嚴(yán)安琪，高昌禮，王一凡，陳永久

（浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山　316022）

DNA條形碼在海洋動(dòng)物種類鑒別中的應(yīng)用：以馬鲅為例

嚴(yán)安琪，高昌禮，王一凡，陳永久

（浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山316022）

摘要：根據(jù)采自浙江舟山群島、寧波和溫州沿海海域的20個(gè)馬鲅個(gè)體的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（COI）基因的DNA序列信息，對(duì)比GenBank上其它馬鲅COI同源序列。通過(guò)Kimura雙參數(shù)（K-2-P）遺傳距離，鄰接法（NJ）和Bayesian聚類關(guān)系分析，得到四指馬鲅COI的單倍型多樣性（h）為0.525，核苷酸多態(tài)性（π）為0.0018；六指馬鲅種內(nèi)單倍型多樣性（h）為0.800；核苷酸多態(tài)性（π）為0.0202。兩種馬鲅間的平均K-2-P距離為0.225，這個(gè)值在馬鲅屬間的距離范圍內(nèi)，為種內(nèi)的平均距離0.021的11倍。結(jié)果表明，所采集的這些馬鲅隸屬于2種，即四指馬鲅和六指馬鲅，這個(gè)結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定相吻合。

關(guān)鍵詞：DNA條形碼；四指馬鲅；六指馬鲅；COI DNA序列

DNA條形碼是一種利用短的DNA序列對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定的技術(shù)，為物種鑒定工作的信息化、高效化、準(zhǔn)確化提供了可能。2003年加拿大分類學(xué)家HEBERT等［1］首次提出DNA條形碼的概念。由于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法對(duì)標(biāo)本的保存狀況以及對(duì)研究者的專業(yè)知識(shí)、訓(xùn)練的要求嚴(yán)格，導(dǎo)致其難以滿足于物種鑒別相關(guān)的海洋動(dòng)物分類、多樣性、漁業(yè)資源保護(hù)和管理、以及食品加工與檢測(cè)的研究需求。因而海洋生物的DNA條形碼分析雖然起步不久［2］，但已成為國(guó)際上科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

線粒體基因組（mtDNA）具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、進(jìn)化速率快、幾乎不發(fā)生重組等特點(diǎn)，其中，細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（Cytochrome c oxidase subunit I，COI）DNA序列變異水平適合于區(qū)分不同的物種，包括近緣物種。目前，COⅠ基因已經(jīng)作為許多動(dòng)物種類鑒別及多樣性分析的分子標(biāo)記。The Barcode of Life Data system（BLOD）數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的魚(yú)類DNA條形碼信息基本上都來(lái)自于此基因［2］。張鳳英等［3］通過(guò)研究三種鯧屬魚(yú)類線粒體COI基因序列從分子水平闡述了中國(guó)東海海域鯧屬魚(yú)類的分類，以及它們與鯧科其他屬之間的親緣關(guān)系；程國(guó)寶等［4］對(duì)梭魚(yú)和鯔魚(yú)線粒體16S rRNA和COI基因片段的比較發(fā)現(xiàn)COI基因同樣適合于梭魚(yú)和鯔魚(yú)的物種鑒定。

馬鲅科Polynemidae隸屬于馬鲅目Polynemiformes。通常體延長(zhǎng)而側(cè)扁，頭部、體側(cè)及各鰭基部均被櫛鱗，齒小呈絨毛狀。馬鲅分布于全球熱帶區(qū)域的沿岸及河口水域。我國(guó)共2屬，即四指馬鲅屬Eleutheronema和多指馬鲅屬Polydactylus，6個(gè)種［5］。四指馬鲅Eleutheronema tetradactylum和六指馬鲅（Polydactylus sextarius、又稱黑斑多指馬鲅）是亞洲地區(qū)馬鲅科魚(yú)類中最主要的經(jīng)濟(jì)代表物種［6］。迄今為止，有關(guān)馬鲅科種類多樣性、種群結(jié)構(gòu)、及遺傳背景等方面的報(bào)道較少［7］。對(duì)物種遺傳結(jié)構(gòu)缺乏了解往往容易導(dǎo)致地區(qū)的過(guò)度捕撈，從而最終導(dǎo)致物種的衰退［8］。因此，開(kāi)展馬鲅科魚(yú)類的DNA條形碼研究并探討其系統(tǒng)演化關(guān)系，有助于深化對(duì)它們的物種多樣性、及種質(zhì)資源等狀況的理解，進(jìn)而為合理保護(hù)、開(kāi)發(fā)和利用馬鲅的資源，乃至今后開(kāi)展馬鲅的養(yǎng)殖和遺傳育種工作提供重要參考依據(jù)。

浙江近海海域處于亞熱帶，該地區(qū)不僅有大量淡水和營(yíng)養(yǎng)鹽的匯入，而且受來(lái)自赤道太平洋的黑潮及臺(tái)灣海峽暖流的影響，獨(dú)特的海洋環(huán)境為眾多海洋生物提供了繁殖、洄游和棲息的場(chǎng)所。據(jù)趙盛龍等［9］報(bào)道，東海舟山海域主要有兩種馬鲅科魚(yú)類，即四指馬鲅和六指馬鲅。本研究通過(guò)對(duì)浙江近海馬鲅科魚(yú)類的CO I DNA序列片段序列分析，探討以COI基因?yàn)闃?biāo)記的馬鲅DNA條形碼的應(yīng)用前景及其潛在問(wèn)題，為將來(lái)馬鲅的系統(tǒng)分類、多樣性、種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用、及人工養(yǎng)殖與良種選育提供參考信息。

圖1　馬鲅樣本地理來(lái)源的信息。舟山群島沿岸包括5個(gè)采樣點(diǎn)，即大長(zhǎng)涂楊梅坑（CT）、岱山東沙（DS）、舟山沈家門（SJM）、登步雞冠（DB）、桃花塔灣金沙（TH），寧波象山縣沿岸1個(gè)采樣點(diǎn)即旦門（XS），以及溫州蒼南縣沿岸1個(gè)采樣點(diǎn)即漁寮（CN）Fig.1　Thegeographicalinformationfororiginsof threadfinsamplesbarcodedinthisstudy.Thecodesfor thesamplingsitesareasfollows.Fivesitesin Zhoushan:GreatChangtu-Yangmeikeng（CT），Daishan -Dongsha（DS），Zhoushan-Shenjiamen（SJM），Dengbu -Jiguan（DB），andTaohua-Tawanjinsha（TH）；onesite inNingbo:Xiangshan-Danmen（XS）；onesitein Wenzhou:Cangnan-Yuliao（CN）.

1材料與方法

1.1樣本采集和保存

本項(xiàng)目共選取了浙江沿海的7個(gè)采樣點(diǎn)，包括舟山群島沿岸的5個(gè)采樣點(diǎn)，即大長(zhǎng)涂楊梅坑（簡(jiǎn)稱CT）、岱山東沙（簡(jiǎn)稱DS）、舟山沈家門（簡(jiǎn)稱SJM）、登步雞冠（簡(jiǎn)稱DB）和桃花塔灣金沙（簡(jiǎn)稱TH），寧波沿岸的1個(gè)采樣點(diǎn)即象山旦門（簡(jiǎn)稱XS），溫州蒼南縣沿岸的1個(gè)采樣點(diǎn)即漁寮（簡(jiǎn)稱CN），采樣的詳細(xì)地理位置參考圖1。通過(guò)近海定點(diǎn)漁網(wǎng)圍捕和近海捕漁船捕撈共得到20個(gè)馬鲅個(gè)體樣本。采集的時(shí)間從2011到2013年，每年的7-9月。樣本經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定后，保存在95%的酒精中備用。

1.2基因組DNA提取與COI DNA片段擴(kuò)增

基因組DNA的提取使用Promega公司W(wǎng)izard GenomicDNA Purification Kit試劑盒（具體操作方法參考Promega的手冊(cè)）。提取的DNA樣本的用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后于-20℃保存?zhèn)溆?。COI DNA擴(kuò)增的PCR引物為FishF1和FishR1［10］。引物由上海生工生物股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增在一個(gè)25 uL的反應(yīng)體積中進(jìn)行，反應(yīng)體系為：ddH2O（8.5uL）、2×Taq Mix （12.5 uL）、正向引物（1.0 uL）、反向引物（1.0 uL）、模板DNA（2.0 uL）。PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min；95℃變性40 s；52℃退火1 min；72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳15 min，電泳完成后進(jìn)行凝膠電泳成像儀觀看圖像。PCR產(chǎn)物檢測(cè)陽(yáng)性后送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序儀器為ABI-PRISM 3730。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用BioEditv.7.0.9.0和ClustalX 2.0軟件將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工校正和序列比對(duì)［11，12］。使用DnaSP 5.0軟件［13］計(jì)算核苷酸多態(tài)位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)（h）和核苷酸多態(tài)性指數(shù)（π）。采用MEGA 4.0軟件［14］計(jì)算序列中的堿基含量和Kimura雙參數(shù)（K-2-P）遺傳距離，再構(gòu)建鄰接法（NJ）聚類樹(shù)，并通過(guò)Bootstrap檢驗(yàn)聚類樹(shù)各分支的置信度。貝葉斯（Bayesian）系統(tǒng)關(guān)系分析通過(guò)MrBayes v.3.1［15］軟件。MrBayes采用jModeltest v.0.1.1［16］選出的最佳核苷酸替代突變模型，程序運(yùn)行兩個(gè)同步搜索，每個(gè)搜索由4個(gè)MCMC（Markov Chain Monte Carlo）鏈和10，000，000重復(fù)采樣組成；采樣間隔為1 000；最初的2 500個(gè)樹(shù)被丟棄；鏈間分裂頻率的平均標(biāo)準(zhǔn)差用來(lái)推斷MCMC運(yùn)行的完善程度。

2結(jié)果

2.1COI DNA片段序列及單倍型

通過(guò)對(duì)20個(gè)COⅠ基因片段進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過(guò)人工校正并引入GenBank中的9個(gè)馬鲅科物種序列進(jìn)行比對(duì)，共獲得29條長(zhǎng)度為579 bp的馬鲅COⅠDNA同源序列。經(jīng)分析，共檢測(cè)到簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)164個(gè)，保守位點(diǎn)383個(gè)。COI DNA片段中A、C、G、T的含量分別為22.0%、29.8%、19.0%、29.1%。A+T含量（51.1%）稍高于G+C含量（48.8%）。

從29條序列中共定義15個(gè)單倍型。計(jì)算獲得的單倍型數(shù)據(jù)及其DNA序列變異和分布情況詳見(jiàn)表1。單倍型H1的樣本數(shù)量最多，有11個(gè)樣本分別采自CT、DS、DB及TH海域；相對(duì)于H1，單倍型H2、H3、H4、H6和H7的分布都較窄。H2、H3、H4分別僅在CT、XS、及DB一個(gè)樣點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)；H6和H7僅在SJM被采集到。從采樣地點(diǎn)分析，采自SJM樣本的單倍型數(shù)最高為3個(gè)，包括2個(gè)特有類型，H6和H7；CT、DB海域單倍型數(shù)適中，各有2個(gè)，除了共享一個(gè)常見(jiàn)的H1外，各自有一個(gè)特有類型，分別為H2和H4；DS、TH都僅有H1；CN僅有一個(gè)和SJM共享的H；XS僅有一個(gè)特有的H3。

表1　本文涉及的馬鲅信息Tab.1 Information of threadfin samples and CO I DNA sequences involved in this study

2.2系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

Kimura雙參數(shù)的遺傳距離計(jì)算顯示，隸屬15個(gè)單倍型的29個(gè)馬鲅樣本的遺傳距離聚為兩類，種內(nèi)和種間。種內(nèi)的距離為0.021，種間的距離為0.225，種間距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)距離約11倍（表2）。根據(jù)BLOD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.barcodinglife.org）的建議，采自浙江近海海域的20個(gè)馬鲅個(gè)體隸屬于2種，即四指馬鲅和六指馬鲅。其中四指馬鲅的單倍型數(shù)量為4，即H1、H2、H3和H4；單倍型多態(tài)性（h）為0.525；核苷酸多態(tài)性（π）為0.001 8；若加上來(lái)自于GenBank的H8，六指馬鲅單倍型數(shù)量為4，即H5、H6、H7及H8；單倍型多態(tài)性（h）為0.800；核苷酸多態(tài)性（π）為0.0202。

表2　馬鲅COI單倍型之間的K-2-P遺傳距離Tab.2　The pairwise K-2-P distances of threadfin COI haplotypes

在貝葉斯法分析中，jModeltest軟件推薦的最佳核苷酸替換模型為TPM2uf+I。獲得的鄰接法（NJ）和Bayesian聚類關(guān)系結(jié)果一致（圖2），四指馬鲅和六指馬鲅位于兩個(gè)完全獨(dú)立的分支。

圖2　基于線粒體COI DNA條形碼序列變異的馬鲅Bayesian系統(tǒng)樹(shù)Fig.2　Bayesian tree of threadfins based on mitochondrialCOIDNAbarcodesequencevariation

3討論

3.1浙江沿岸馬鲅科魚(yú)類的DNA條形碼

通過(guò)本研究所得的DNA條形碼分析結(jié)果顯示，浙江近海海域的馬鲅有2個(gè)物種，即四指馬鲅和六指馬鲅，分別隸屬兩屬，四指馬鲅屬和多指馬鲅屬?；贑OI DNA序列計(jì)算得到的馬鲅K-2-P遺傳距離符合HEBERT等［1］提出的條形碼鑒定標(biāo)準(zhǔn)，即種間距離為種內(nèi)距離的10倍以上。HEBERT等還認(rèn)為大部分動(dòng)物種內(nèi)距離小于0.01，極少有大于0.02。但我們所測(cè)的馬鲅種內(nèi)的平均遺傳距離接近上限0.02，說(shuō)明浙江近海海海域的馬鲅科魚(yú)類的種內(nèi)變異水平較高。

根據(jù)記載，我國(guó)海域有馬鲅2屬6種［6］。雖然本次采樣數(shù)量較少，僅20個(gè)樣本；范圍較小，僅限于浙江省的舟山群島、寧波象山和溫州蒼南近海海域，但發(fā)現(xiàn)了四指馬鲅和六指馬鲅兩個(gè)物種，而且以四指馬鲅個(gè)體較多，分布也較廣；六指馬鲅僅在舟山群島的沈家門和蒼南的漁寮兩地被采集到。采用DNA條形碼分析與形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果相吻合。另外，其它4種馬鲅未被發(fā)現(xiàn)。目前，有關(guān)印度多指馬鲅Polydactylus indicus和五絲多指馬鲅P.plebeius在我國(guó)的報(bào)道很少，這兩個(gè)物種的形態(tài)描述也是極少［6］。

遺傳多樣性是物種進(jìn)化潛能的保證。一般而言，遺傳多樣性的高低與物種的生存能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān)。遺傳變異的丟失，會(huì)直接導(dǎo)致物種對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力的下降?？偟膩?lái)說(shuō)，四指馬鲅和六指馬鲅的遺傳多樣性水平相差不大。兩者單倍型數(shù)量一致，若不包括來(lái)自于GenBank中H8，浙江近海海域六指馬鲅的單倍型實(shí)際上只有3個(gè)，比四指馬鲅少；但就多態(tài)性指數(shù)（h和π）來(lái)說(shuō)，六指馬鲅較四指馬鲅高，特別是單倍型多態(tài)性，差異值為0.275。由于本次DNA條形碼分析四指馬鲅和六指馬鲅的樣本數(shù)都較小，因此這個(gè)結(jié)果還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2DNA條形碼在海洋動(dòng)物分類鑒別中的應(yīng)用及潛在問(wèn)題

目前，依賴于形態(tài)學(xué)技術(shù)已無(wú)法滿足種類繁多的海洋動(dòng)物分類與鑒別的需求［2］。DNA條形碼技術(shù)可以拋開(kāi)形態(tài)相似的假象，從基因水平上為分類學(xué)提供依據(jù)，不僅可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)分類的不足，還加快已知物種的識(shí)別速度，促進(jìn)新物種的發(fā)現(xiàn)，使分類學(xué)的發(fā)展更加快速和深入?？偟膩?lái)說(shuō)，DNA條形碼的優(yōu)勢(shì)可以歸納如下：（1）可從少量的組織中獲得；（2）可鑒定不同生長(zhǎng)階段形態(tài)差異大或者形態(tài)相似性很高的物種；（3）核苷酸序列組成的數(shù)據(jù)庫(kù)可以被視為數(shù)字化的數(shù)據(jù)庫(kù)；（4）DNA條形碼的鑒定屬于非專家鑒定；（5）能夠從根本上解決優(yōu)秀分類學(xué)家匱乏和數(shù)據(jù)共享的問(wèn)題。

然而，DNA條形碼用于海洋動(dòng)物的分類和鑒定才剛剛起步，缺乏系統(tǒng)性和完整性，從而制約了DNA條形碼的國(guó)際化研究進(jìn)展［2］。目前，以馬鲅等經(jīng)濟(jì)物種為代表的一些海洋動(dòng)物條形碼數(shù)據(jù)已有零星的報(bào)道［17-20］，卻未形成系統(tǒng)完整的數(shù)據(jù)庫(kù)。因此，盡快建立全球性DNA條形碼管理系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)分類學(xué)的科學(xué)化和國(guó)際一體化的根本途徑。線粒體COI DNA序列具有種內(nèi)變異小而種間變異顯著的特點(diǎn)，變異水平適合于區(qū)分不同的物種，特別是近緣物種，因此可以作為海洋動(dòng)物理想的DNA條形碼標(biāo)記。本項(xiàng)目研究所得的條形碼數(shù)據(jù)即可作為馬鲅科魚(yú)類分類鑒定的可靠的分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)?？傊S著DNA條形碼技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，它將會(huì)在海洋物種鑒定及其多樣性調(diào)查等領(lǐng)域發(fā)揮巨大的潛力。

致謝：感謝顧翠平，許則灘，Jamel Tyso James實(shí)驗(yàn)室成員在采樣、以及實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析過(guò)程中提供幫助。浙江海洋學(xué)院趙盛龍教授協(xié)助鑒定樣品，謹(jǐn)致謝忱！

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中圖分類號(hào)：Q959.479

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào):1008-830X（2016）01-0019-05

收稿日期：2015-02-01 基金項(xiàng)目：浙江海洋學(xué)院留學(xué)回國(guó)人員啟動(dòng)基金；浙江省舟山市博士（后）聯(lián)誼會(huì)重點(diǎn)項(xiàng)目基金；浙江省臨海市社科聯(lián)基金（13YB01）

作者簡(jiǎn)介：嚴(yán)安琪（1990-），女，浙江紹興人，碩士研究生，研究方向：海洋生物學(xué). 通訊作者：陳永久.E-mail:yongjiuchen@hotmail.com

The Application of DNA Barcoding in Species Identification of Marine Animals:Exemplified by Threadfins

YAN An-qi，GAO Chang-li，WANG Yi-fan，et al
（Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022，China）

Abstract:We analyzed mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I（COI）DNA sequences for 20 threadfin individuals collected from the coastal waters of Zhoushan Islands，Ningbo，and Wenzhou in Zhejiang Province，and then compared them with homologous sequences of other threadfins available on the GenBank database. The analyses of Kimura 2-parameter（K-2-P）genetic distance，neighbor-joining（NJ）network，and Bayesian phylogeny indicate that the threadfin samples belong to two species，i.e.Eleutheronema tetradactylum，and Polynemus sextarius，in agreement with morphological characterization.The haplotype diversity（h）is 0.525，and nucleotide diversity（π）is 0.0018 in E.tetradactylum，while h is 0.800，and π is 0.0202 in P.sextarius. The average K-2-P distance is 0.225 between the two species.This value is within the range of closely related genera of threadfins，and 11 times greater than that of average intraspecific distance（0.221）.

Key words:DNA barcoding；Eleutheronema tetradactylum；Polynemus sextarius；COI DNA sequence