楊戍，張?chǎng)?，姜銳，孫立權(quán)，羅愛芹（北京理工大學(xué)生命學(xué)院， 北京 100081）

溶菌酶表面印跡磁性納米顆粒的制備與吸附性能表征

楊戍，張?chǎng)?，姜銳，孫立權(quán)，羅愛芹*
（北京理工大學(xué)生命學(xué)院， 北京 100081）

摘要：由于蛋白質(zhì)分子本身的大分子體積和易變性空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)印跡研究目前仍然面臨重大挑戰(zhàn)。本文提出一種制備磁性蛋白質(zhì)表面印跡新方法。首先以溶劑熱法一步合成羧基修飾的磁性內(nèi)核，然后一步實(shí)現(xiàn)表面雙鍵修飾，最后以改進(jìn)的丙烯酰胺印跡體系實(shí)現(xiàn)印跡包裹。這種制備方法避免了多步修飾帶來的納米顆粒交聯(lián)和包裹層過厚等問題。高的飽和磁感應(yīng)強(qiáng)度表明磁性納米顆粒具有非?？焖俚拇彭憫?yīng)。吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明I表面印跡聚合物能在10min達(dá)到吸附平衡，具有非常快的吸附動(dòng)力學(xué)性能，且符合準(zhǔn)二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)模型。進(jìn)一步吸附選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示印跡聚合物具有選擇性吸附目標(biāo)蛋白。

關(guān)鍵詞：溶菌酶；表面印跡；磁性納米顆粒；吸附性能

1　引言

分子印跡應(yīng)用于蛋白選擇性識(shí)別常見的印跡體系丙烯酰胺自由基聚合印跡體系，sol-gel印跡體系，苯硼酸印跡聚合體系，多巴胺自聚合體系，殼聚糖印跡聚合體系等。這其中基于丙烯酰胺的印跡聚合體系以其功能多樣、適應(yīng)性強(qiáng)，是蛋白印跡中最常用的［1］?；诒０酚≯E體系制備的蛋白分子印跡聚合物在多個(gè)方面得到應(yīng)用，如作為毛細(xì)管電泳基質(zhì)［2］，制備整體柱［3］，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的識(shí)別與釋放控制［4］，硅膠微球表面的蛋白質(zhì)印跡［5］，磁性納米顆粒表面的蛋白質(zhì)印跡［6，7］，作為選擇性識(shí)別單元應(yīng)用于傳感器中［8］，作為重結(jié)晶晶核［9］等。這其中基于磁性內(nèi)核表面印跡的研究備受關(guān)注。主要是因?yàn)榇判苑蛛x便于操作。而具有選擇性吸附能力的磁性表面印跡復(fù)合物顆粒在生物樣品處理中具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本文提出一種新穎的制備磁性表面印跡復(fù)合物顆粒的方法，可用于實(shí)現(xiàn)蛋白分子選擇性、快速分離。

2　實(shí)驗(yàn)部分

2.1試劑與儀器

三氯化鐵（分析純）購于天津福成化學(xué)試劑公司，乙二醇（EG，分析純），硅烷偶聯(lián)劑KH570（MPS，分析純）購于西隴化工股份有限公司，N，N‘－亞甲基雙丙烯酰胺（MBA，分析純），甲基丙烯酸（MAA，分析純），無水乙酸鈉（NaAc，分析純），過硫酸銨 （APS，分析純）購于北京化工廠；溶菌酶（Lyz， Ultra－pure），卵清白蛋白（OVA， Ultra－pure），牛血清白蛋白（BSA， Ultrapure）購于北京萊伯盒斯生物技術(shù)有限公司；丙烯酰胺（AAm，分析純）購于天津化學(xué)試劑研究所；N－異丙基丙烯酰胺（NIPAAm，分析純）購于上海國藥化學(xué)試劑公司；四甲基乙二胺（TEMED，＞99%）購于北京夢(mèng)怡美生物科技有限公司。

紫外分光光度計(jì)（Ultraviolet Spectrophotometer， UV）為Shimadzu UV－1800；透射電子顯微鏡（Transmission electronic microscopy TEM）為Hitachi H-800。 樣品振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)（Vibrating sample magnetometer，VSM）采用Lakeshore Model 7307。

2.2磁性納米顆粒的制備

溶劑熱法制備Fe3O4磁性納米微球是近年來發(fā)展起來的一種制備方法，簡單、高效得到廣泛關(guān)注。本文采用文獻(xiàn)的制備方法［10］，并稍做調(diào)整。具體方法如下：稱取0.65 g三氯化鐵溶于20 mL乙二醇中，加入0.20 g檸檬酸鈉，然后加入1.2 g乙酸鈉并劇烈攪拌至全部溶解，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到50 mL高壓反應(yīng)釜的聚四氟乙烯內(nèi)襯中蓋緊，然后200°C恒溫反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻到室溫，將反應(yīng)釜中的產(chǎn)物倒入燒杯中，利用強(qiáng)磁鐵分離出制備得到的褐色磁性粒子。用水和乙醇反復(fù)清洗直至上層液體至無色透明呈中性。最后，磁分離，真空干燥后，4°C冰箱密封保存。

2.3磁性納米顆粒的表面功能化

磁性Fe3O4納米顆粒表面乙烯基化主要參考文獻(xiàn)并進(jìn)行小的調(diào)整［11］，具體步驟如下：在250 mL燒杯中加入40 mL無水乙醇、10 mL水和1.5 mL濃氨水，稱取200 mg Fe3O4磁性納米顆粒，利用超聲分散于上述混合液中?；旌弦褐劣?0°C水浴中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和機(jī)械攪拌下，加入MPS 400 μL，反應(yīng)24 h。利用磁分離，乙醇多次洗滌，然后40°C真空干燥。

2.4磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物的制備

稱取100 mg乙烯基化的Fe3O4磁性納米顆粒分散在20 mL PB緩沖液（0.02M， pH 6.0）中備用。另取20 mL PB緩沖液（0.02M， pH 6.0），在其中分別加入30 mg AAm，100 mg NIPAAm，30uL MAA，25 mg MBA和30 mg Lyz，混勻后置于搖床上常溫孵育1h。然后加入配置好的磁性顆粒分散液混勻。吹氮?dú)?0 min，在室溫機(jī)械攪拌下，加入APS溶液（10%，w/v）100uL，加入TEMED溶液（30%，v/v）100 μL，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24 h，得到具有磁性的印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）顆粒。

作為對(duì)照制備的非印跡聚合物（non imprinted polymer，NIP）顆粒，只是不加入模板蛋白Lyz，采用以上相同步驟制得。

將制備得到的MIP顆粒浸入10vol%的乙酸-10wt%的 SDS混合洗脫液中振蕩6 h，然后磁分離更換洗脫液，此步驟重復(fù)5次；再用純水振蕩洗滌多次，直至中性。

2.5磁性納米顆粒表面印跡聚合物的吸附性能表征

將10 mg溶菌酶表面印跡磁性復(fù)合物MIP和NIP分別置于離心管中，加入2.0 mL不同Lyz濃度的PBS溶液，在15°C下以120 rpm的轉(zhuǎn)速振蕩。然后磁分離，取上清液通過紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定其紫外吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算吸附前后目標(biāo)蛋白分子的濃度變化，進(jìn)而測(cè)定蛋白質(zhì)在相應(yīng)磁性粒子上的吸附量?？赏ㄟ^以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)吸附量：

式1-1中，Q是每單位質(zhì)量的聚合物吸附目標(biāo)分子的量，mg/g；C0是吸附之前目標(biāo)分子濃度，mg/mL；Ct是吸附之后目標(biāo)分子濃度，mg/mL；V是初始溶液的體積，mL；m是加入的聚合物的質(zhì)量，g。

吸附動(dòng)力學(xué)又稱動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，主要是為了考察MIP/ NIP的吸附量隨時(shí)間的變化規(guī)律。分別準(zhǔn)確稱量10mg MIP/ NIP于7支離心管，同時(shí)加入2 mL Lyz蛋白吸附液（0.2 mg/ mL）并開始計(jì)時(shí)，然后分別在5、10、20、30、40 min時(shí)利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定磁分離后吸附上清液中模板蛋白的濃度，并依據(jù)公式計(jì)算得到不同時(shí)刻下的吸附量大小。

為了進(jìn)一步表述MIP顆粒的選擇性吸附能力，選取對(duì)照NIP作為參考，分別測(cè)算其吸附量，并引入印跡因子（imprinting factor， IF）作為判斷吸附性能的一個(gè)重要指標(biāo)：

式1-2中，IF為印跡因子；QMIP為印跡聚合物MIP顆粒的吸附量，mg/g；QNIP為非印跡聚合物顆粒NIP的吸附量，mg/g。

選擇性吸附實(shí)驗(yàn)主要考察的是MIP/NIP對(duì)模板蛋白溶菌酶（Lyz）的選擇性識(shí)別能力。本實(shí)驗(yàn)選用了牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）二種蛋白作為參比蛋白來研究磁性聚合物顆粒對(duì)模板蛋白的選擇吸附性能。準(zhǔn)確稱取10 mg的MIP/NIP置于2 mL的離心管中，分別加入2 mL濃度均為0.2 mg/ mL的BSA、Lyz和OVA溶液，搖晃均勻后放入搖床振蕩吸附0.5 h，磁分離后取上清液，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。然后根據(jù)吸附容量計(jì)算公式計(jì)算得到相應(yīng)的吸附量。

引入選擇性因子（Selective Coeffi ciency，SC）來表征選擇性大小。選擇性因子定義如式1-3所示：

式1-3中，IFTEM是模板分子的印跡因子；IFCOM是對(duì)照分子的印跡因子。

3　結(jié)果與討論

3.1磁性納米顆粒表面印跡聚合物的制備

本文采用檸檬酸作為分散劑包裹磁性納米顆粒［10］，該方法制備得到的Fe3O4磁性納米顆粒具有非常好的水相分散性，靜置2 h也不會(huì)產(chǎn)生沉淀；且磁響應(yīng)快，達(dá)到磁分離只需要30 s左右，從而滿足實(shí)際作為磁分離材料的實(shí)際應(yīng)用需要。從下面的TEM分析（圖1）中也可以看出，顆粒呈單分散狀態(tài)，分散較好；粒徑大小約200 nm。

圖1　Fe3O4磁性納米顆粒TEM圖Fig. 1 TEM image of the Fe3O4 magnetic nanoparticles

3.2磁性納米顆粒的表面功能化

常規(guī)的磁性顆粒表面功能化這一過程往往需要復(fù)雜的多步反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。如果能夠引入比較簡單的步驟，有望提高整個(gè)分子印跡聚合物制備的效率和印跡性能。

Fe3O4磁性納米顆粒的功能化不僅是應(yīng)用目的的驅(qū)動(dòng)，也是Fe3O4磁性納米顆粒本身的特性決定的。磁性Fe3O4納米顆粒容易團(tuán)聚，難以體現(xiàn)納米顆粒的優(yōu)越特性，也在一定程度上阻礙了之后的應(yīng)用研究。此外，純Fe3O4顆粒暴露在空氣中極易發(fā)生氧化，在pH低于4的酸性介質(zhì)中易溶解。因而，從不同需求出發(fā)，需要對(duì)納米Fe3O4顆粒進(jìn)行有目的的、有效的表面修飾。

常見的用于實(shí)現(xiàn)印跡包裹前的表面功能化修飾中表面硅膠包裹是常采用的一步［12］。雖然表面包裹硅膠層有利于后續(xù)的進(jìn)一步包裹和硅烷化接枝其它功能基團(tuán)［18］，但反應(yīng)過程中各種條件需要精細(xì)控制，還容易使磁性納米顆粒間形成交聯(lián)，且增加的反應(yīng)步驟必然導(dǎo)致磁性納米顆粒的產(chǎn)率降低，從而給有效制備得到單分散磁性納米顆粒帶來很多麻煩。

本文采用精簡的合成步驟［11］，采用一步聚合雙鍵功能化，省掉不必要的硅膠包裹步驟，同時(shí)避免納米顆粒的交聯(lián)，為進(jìn)一步的表面印跡提供更有效的平臺(tái)。

圖2　聚合雙鍵功能化包裹的磁性納米顆粒FT-IR圖Fig. 2 FT-IR of magnetic nanoparticles coated with double bond functionalization

從圖中可以看出，不飽和雙鍵特征峰出現(xiàn)在1610 cm-1處，表明完成了聚合雙鍵功能化表面修飾。

3.3磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物的制備

將表面功能化的磁性納米顆粒制備加入印跡預(yù)聚合體系中作為載體，自由基引發(fā)印跡包裹，得到溶菌酶磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物。整個(gè)制備過程如下圖3所示：

圖3　磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物的制備示意圖Fig. 3 Schematic illustration of the preparation of surface imprinted magnetic nano particles composites

已有的蛋白印跡研究發(fā)現(xiàn)，加入甲基丙烯酸（MAA）能夠在丙烯酰胺/N， N‘-亞甲基雙丙烯酰胺雙丙烯酰胺（MBA）印跡體系中引入額外的靜電相互作用，彌補(bǔ)丙烯酰胺印跡體系弱相互作用的不足，從而提高印跡識(shí)別效果［13］。另一方面，對(duì)于水相中的蛋白印跡過程，除了常規(guī)的靜電相互作用和氫鍵等相互作用形式外，N-異丙基丙烯酰胺（NIPAAM）等疏水型輔助功能單體的疏水作用能起到明顯的加強(qiáng)作用［14］。因而，本文在制備印跡聚合物包裹時(shí)，采用了丙烯酰胺（AM）作為功能單體，并加入甲基丙烯酸（MAA）和N-異丙基丙烯酰胺（NIPAAM）作為輔助功能單體，N， N‘-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）作為交聯(lián)劑，選取蛋白溶菌酶（Lyz）作為模板蛋白，APS引發(fā)自由基聚合得到表面印跡復(fù)合物顆粒。

3.4磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物的磁響應(yīng)性能表征

實(shí)際應(yīng)用中磁響應(yīng)快慢直接影響使用效率，因而需要對(duì)制備磁性納米表面印跡復(fù)合物顆粒的磁響應(yīng)性能進(jìn)行表征。采用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（Vibrating Sample Magnetometry，VSM）分別測(cè)定室溫條件下磁性納米顆粒（magnetic nanoparticle，MNP）本身以及制備得到的MIP和NIP顆粒的磁滯回線（MH）。如下圖所示：

圖4　磁性納米顆粒的VSM測(cè)試結(jié)果圖Fig. 4 the VSM image of the prepared magnetic nano particles

從圖中可以看到，制得得到的羧基修飾的磁性納米顆粒（MNP）的飽和磁化強(qiáng)度接近70 emu/g，表明磁性內(nèi)核具有非常強(qiáng)的磁響應(yīng)特性。經(jīng)過印跡層包裹后，印跡聚合物和非印跡聚合物表面包覆的MIP/NIP顆粒的飽和磁化強(qiáng)度接近40 emu/g，飽和磁化強(qiáng)度的降低是由于印跡層的包裹導(dǎo)致的屏蔽效應(yīng)。雖然如此，飽和磁化強(qiáng)度也是比較高的數(shù)值，因而也能夠快速的從溶液中輕易分離出來。對(duì)比文獻(xiàn)中得到印跡聚合物顆粒的磁飽和磁化強(qiáng)度數(shù)值只有約20 emu/g［7］，本文得到的包裹后的飽和磁化強(qiáng)度很高，這也說明減少硅膠層包裹，可以有效提高印跡磁性納米顆粒的磁響應(yīng)性能。從實(shí)際分離效果來看，在外加磁場(chǎng)的作用下，實(shí)現(xiàn)磁分離僅用不到30 s的時(shí)間就可以完成，非常迅速，從而保證了實(shí)際應(yīng)用的需要。

3.5 溶菌酶磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物的吸附動(dòng)力學(xué)性能測(cè)試

溶菌酶磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物的吸附動(dòng)力學(xué)行為直接決定著使用時(shí)的操作方式，并且還能揭示出內(nèi)在的吸附行為規(guī)律。

通過測(cè)試不同時(shí)間點(diǎn)上溶液中自由溶菌酶的濃度，根據(jù)公式可以計(jì)算在該時(shí)間點(diǎn)上的吸附量，進(jìn)而繪制磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。溶菌酶磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物MIP和對(duì)照復(fù)合物顆粒NIP的動(dòng)力學(xué)吸附曲線如圖所示。

圖5　磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物和非印跡復(fù)合物的吸附動(dòng)力學(xué)圖Fig. 5 Binding kinetics of MIP and NIP

從圖中可以看出，MIP對(duì)模板蛋白溶菌酶分子的吸附能力要高于NIP，且吸附量都隨著時(shí)間的增加而迅速增加， 在短短的10 min達(dá)到吸附平衡狀態(tài)，吸附容量接近30 mg/g；這種現(xiàn)象的出現(xiàn)主要是由于減少了硅膠層的包覆，從磁響應(yīng)性能上反應(yīng)出這種表面印跡聚合物具有更好的磁性能；從吸附動(dòng)力學(xué)性能上看，磁性納米顆粒表面的羧基也參與到印跡吸附的過程中，與溶菌酶蛋白分子之間具有較強(qiáng)的靜電相互作用，將溶菌酶分子迅速拉近磁性復(fù)合物顆粒表面；而溶菌酶磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物MIP的表面存在大量未被占據(jù)的對(duì)溶菌酶分子有很高親和性的印跡作用空穴，這些印跡空穴可以快速吸附模板分子溶菌酶，使其在較短時(shí)間內(nèi)快速占據(jù)印跡空穴，因而此階段內(nèi)MIP的吸附速率增長較快，表現(xiàn)在吸附曲線上就是曲線斜率較大，表現(xiàn)出非?？斓奈竭^程。當(dāng)表面的印跡空穴被占據(jù)后則阻礙溶菌酶分子向內(nèi)部傳質(zhì)，從而使吸附速度迅速趨于穩(wěn)定，達(dá)到吸附平衡狀態(tài)。大多數(shù)印跡空穴位于載體表面，從而提高了吸附動(dòng)力學(xué)性能，這也體現(xiàn)出表面印跡的優(yōu)勢(shì)。對(duì)比于大多數(shù)已經(jīng)報(bào)道的文章中達(dá)到吸附平衡所需時(shí)間大約在20 min或者更長［1， 2， 7］，本文測(cè)得的吸附動(dòng)力學(xué)性能表現(xiàn)要更好；另一方面，在MIP上形成了很多與模板蛋白溶菌酶的形狀、大小和功能基團(tuán)相匹配的印跡立體空穴，這些印跡空穴可以專一的識(shí)別和吸附目標(biāo)蛋白分子，而在NIP上沒有形成跟和溶菌酶蛋白分子相匹配的印跡空穴，只存在一些非印跡孔穴，從而使得MIP的吸附量要大于NIP。通過計(jì)算可以發(fā)現(xiàn)，印跡因子達(dá)到1.87。此處非?？斓奈絼?dòng)力學(xué)性能得益于新設(shè)計(jì)的磁性表面印跡復(fù)合物制備方法。

3.6磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物的吸附動(dòng)力學(xué)模型分析

進(jìn)一步通過準(zhǔn)二階動(dòng)力學(xué)方程來描述固體吸附劑對(duì)溶液中溶質(zhì)的吸附動(dòng)力學(xué)行為。

準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程表達(dá)式如式1-4所示：

式1-4中，h為初始吸附速率常數(shù)，h=k2Qe2，mg/（g min）；Qe和Qt分別是平衡時(shí)刻和對(duì)應(yīng)的t時(shí)刻的吸附容量，mg/g；k2是準(zhǔn)二階動(dòng)力學(xué)常數(shù)，mg/（g min）；h代表準(zhǔn)二階動(dòng)力學(xué)模型的起始吸附速率，mg/（g min）。通過線性擬合并根據(jù)t/Qt與t之間的線性相關(guān)系數(shù)r2來判斷是否合適。

圖6　磁性印跡復(fù)合物顆粒和非印跡復(fù)合物顆粒的吸附動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬和結(jié)果Fig. 6 Pesudo-second-order fit results of binding kinetics for MIP and NIP

從圖5中可以看到，相關(guān)系數(shù)r2都大于0.999，說明本章實(shí)驗(yàn)的吸附行為都滿足準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。該吸附過程中的限速環(huán)節(jié)受到化學(xué)吸附過程的控制，吸附容量大小與固體顆粒表面作用位點(diǎn)數(shù)量成正比。經(jīng)過計(jì)算得到相應(yīng)的計(jì)算平衡吸附容量分別為15.576和29.070 mg/g，與實(shí)際測(cè)量值很接近。

3.7溶菌酶磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物的吸附選擇性測(cè)試

為進(jìn)一步檢驗(yàn)溶菌酶磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物對(duì)目標(biāo)蛋白溶菌酶（Lyz，Mw 14.4kDa，pI 11）的吸附選擇性，選取牛血清白蛋白（BSA， Mw 64.5kDa，pI 4.7），卵清白蛋白（OVA， Mw 45 kDa，pI 4.6）作為對(duì)照蛋白，測(cè)試磁性聚合物顆粒對(duì)這幾種蛋白的吸附行為。測(cè)試結(jié)果作圖如下：

圖7 表面印跡磁性復(fù)合物顆粒和非印跡復(fù)合物顆粒的吸附選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 7 Binding selectivity of MIP and NIP

從圖6可以看出，磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物MIP對(duì)目標(biāo)蛋白溶菌酶的吸附量最大，而MIP對(duì)對(duì)照蛋白的吸附量與非印跡聚合物NIP顆粒的吸附量區(qū)別不大，說明表現(xiàn)出非特異性吸附行為。這主要是由于模板蛋白溶菌酶分子比對(duì)照蛋白分子的體積要小，所以制備的印跡聚合物MIP表面的印跡空穴相對(duì)較小，空間位阻比較大，對(duì)照蛋白很難進(jìn)入空穴，因而造成吸附主要是非特異性吸附；另一方面，在pH 6.5條件下，對(duì)照蛋白也是帶有負(fù)電荷，由于靜電排斥作用的存在，導(dǎo)致對(duì)照蛋白的吸附量比NIP的非特異性吸附還要小。

通過計(jì)算得到不同對(duì)照蛋白的選擇因子結(jié)果列于下表1中。

表1　表面印跡磁性復(fù)合物顆粒和非印跡復(fù)合物顆粒的吸附選擇性因子計(jì)算結(jié)果Table 1 Selectivity coefficiency （SC） of MIP and NIP

從表1中結(jié)果可以看出，溶菌酶磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物MIP于對(duì)照蛋白BSA和OVA的選擇性因子都超過1.5，表現(xiàn)出較好的吸附選擇性。

綜上所述，溶菌酶磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物MIP表面存在能與模板蛋白溶菌酶在空間結(jié)構(gòu)上互補(bǔ)且具有印跡吸附作用位點(diǎn)的印跡空穴，能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白產(chǎn)生更強(qiáng)的親和吸附作用，因而表現(xiàn)出吸附選擇性；而非印跡聚合物NIP顆粒主要是依靠非特異性相互作用吸附各種蛋白分子。

4　結(jié)論

磁性納米顆粒表面印跡復(fù)合物能提供選擇性吸附能力和磁性分離特性，在生命科學(xué)領(lǐng)域具有重大應(yīng)用前景。本文采用新設(shè)計(jì)的方法，簡化合成過程，提高了磁響應(yīng)特性和快速分離的能力；同時(shí)，產(chǎn)生的更強(qiáng)的靜電相互作用有助于實(shí)現(xiàn)非常快速達(dá)到吸附平衡。吸附選擇性實(shí)驗(yàn)表明制備得到的印跡聚合物具有選擇性識(shí)別能力。這些性能的改善和提升對(duì)磁性表面印跡復(fù)合物的實(shí)際應(yīng)用非常重要。

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羅愛芹（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯锓蛛x、分析技術(shù)及其應(yīng)用，電子郵箱：aqluobit@163.com。

中圖分類號(hào)：TQ028.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:[CLC Number] TQ028.1[Document Code] A10.11967/2016140307 10.11967/2016140307

作者簡介：?楊戍，男，博士研究生，研究方向?yàn)榉肿佑≯E技術(shù)與相關(guān)應(yīng)用，電子郵箱：1295698925@qq.com；

Preparation and Binding Property Characterization of Lysozyme Surface Imprinted Magnetic Nanoparticles

Shu Yang，Xin Zhang， Rui Jiang， Liquan Sun， Aiqin Luo*
（ School of Life， Beijing Institute of Technology， Beijing 100081 ）

Abstract:Due to protein' s large molecule size and flexible conformation, protein imprinting is still facing big challenge. In this paper, a novel preparation method for the preparation of protein surface imprinting is presented. A carboxyl functionalized magnetic core was firstly prepared by one-step solvo-thermal method, then magnetic core surface was functionalized with vinyl group with simple one step, followed by enhanced acrylamide imprinting process. This process avoids multi-steps functionalization, possible aggregation and too thick surface coating. High saturation magnetization enables fast magnetic separation of the magnetic nanoparticles. Binding experimental results demonstrated that the imprinted magnetic nanoparticles could reach binding equilibrium within 10min, which shows a very fast binding kinetics. And analysis showed that they agreed with pseudo-second-order binding kinetics model. Further binding selectivity experiments demonstrated lyz-surface imprinted magnetic nanoparticles could selectively absorb target protein.

Key Words:Lysozyme; Surface imprinting; Magnetic nanoparitcles; Binding property