關(guān)。

疲勞；免疫失衡；金櫻子；共刺激信號通路

共刺激分子是認(rèn)識(shí)和治療免疫性疾病的有效靶點(diǎn)。中醫(yī)理論證明金櫻子可以補(bǔ)血易精，減輕或緩解疲勞，本研究運(yùn)用中醫(yī)、中藥理論探討金櫻子在預(yù)防疲勞方面的作用，由于金櫻子所含成分決定了它作用于機(jī)體有多靶點(diǎn)效應(yīng)，另外，金櫻子以調(diào)節(jié)機(jī)體功能為主而非對抗，這種調(diào)節(jié)效應(yīng)具有雙向性和整體性。結(jié)合共刺激分子B7-1和 B7-2的特點(diǎn)，開展以共刺激分子為新靶點(diǎn)來調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)疲勞后免疫機(jī)能的作用機(jī)理研究。

1　研究對象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對象與分組情況實(shí)驗(yàn)對象：健康SD雄性大鼠30只，清潔級，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨即將動(dòng)物分成正常對照組(A組，10只)，運(yùn)動(dòng)組(B組，10只)，運(yùn)動(dòng)+金櫻子干預(yù)組(C組，10只)。

1.2模型建立大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，運(yùn)動(dòng)組大鼠先進(jìn)行3天適應(yīng)性游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(15min/1次/天)。待大鼠適應(yīng)新環(huán)境和游泳狀態(tài)后通過游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練建立運(yùn)動(dòng)疲勞導(dǎo)致免疫失衡模型，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷如下：B組和C組大鼠采用不負(fù)重持續(xù)游泳，第1～15天一次力竭，第16～20天二次力竭，C組在正常游泳的同時(shí)采用金櫻子灌胃。大鼠力竭的標(biāo)準(zhǔn)見表1。當(dāng)三個(gè)狀態(tài)出現(xiàn)時(shí)即定為力竭。

表1　大鼠力竭標(biāo)準(zhǔn)

并游泳訓(xùn)練期間對大鼠體質(zhì)量、運(yùn)動(dòng)能力及活動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行詳細(xì)觀察并記錄。

給藥方法：動(dòng)物給藥從第1天開始。C組用金櫻子水提取液灌服；金櫻子水提取液(含生藥量2.5 g/m1)。每只大鼠按5 g/d金櫻子提取液每天灌胃1次。B組每日用生理鹽水灌服至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3樣本采集與處理每組按照運(yùn)動(dòng)方案游泳結(jié)束后分別在8h后取材，頸部脫臼處死，股動(dòng)脈取血5ml，分離血清低溫保存待測。

1.4指標(biāo)測試外周血共刺激因子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)的表達(dá)狀況；通過IL-4、IFN-γ表達(dá)來推斷Th1/Th2平衡狀況。

采用ELISA法測定血清IL-4、IFN-γ、B7-1、B7-2含量。測試過程中在酶標(biāo)儀上讀出OD值，所有讀出的OD值減除零孔值后再行計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值使用CurveExpert1.3軟件繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品含量。

1.5統(tǒng)計(jì)分析討論統(tǒng)計(jì)分析所得數(shù)據(jù)，探討不同運(yùn)動(dòng)方式導(dǎo)致的疲勞后免疫機(jī)能的變化狀況，分析金櫻子干預(yù)對不同運(yùn)動(dòng)方式的疲勞后免疫機(jī)能下降和共刺激因子B7-1、B7-2的表達(dá)的關(guān)系，從而探討金櫻子對不同運(yùn)動(dòng)方式疲勞后免疫機(jī)能的作用可能是與共刺激因子B7-1、B7-2的表達(dá)有關(guān)。

1.6主要試劑與儀器試劑：大鼠IL-4酶聯(lián)免疫分析試劑盒48T、大鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫分析試劑盒48T、大鼠B7-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒48T、大鼠B7-2酶聯(lián)免疫分析試劑盒48T等。

儀器：離心機(jī)、酶標(biāo)儀(480nm波長)、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、大鼠游泳池等。

2　結(jié)果

B、C組血清IFN-γ水平顯著低于A組，而C組顯著高于B組；C組IL-4水平非常顯著低于A、B組；B組IFN-γ/ IL-4顯著低于A組，而C組非常顯著地高于B組。C組B7-1顯著高于B組。見表2。

表2　各組相應(yīng)指標(biāo)變化情況表

注：1)表示與A組比較P<0.05，2)表示與A比較P<0.01；3)表示與B組比較P<0.05，4)表示與B組比較P<0.01。

3　討論

運(yùn)動(dòng)性疲勞是指在運(yùn)動(dòng)過程中發(fā)生的一種疲勞癥候，與內(nèi)傷虛勞的發(fā)生密切相關(guān)。下圖為運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生發(fā)展與金櫻子改善免疫，調(diào)節(jié)疲勞的關(guān)系圖，可以作為用金櫻子治療疲勞的依據(jù)。另有研究證明金櫻子果實(shí)可做利尿劑、鎮(zhèn)咳劑，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明金櫻子能提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，既有提高細(xì)胞免疫活性，又可以提高體液免疫功能，并具有一定的抗炎作用。因此，金櫻子是一種能改善機(jī)體免疫能力的免疫調(diào)節(jié)劑。

圖1　金櫻子改善運(yùn)動(dòng)性疲勞提高免疫關(guān)系圖

3.1運(yùn)動(dòng)與Thl/Th2的失衡本研究顯示，10天游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可使血清IFN-γ含量顯著低于空白組，血清IL-4含量顯著低于空白對照組，但I(xiàn)FN-γ/IL-4則低于空白對照組，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因推測是10天的游泳運(yùn)動(dòng)負(fù)荷對大鼠機(jī)體產(chǎn)生良好的適應(yīng)，血清IFN-γ、IL-4含量低于空白對照組，此時(shí)的免疫機(jī)能處于積極的狀態(tài)，說明10天游泳運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞之間的穩(wěn)態(tài)失去平衡，使細(xì)胞免疫機(jī)能(IFN-γ主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫)顯著下降，而體液免疫(IL-4主要介導(dǎo)體液免疫)相對亢進(jìn)，這是Th1/Th2向Th2方向漂移的原因，提示過量運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞亞群之間穩(wěn)態(tài)失衡，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致Th1/Th2向Th2方向漂移，使體液免疫相對占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能受到抑制，這一結(jié)果與大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對免疫機(jī)能的影響研究結(jié)果一致。

3.2B7-1和B7-2與運(yùn)動(dòng)免疫在免疫細(xì)胞活化過程中，Th0(未致敏的天然T細(xì)胞)通過TCR(T細(xì)胞受體)識(shí)別MHC(組織相容性抗原)抗原肽獲得抗原識(shí)別第一信號，這一過程是免疫細(xì)胞活化的第一步，當(dāng)細(xì)胞MHC識(shí)別第一信號后，還需要有共刺激分子提供的協(xié)調(diào)刺激信號第二信號，T細(xì)胞才能被激活。在此過程中共刺激分子B7家族是最重要的第二信號，它們在維持免疫效力和抑制自身免疫之間的微妙平衡是至關(guān)重要的作用。其中最重要的共刺激分子是B7家族成員的B7—1(文獻(xiàn)也成為：CD80)和B7—2(文獻(xiàn)也成為：CD86)。

B7-1和B7-2是表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞(APC)表面的共刺激配體，兩者均可與T細(xì)胞共刺激受體CD28和細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)結(jié)合，激活和調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫。

B7-1可促進(jìn)Th0分化趨向Thl，而B7-2可促進(jìn)Th0分化趨向Th2。B7-1和B7-2是通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上的CD28和CTLA-4相結(jié)合，對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用，控制免疫反應(yīng)或耐受。Thl細(xì)胞優(yōu)勢分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，輔助TC、TD細(xì)胞增殖、分化、成熟，介導(dǎo)細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-10、IL-5、IL-6、IL-13和TGF-B，輔助B細(xì)胞增殖、分化、成熟，介導(dǎo)體液免疫。Thl/Th2是一對重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞，通過各自的細(xì)胞因子互為調(diào)節(jié)和抑制。

可見共刺激分子在淋巴細(xì)胞活化的重要作用，免疫學(xué)研究證實(shí)，人體內(nèi)的Th0細(xì)胞在抗原遞呈細(xì)胞共刺激分子B7-1、B7-2的刺激下可分別向Th1、Th2轉(zhuǎn)化。B7-1主要刺激Th0細(xì)胞向Th1分化，而B7-2主要協(xié)同刺激Th0細(xì)胞向Th2分化。由于運(yùn)動(dòng)后免疫機(jī)能下降和Thl/Th2發(fā)生偏移有關(guān)，因此可以認(rèn)為B7-1和 B7-2的表達(dá)對運(yùn)動(dòng)后免疫機(jī)能的作用較大。

在正常情況下，這兩類細(xì)胞因子處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。Thl/Th2的優(yōu)勢變化直接影響機(jī)體的免疫狀態(tài)，且與疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。目前，已有大量證據(jù)論證了B7-1和B7-2共刺激因子控制體液免疫和細(xì)胞免疫的重要性。

3.3金櫻子與免疫平衡金櫻子作為藥用，歷史久遠(yuǎn)，古今中外文獻(xiàn)具有記載，其功效、成分見表3。

表3　金櫻子功效

過量運(yùn)動(dòng)后機(jī)體疲勞會(huì)產(chǎn)生免疫機(jī)能下降，從中醫(yī)角度論述臟腑功能下降或失調(diào)和津血不足，表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞亞群失衡，Thl/Th2發(fā)生偏移，細(xì)胞增殖能力下降，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為這些失衡受T細(xì)胞活化信號的調(diào)控，而T細(xì)胞的活化除了需要特異性刺激信號Ag-MHC復(fù)合物外，還需要共刺激分子(如B7-1等)的存在，若缺乏共刺激分子，T細(xì)胞將進(jìn)入無反應(yīng)狀態(tài)。

本研究結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)組B7-1較對照組呈現(xiàn)下降趨勢，而經(jīng)過運(yùn)動(dòng)+金櫻子干預(yù)的C組的B7-1顯著高于運(yùn)動(dòng)組，顯示金櫻子可以促進(jìn)B7-1 表達(dá)，從而可以改善由于運(yùn)動(dòng)造成的B7-1 下降，這一趨勢和INF-γ的表達(dá)趨勢比較接近，因此推斷金櫻子可以上調(diào)B7-1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞免疫的發(fā)展。

4　結(jié)論

大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致Thl/Th2向Th2方向漂移，通過金櫻子干預(yù)可以提高INF-γ的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞免疫功能提高，這一過程可能與金櫻子上調(diào)B7-1的表達(dá)有關(guān)。

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2012年江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃基金項(xiàng)目(2012A056)

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)體育教學(xué)部(南昌 330004)；2.江西師范大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院(南昌 330026)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.16.019

1003-8914(2016)-16-2340-03

(本文校對：趙廣高2016-01-07)