鄭玲芝

miR-498在人卵巢癌組織中的表達及對人卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響

鄭玲芝

目的研究微小RNA-498（miR-498）在人卵巢癌組織中的表達及對人卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響，探討其在人卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用和意義。方法應用實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）方法檢測miR-498在人卵巢癌以及癌旁組織中的表達；對人卵巢癌細胞株（SKOV3、OVCAR3）轉(zhuǎn)染miR-498 mimics（模擬物）后，采用噻唑藍（MTT）法觀察人卵巢癌細胞的體外增殖活性，采用流式細胞儀法檢測細胞凋亡的變化。結(jié)果RT-qPCR結(jié)果顯示miR-498在人卵巢癌組織中表達顯著低于癌旁組織（＜0.05），細胞體外增殖實驗和凋亡實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-498 mimics后，SKOV3細胞增殖能力下降、凋亡增加（均＜0.05）；OVCAR3細胞也出現(xiàn)增殖能力下降、凋亡增加（均＜0.05）。結(jié)論miR-498與人卵巢癌細胞的增殖、凋亡有關，在人卵巢癌組織中表達下降，可能參與了人卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。

卵巢腫瘤；癌；微小RNA-498；增殖；凋亡

微小RNA（miRNAs）是一種小的非編碼RNA，長度20～22個核苷酸，作為一種新的基因表達調(diào)節(jié)物，它能通過與目的 mRNA結(jié)合，從而引起目的mRNA的降解或者抑制目的mRNA的翻譯［1］。miRNAs在體內(nèi)參與多種生物過程的信號通路調(diào)控，如細胞增殖、凋亡、應激及脂肪代謝，在腫瘤發(fā)生發(fā)展上起著重要作用［2］，是目前生命科學領域研究的熱點之一。已有研究證實，miR-498的異常表達與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關，如非小細胞肺癌［3］。為探討miR-498在人卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用，筆者通過臨床標本檢測該小分子在人卵巢癌組織以及癌旁組織中的差異表達情況，利用體外細胞學實驗觀察miR-498對人卵巢癌細胞的增殖和凋亡作用，為進一步探討其在人卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制奠定研究基礎?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　資料與方法

1.1組織標本收集浙江省余姚市第二人民醫(yī)院2013年7月至2014年7月共30份（30例患者）手術切除的新鮮組織標本，人卵巢癌組織：取自實性癌中未壞死的區(qū)域。癌旁組織：癌周圍2cm以外的未壞死組織。所有患者術前未行放療、化療。

1.2細胞株及試劑人卵巢癌細胞株（SKOV3、OVCAR3）為浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中心實驗室饋贈。培養(yǎng)基RPMI-1640購自Hycolone公司，胎牛血清購自 Gibco公司，Taqman micro-RNA assays購自ABI公司；Lipofectamine2000、Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒購自Invitrogen公司；MTT購自sigma公司；凋亡檢測試劑盒購自BD公司。

1.3細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染兩種人卵巢癌細胞株均用含 10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。miR-498 mimics和mimics negative control購自上海吉瑪公司。取對數(shù)生長期細胞，按脂質(zhì)體試劑盒操作說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.4RT-PCR收取細胞沉淀后直接用Trizol重懸，組織標本則加入1 ml Trizol后用勻漿器研磨，加入200 l氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置10min后，12000r/min 4℃離心15 min，吸取上層水相加入等體積預冷的異丙醇置于冰上30 min，再用12 000 r/min，4℃離心15 min后棄上清，用75%乙醇漂洗RNA沉淀，DEPC水溶解RNA沉淀。Nanodrop 1000（美國）檢測總mRNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，制備cDNA產(chǎn)物，以U6為內(nèi)參，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在實時定量PCR儀（First7500美國）上進行PCR擴增。PCR擴增體系：10 l 2×SYBRGreen Realtime PCR Master Mix、20 mol/L的正反鏈引物各1l，4l逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加滅菌雙蒸水至總反應體積20 l。反應條件為：95℃預變性1 min，95℃15 s，60℃20 s，70℃l0 s，共40個循環(huán)，采用相對定量方法計算靶miRNA相對表達量。

1.5MTT檢測將轉(zhuǎn)染后的人卵巢癌細胞接種于96孔板（5000個細胞/孔）后繼續(xù)培養(yǎng)72h，然后加入20 l的MTT試劑（5 mg/L），在37℃恒溫孵育箱中孵育4 h，吸出液體后加入150l二甲基亞砜（DMSO）溶解，在酶標儀570nm波長處測定吸光度（OD）值。每組實驗重復3次。

1.6細胞凋亡檢測將轉(zhuǎn)染24 h后的人卵巢癌細胞更換為無血清培養(yǎng)基，置于1%CO2、37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞后加入5 l Annexin V和5 l PI，混勻，室溫下避光孵育30 min，然后送流式細胞儀檢測。每組實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-檢驗；兩組比較采用 檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

圖1　人卵巢癌組織和癌旁組織的 miR-498表達情況（**＜0.01）

2.1人卵巢癌組織中 miR-498的表達顯著降低相對于癌旁組織，人卵巢癌組織的miR-498表達顯著降低（15.31±0.952.51±0.62；=11.43，＜0.05），見圖1。

2.2轉(zhuǎn)染miR-498 mimics后人卵巢癌細胞增殖活性下降將人卵巢癌細胞系SKOV3、OVCAR3分為轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染miR-498 mimics）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染miR-498 negative control）和空白轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，采用MTT法檢測細胞在不同轉(zhuǎn)染處理后的吸光值（A值）。結(jié)果顯示，SKOV3細胞轉(zhuǎn)染組的OD值和陰性對照組的OD值相比差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；OVCAR3細胞有著相同的趨勢，見表1。

表1　轉(zhuǎn)染72 h后各組細胞的OD值比較

2.3轉(zhuǎn)染 miR-498mimics后促進人卵巢癌細胞凋亡 流式細胞儀檢測結(jié)果如圖所示（圖2），在轉(zhuǎn)染48 h后SKOV3細胞 miR-498 mimics組凋亡率顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），陰性對照組與空白轉(zhuǎn)染組凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（＞ 0.05），OVCAR3細胞組趨勢相同（表2）。

表2　各組細胞凋亡率的比較　%

圖2SKOV3細胞株凋亡圖

3　討論

卵巢癌的確切發(fā)病機制目前尚不清楚，缺乏有效的靶向藥物；因此，盡快闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的潛在機制十分必要。miRNAs已被證實廣泛參與體內(nèi)多種生理或病理生理過程，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展在內(nèi)。miRNA可以通過調(diào)節(jié)其靶mRNA的表達，發(fā)揮促進或者抑制腫瘤進展的作用［4-6］。miR-498位于人染色體19q13.41位置上。Schepeler報道m(xù) iR-498在II期結(jié)腸癌中表達降低，而且降低地程度與患者的不良預后相關［7］。miR-498在急性髓細胞白血病中表達下降，而在視網(wǎng)膜母細胞瘤中高表達，在內(nèi)風濕性關節(jié)炎患者的 CD4+T細胞中表達下降［8］，Yan等［9］報道了miR-498在單純皰疹病毒-1介導的卡波西肉瘤相關皰疹病毒復制中發(fā)揮關鍵作用，由于它是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的關鍵因子，因此研究該小分子在人卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用，對更加深入了解人卵巢癌的發(fā)病機制以及新的抗癌藥物的研發(fā)具有重要意義［10］。

本文研究結(jié)果顯示，人卵巢癌組織中miR-498的表達顯著高于癌旁組織，提示與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關；體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)抑制miR-498后人卵巢癌細胞增殖能力下降，凋亡增多，提示該小分子RNA與腫瘤細胞的增殖、凋亡緊密相關。關于miR-498的靶基因，目前尚未明確，有報道它通過調(diào)節(jié)FOXO3基因的表達來發(fā)揮抑制腫瘤的作用，miR-498可能與腫瘤的發(fā)生相關［11］。miR-498的功能可能還涉及其他靶基因或信號途徑的作用，需要進一步研究。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.042

R737.31

A

1671-0800（2016）07-0923-03

315400浙江省余姚，余姚市第二人民醫(yī)院

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2015-11-20（本文編輯：姜曉慶）