卓志紅，于慧敏

二甲雙胍對子宮內膜癌細胞凋亡影響相關性研究

卓志紅，于慧敏

目的探討二甲雙胍對子宮內膜癌細胞的細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的影響。方法選取Ishikawa細胞研究對象，以MTT法分析二甲雙胍對腫瘤細胞的增殖抑制作用；采用流式細胞儀研究細胞周期；利用Annexin-V標記研究早期和晚期細胞凋亡。結果二甲雙胍抑制細胞增殖，并可誘導細胞凋亡，其中早期、晚期病死率均較對照組升高；同時，細胞被阻滯于G0/G1期。結論二甲雙胍可能通過阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡，抑制子宮內膜癌細胞的增殖。

子宮內膜癌；二甲雙胍；細胞凋亡；細胞周期

子宮內膜癌是起源于子宮內膜上皮的惡性腫瘤。目前子宮內膜不典型增生及子宮內膜癌保守治療的主要方法為孕激素的大量、長期應用。但部分子宮內膜癌的保守治療存在著30%左右的失敗率［1］。近年的研究提示，降血糖藥物二甲雙胍可能具有抑制腫瘤生長的作用，流行病學研究發(fā)現(xiàn)服用二甲雙胍的糖尿病患者的腫瘤患病率顯著低于未服用二甲雙胍的糖尿病患者，并且癌癥死亡的風險也顯著降低［2］。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍對前列腺癌、乳腺癌、肺癌以及胰腺癌具備抑制腫瘤的作用［3-4］。本研究通過二甲雙胍干預Ishikawa細胞，觀察其對細胞生長抑制情況，初步探討二甲雙胍對子宮內膜癌的細胞周期和凋亡的影響?，F(xiàn)將結果報道如下。

1　資料與方法

1.1材料人子宮內膜癌 Ishikawa細胞株購自上海中科院細胞庫。細胞培養(yǎng)用胎牛血清、雙抗及RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司。二甲雙胍、MTT購自美國Sigma公司。DMSO購自Amresco公司。Annexin V-FITC流式細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。倒置顯微鏡為日本OLYMPUS公司；流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司產品；透射電子顯微鏡為Philips公司TECNAL-10；圖像分析系統(tǒng)為美國Labworks Analysis Softwar公司。

1.2細胞培養(yǎng)和MTT法細胞抑制率測定人子宮內膜癌Ishikawa細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100 ng/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2的濕潤無菌環(huán)境。設對照組、二甲雙胍1 mmol/L組、2.5mmol/L組、5mmol/L、10 mmol/L 和15 mmol/L組，處理24 h。收集對數(shù)生長期Ishikawa細胞，1×105/孔接種于96孔板。計數(shù)調整細胞濃度至 1×105/ml，設4復孔。檢測波長490 nm，根據(jù)酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度（A）值計算細胞存活率，細胞存活率=［1—（試驗孔A490—調零孔A490）/（對照孔A490—調零孔A490）］×100%。根據(jù)MTT結果得出二甲雙胍作用細胞的最佳濃度作為后續(xù)實驗濃度。

1.3流式細胞儀檢測細胞周期細胞接種于24孔培養(yǎng)板，每組設3復孔。二甲雙胍作用24 h、48 h和72 h，予加入70%乙醇中，4℃固定12 h，離心；加入PBS重懸細胞，再次離心；加入碘化丙啶染色液，避光溫浴30 min；用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測散射情況；采用分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。

1.4Annexin-V檢測細胞凋亡細胞接種于24孔培養(yǎng)板，每組設3復孔。二甲雙胍作用48 h，收集各組細胞，PBS洗滌后，離心沉淀，加入Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入 Annexin VFITC，室溫避光孵育10 min，離心后加入Annexin V-FITC結合液、Propidium Iodide染色液重懸細胞，冰浴避光15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5統(tǒng)計方法應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，采用方差分析。＜0.05為差異統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1細胞生長抑制率MTT結果顯示，當二甲雙胍濃度為1mmol/L、2.5mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L和15 mmol/LIshikawa分別作用于腫瘤細胞24 h后，均明顯抑制，且呈上升趨勢（圖1），提示二甲雙胍可以抑制子宮內膜癌細胞的生長，同時二甲雙胍作用的最佳濃度為10mmol/L，故選擇該濃度作為后續(xù)實驗的濃度。

2.2細胞周期v隨著干預時間的延長，G0/G1期細胞總體呈上升趨勢，而G2/M期細胞比例總體呈下降趨勢，說明二甲雙胍干預Ishikawa細胞后，阻滯細胞周期于G0/G1期，從而在G0/G1期阻斷細胞增殖。見表1。

2.3細胞凋亡對照組和10 mmol/L濃度的二甲雙胍處理細胞組，細胞的總凋亡率 分別為（8.03±0.22）% 和（80.59±0.71）%；實驗組細胞調亡率顯著高于對照組（圖2）。

圖1　二甲雙胍干預子宮內膜癌細胞

表1　二甲雙胍干預子宮內膜癌24 h、48 h、72 h的細胞周期表

圖2　二甲雙胍10 mmo/L作用子宮內膜癌48 h的Annexin-V凋

3　討論

近來在乳腺癌、腎癌及結腸癌等腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以殺傷對常規(guī)化療藥物耐藥的腫瘤干細胞，抑制腫瘤干細胞的產生。二甲雙胍對細胞具有強烈并且持續(xù)的抗癌作用，然而二甲雙胍是否對子宮內膜癌具有抗癌作用仍不十分明確，因此對于該作用的進一步研究具有一定的臨床潛在意義。而體外研究二甲雙胍對腫瘤細胞生物學行為的影響有助于進一步明確二甲雙胍抗癌的作用機制。通過此次研究，筆者發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能抑制子宮內膜癌Ishikawa細胞在體外的生長活性，具有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)劑量-效果的依賴性關系。

細胞周期是細胞從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂結束的全過程，分為細胞間期和分裂期，細胞間期又可分為G1期、S期和G2期。細胞增殖周期失控是惡性腫瘤呈現(xiàn)無窮增殖的重要原因。細胞是否順利進入分裂周期及分裂周期能否成功地完成，主要取決于能否順利通過2個重要關卡，即G0/G1期和G2/M期。細胞周期正調及負調因子表達紊亂與子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。國外研究表明，二甲雙胍乳腺癌細胞生長中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對腫瘤細胞增殖的抑制作用主要表現(xiàn)阻滯細胞周期于G1期［5］，而本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍干預Ishikawa細胞后，導致細胞周期發(fā)生G0/ G1期阻滯，在G0/G1期阻斷細胞增殖。這說明二甲雙胍對內膜癌細胞的增殖抑制作用可通過阻滯 G0/G1期。細胞周期的運行主要由細胞周期依賴性激酶主導，細胞周期依賴性激酶需與細胞周期蛋白結合才能變成有活性，才能使細胞周期中G1-S和G2-M的轉變。CyclinDl在細胞從G0/Gl期進入S期的過程中發(fā)揮關鍵作用，決定細胞是否繼續(xù)生長和增殖。今后將著重研究二甲雙胍阻滯腫瘤細胞周期的具體分子機制。

細胞凋亡是一種程序性死亡過程，本實驗研究二甲雙胍作用于Ishikawa細胞48 h后凋亡率的變化，發(fā)現(xiàn)經二甲雙胍10 mmol/L干預48 h后凋亡情況，結果顯示二甲雙胍處理組較陰性對照組中細胞早期、晚期及總凋亡率高。有關的凋亡途徑有細胞外途徑和細胞內途徑，在不同的凋亡途徑中，Caspase的激活是一個“瀑式”級聯(lián)反應過程，很多其他文獻報道二甲雙胍可以誘導乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌及黑色素瘤等腫瘤細胞發(fā)生調亡［6］，但Alimova等［5］卻發(fā)現(xiàn)二甲雙胍不會導致乳腺癌細胞凋亡，其中原因尚不知。本研究結果表明，二甲雙胍能誘導子宮內膜癌Ishikawa細胞的凋亡，影響細胞生長周期并發(fā)生G0/G1期阻滯，明顯抑制內膜癌細胞的增殖，提示二甲雙胍有可能應用于子宮內膜癌的輔助治療，但目前人體對于高濃度藥物是否具備安全性尚需大量的臨床實驗數(shù)據(jù)。

［1］ Kaku T，Yoshikawa H，Tsuda H，et al. Conservative therapy for adenocarcinoma and atypical endometrial hyperplasia of theendometriuminyonngwomen：central pathologicreview and treatment outcome［J］. Cancer Lett，2001，167（1）：39-48.

［2］Decensi A，Puntoni M，Goodwin P，et al. Metformin and cancer risk in diabetic patients：a systematic review and metaanalysis［J］.Cancer Prev Res（Phila）2010 （3）：1451-1461.

［3］BenSahraI，LeMarchand-BrustelY，Tanti JF，et al.Metformin in cancer therapy：a new perspective for an old antidiabetic drug［J］？MolCancerTher，2010，9：1092-1099. ［4］Pollak M.Metformin and other biguanides in oncology：advancing the research agenda［J］.Cancer Prev Res（Phila），2010， 3：1060-1065.

［5］Alimova IN，Liu B，F(xiàn)an Z.et al.Metformin inhibits breast cancer cell growth，colony formation and induces cell cycle arrestinvitro［J］.CellCycle，2009，8（6）：909-915. ［6］Yasmeen A，Beauchamp MC，Piura E，et al.Induction of apoptosis by metformin in epithelial ovarian cancer；involvement of the Bcl-2 family proteins［J］.Gynecol Oncol，2011，121（3）：492-498.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.041

R737.33

A

1671-0800（2016）07-0921-03

寧波市自然科學基金（2014A610234，2015A610226）

315010寧波，寧波市第二醫(yī)院

卓志紅，Email：zhuozhihong1@163.com

2015-10-23（本文編輯：姜曉慶）