何旭娟，徐麗艷，朱立軍，韓文文

法舒地爾對(duì)百草枯中毒大鼠肺組織肺纖維化?-SMA的影響

何旭娟，徐麗艷，朱立軍，韓文文

目的觀察法舒地爾在急性百草枯（PQ）中毒大鼠肺組織的干預(yù)作用及對(duì) -平滑肌肌動(dòng)蛋白（ -SMA）表達(dá)的影響。方法將72只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、法舒地爾對(duì)照組、PQ中毒組及法舒地爾干預(yù)組，分別于灌胃后7、14、28d活殺大鼠留取標(biāo)本。觀察大鼠的行為學(xué)改變、HE和Masson染色觀察大鼠肺組織病理改變，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組化法檢測(cè) -SMA的表達(dá)水平。結(jié)果光鏡下，PQ中毒組大鼠急性肺損傷和纖維化明顯，法舒地爾干預(yù)組大鼠肺組織損傷程度較中毒組減輕。與正常對(duì)照組比較，PQ中毒組大鼠肺組織7、14、28 d-SMAmRNA及蛋白的表達(dá)量顯著增高，于28 d時(shí)達(dá)峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與同一時(shí)間PQ中毒組比較，法舒地爾干預(yù)組小鼠肺組織 -SMAmRNA及蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論法舒地爾可以減輕百草枯所致大鼠肺纖維化程度，其可能是抑制 -SMA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

肺纖維化；-SMA；百草枯；法舒地爾

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠72只，200～230 g，10周齡左右，杭州動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為

SCXK（浙）2014-0001。

1.2實(shí)驗(yàn)材料注射用法舒地爾（紅日藥業(yè)股份有限公司，中國(guó)天津）；20%PQ溶液（天海科技有限公司，山東濟(jì)南）；-SMA抗體、免疫組化試劑盒（上海士鋒生物科技有限公司）。

1.3方法將72只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組、法舒地爾對(duì)照組、PQ中毒組及法舒地爾干預(yù)組。各組再按隨機(jī)原則分為7、14、28 d 3個(gè)亞組，每亞組6只大鼠。PQ中毒組與法舒地爾干預(yù)組大鼠予百草枯50 mg/kg，一次性灌胃染毒，兩對(duì)照組予等量0.9%氯化鈉注射液1次性灌胃，法舒地爾對(duì)照組與法舒地爾干預(yù)組于PQ染毒后予法舒地爾注射液30 mg·kg—1·d—1腹腔注射1次，染毒組及對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉注射液每天腹腔注射1次。觀察并記錄各組大鼠的體質(zhì)量及行為學(xué)改變。各組大鼠于灌胃后第7、14、28天分批處死。開(kāi)胸完整取出肺組織并觀察整體肺的變化情況，左上肺置于4%甲醛中固定，制備石蠟切片供組織學(xué)檢查，HE染色、Masson染色及免疫組化，其余肺組織入—70℃低溫冰箱保存，待測(cè)時(shí)制備肺組織勻漿。

1.4檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1大鼠肺組織病理觀察大鼠肺組織經(jīng)4%甲醛固定后，脫水、包埋、連續(xù)切片，進(jìn)行HE、Masson染色，光學(xué)鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變；參照Szapiel等［3］的方法，用Masson染色評(píng)定肺組織纖維化程度。

1.4.2RealtimePCR法檢測(cè)大鼠肺組織 -SMAmRNA的表達(dá)嚴(yán)格按照RealtimePCR操作流程操作，提取大鼠肺組織 -SMARNA進(jìn)行檢測(cè)。引物由上?；瞪镉邢薰竞铣?，-SMA（引物序列‘5-GAGCATCCGACCTTGCTAACGCCACATACATGGCAGGGACATTGAA-3’，基因序列 號(hào)：NM_031004）。

1.4.3免疫組化法檢測(cè)大鼠肺組織-SMA蛋白的表達(dá)采用鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶法（SABC）檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。-SMA免疫組化結(jié)果以胞質(zhì)出現(xiàn)棕色或棕黃色為陽(yáng)性，每張切片在400倍視野下隨機(jī)取5個(gè)視野，用高清晰圖像分析系統(tǒng)半定量分析陽(yáng)性表達(dá)部位 -SMA蛋白的表達(dá)水平，計(jì)算其平均吸光度值（MOD）作為表達(dá)水平的半定量參數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)，方差不齊則進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠行為學(xué)改變PQ中毒組大鼠染毒后出現(xiàn)氣促、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、攻擊性降低、鼠毛蓬松粗糙暗淡等表現(xiàn)。與同時(shí)間段PQ中毒組比較，法舒地爾干預(yù)組大鼠其呼吸、精神、反應(yīng)、毛發(fā)等表現(xiàn)相對(duì)較輕。

2.2大鼠肺組織HE及Masson染色下的病理改變PQ中毒組（封三彩圖5C1）光鏡下可見(jiàn)肺泡間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔水腫，隨時(shí)間延長(zhǎng)，肺泡間隔增寬，成纖維細(xì)胞大量增生，間質(zhì)大量膠原纖維沉積，明顯纖維化。法舒地爾組（封三彩圖5D1）肺泡炎較PQ中毒組減輕，滲出及充血減少，肺組織結(jié)構(gòu)破壞減輕，肺泡間隔增寬不明顯。PQ中毒組（封三彩圖5C2）大鼠肺組織藍(lán)染部分明顯，色暗質(zhì)硬，部分區(qū)域表面凹凸不平，切片時(shí)韌度增加。與中毒組比較，法舒地爾組（封三彩圖5D2）損傷程度較輕、范圍較小，韌度較輕。見(jiàn)封三彩圖5。

2.3大鼠肺組織 -SMAmRNA的表達(dá)

正常對(duì)照組與法舒地爾對(duì)照組大鼠肺組織a-SMAmRNA呈低表達(dá)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常對(duì)照組比較，PQ中毒組大鼠肺組織7、14、28d -SMAmRNA表達(dá)量顯著增高，于28 d達(dá)峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與同一時(shí)間PQ中毒組比較，法舒地爾干預(yù)組大鼠肺組織-SMAmRNA表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.4大鼠肺組織a-SMA蛋白的表達(dá)

正常對(duì)照組與法舒地爾對(duì)照組大鼠肺組織a-SMA蛋白呈低表達(dá)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常對(duì)照組比較，PQ中毒組大鼠肺組織7、14、28 d a-SMA蛋白的表達(dá)量顯著增高，于28d達(dá)峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與同一時(shí)間PQ中毒組比較，法舒地爾干預(yù)組小鼠肺組織a-SMA蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3　討論

PQ中毒可引起多臟器的損傷，尤以肺臟最為突出，稱為PQ肺，其致病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。PQ中毒早期起源于肺泡彌漫性、細(xì)胞性、肺泡內(nèi)纖維化，隨著PQ誘導(dǎo)的進(jìn)一步發(fā)展，成纖維細(xì)胞增生，膠原蛋白沉積，最終導(dǎo)致肺纖維化［4］。成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積是導(dǎo)致肺纖維化的重要原因，而成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。 -SMA是肌成纖維細(xì)胞的特征性標(biāo)準(zhǔn)物，是肌成纖維細(xì)胞具有收縮性的的基礎(chǔ)［5］。Kim等［6］在輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致的腎纖維化中，腎組織 -SMA蛋白表達(dá)進(jìn)行性升高。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肺纖維化越嚴(yán)重，-SMA相應(yīng)的表達(dá)更強(qiáng)，部位更集中。近年研究發(fā)現(xiàn)阻斷Rho/ ROCK通路可抑制肌成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生和堆積，從而減輕組織纖維化［7-8］。法舒地爾是ROCK選擇性阻斷劑，是目前唯一應(yīng)用于臨床的抑制 Rho/ROCK信號(hào)通路的藥物。王玉珍等［9］研究發(fā)現(xiàn)法舒地爾可以延緩肝臟纖維化的進(jìn)程，并且法舒地爾對(duì)腎間質(zhì)纖維化［10］及心臟纖維化［11］等均有一定的干預(yù)作用。目前，法舒地爾對(duì)肺纖維化的治療方面研究尚少，更無(wú)治療PQ后肺纖維化的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用法舒地爾干預(yù)急性PQ中毒大鼠，發(fā)現(xiàn)其能明顯減少-SMAmRNA和蛋白的表達(dá)，減輕急性肺泡炎及肺纖維化的程度，提示法舒地爾對(duì)大鼠肺纖維化有干預(yù)作用，但更為詳細(xì)的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

表1 4組大鼠肺組織-SMAmRNA的表達(dá)比較×10—3

表2　4組大鼠肺組織 -SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.020

R459.7

A

1671-0800（2016）07-0881-03百草枯（PQ）化學(xué)名稱是1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽，是一種使用非常廣泛的季胺類高效能除草劑。PQ對(duì)人毒性極大，口服中毒病死率達(dá)90%以上。百草枯對(duì)全身多器官均有不同程度的損傷，尤其以肺損傷最為突出。PQ所致的肺損傷包括肺水腫、充血、呼吸衰竭和肺纖維化等［1］，肺纖維化是PQ中毒后導(dǎo)致呼吸衰竭死亡的重要原因。PQ中毒致肺纖維化的機(jī)制尚未闡明，迄今仍無(wú)特效治療藥物。-平滑肌肌動(dòng)蛋白（-SMA）是最為常見(jiàn)的肌成纖維細(xì)胞的分子標(biāo)志，增值表達(dá)形成纖維細(xì)胞灶，在肺纖維化中起著一定的作用［2］。法舒地爾作為一種新型、高效的血管擴(kuò)張藥，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種器官纖維化有干預(yù)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PQ灌胃染毒建立模型，檢測(cè) -SMA的動(dòng)態(tài)變化，觀察 -SMA在百草枯中毒肺纖維化中的作用及法舒地爾的干預(yù)效應(yīng)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

寧波市醫(yī)學(xué)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013A03）

315040寧波，寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院通信作者： 何旭娟，Email：871903188@qq.com

2016-01-10