葉麗萍， 鐘鳳林， 林義章， 林琳琳

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院， 福州 350002)

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外源NO對(duì)銅脅迫下小白菜SBPase基因表達(dá)特性及其光合速率的影響

葉麗萍， 鐘鳳林， 林義章*， 林琳琳

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院， 福州 350002)

【目的】本研究通過(guò)克隆小白菜光合暗反應(yīng)中限制核酮糖-1, 5-二磷酸(RuBP)再生的關(guān)鍵酶景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase，SBPase)基因，分析銅脅迫及添加外源一氧化氮(NO)供體硝普鈉(SNP)緩解銅脅迫時(shí)該基因的表達(dá)情況，并將其與對(duì)應(yīng)處理下小白菜凈光合速率(Pn)的變化情況結(jié)合在一起進(jìn)行分析，以期為全面了解外源NO緩解銅脅迫植物光合作用機(jī)理提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳孕“撞似贩N“上海青”34片真葉大的幼苗為材料，采用RT-PCR技術(shù)克隆小白菜SBPase基因，銅處理濃度為200 μmol/L，外源NO供體SNP濃度為300 μmol/L，同時(shí)設(shè)置相關(guān)的4個(gè)對(duì)照組排除其他可能因素的干擾，在添加處理液后的0、 4、 8、 12 d上午九點(diǎn)測(cè)定各處理小白菜相同節(jié)位葉片的凈光合速率，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)在對(duì)應(yīng)的處理時(shí)間及對(duì)應(yīng)節(jié)位小白菜葉片中SBPase基因的表達(dá)情況。試驗(yàn)環(huán)境條件為光照強(qiáng)度200 μmol/(m2·s)，光周期12 h，溫度25℃/18℃?！窘Y(jié)果】 1)克隆得到小白菜SBPase基因(Genbank登錄號(hào)：AHY18974.1)，開(kāi)放閱讀框?yàn)?182 bp，編碼393個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為42.34kD，理論等電點(diǎn)為5.85。2)序列分析表明其含有氧化還原活性位點(diǎn)，包含一個(gè)具有59個(gè)氨基酸殘基的葉綠體轉(zhuǎn)移肽序列。小白菜SBPase基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種中已分離的SBPase編碼的氨基酸序列具有很高的同源性。3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，SBPase基因在銅脅迫下的小白菜葉片中表達(dá)量下降，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)下降程度加劇；而在銅脅迫的基礎(chǔ)上添加外源NO可以在一定程度上緩解銅脅迫引起的小白菜葉中SBPase基因表達(dá)量的下降。4)銅脅迫下小白菜葉片Pn顯著下降，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Pn下降加劇，施加外源NO后Pn的下降得到一定程度的緩解，各處理下Pn的變化與SBPase基因表達(dá)量變化趨勢(shì)一致。【結(jié)論】銅脅迫及在銅脅迫的基礎(chǔ)上添加外源NO后小白菜葉片中SBPase基因表達(dá)量的變化，可能是影響對(duì)應(yīng)條件下小白菜葉片的凈光合速率變化的原因之一。

小白菜； 銅脅迫； 一氧化氮； 景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，它的強(qiáng)弱對(duì)于植物的生長(zhǎng)、 產(chǎn)量及抗逆性有著重要的影響。光合暗反應(yīng)又稱為卡爾文循環(huán)，是高等植物碳固定的基本途徑，其反應(yīng)過(guò)程由RuBP為起點(diǎn)至RuBP再生結(jié)束。景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase)是限制光合作用卡爾文循環(huán)中RuBP再生速率的關(guān)鍵酶，也是植物光合作用途徑的主要限速酶之一[1]。CO2受體RuBP由景天庚酮糖-7-磷酸轉(zhuǎn)變而來(lái)，景天庚酮糖-7-磷酸由SBPase酶不可逆地催化景天庚酮糖-1，7-二磷酸去磷酸化生成[2]。前人研究表明[3-5]，將SBPase基因反向?qū)霟煵葜?，發(fā)現(xiàn)SBPase活性的微小下降即可導(dǎo)致反義轉(zhuǎn)基因植株碳同化速率的顯著下降，植株生長(zhǎng)受到抑制。Lawson等[6]研究表明，當(dāng)SBPase活性或SBPase基因表達(dá)量下降時(shí)，植物的光合能力，生長(zhǎng)速度以及生物量的積累均下降。可見(jiàn)SBPase酶對(duì)光合作用強(qiáng)弱起著重要的調(diào)控作用。

銅是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素，但是過(guò)量的銅卻會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[7]。近年來(lái)隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上含銅殺菌劑的頻繁使用、 銅礦的過(guò)度開(kāi)采及工業(yè)生產(chǎn)中含銅污染物的大量排放，使得土壤中的銅含量越來(lái)越高，影響著蔬菜的品質(zhì)和產(chǎn)量[8-11]。植物受到銅脅迫后葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，光合速率明顯下降[12]。外源NO是一種生物活性氣體分子[13]，研究表明其在保護(hù)植物抵抗重金屬毒害等非生物脅迫引起的植物光合作用的下降方面有著重要的作用[14-16]。

目前，關(guān)于外源NO緩解銅脅迫下植物光合作用的相關(guān)研究主要集中在植物形態(tài)及生理生化指標(biāo)變化方面，研究表明[14, 17-18]施加適宜濃度的外源NO可以顯著提高番茄、 玉米、 黃瓜、 油菜在銅、 鎘脅迫下的凈光合速率，但關(guān)于外源NO對(duì)銅脅迫下植物光合碳同化過(guò)程重要酶對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)是否產(chǎn)生影響，及其變化情況與光合作用變化的對(duì)應(yīng)關(guān)系研究較少。小白菜(BrassicachinensisL.)為十字花科蕓薹屬蔬菜，營(yíng)養(yǎng)豐富、 味道鮮美，適應(yīng)性強(qiáng)，四季均有，栽培周期短，廣泛栽培，備受人們喜愛(ài)。本研究以小白菜為試驗(yàn)材料，克隆小白菜的SBPase基因序列，并研究外源NO對(duì)銅脅迫下小白菜SBPase基因表達(dá)量的變化與小白菜光合速率的對(duì)應(yīng)關(guān)系的影響，為全面了解外源NO緩解銅脅迫植物光合作用機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院溫室內(nèi)進(jìn)行。供試小白菜品種為“上海青”，采用穴盤(pán)育苗，待幼苗長(zhǎng)到34片真葉時(shí)，選取生長(zhǎng)一致、 健壯的幼苗將其移至裝有12 L通用葉菜類(lèi)水培營(yíng)養(yǎng)液的塑料盆中，每盆18株，緩苗5 d后移入處理液中。NO供體SNP購(gòu)自Sigma公司。處理?xiàng)l件為光照強(qiáng)度200 μmol/(m2·s)、 光周期12 h、 溫度25℃/18℃。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理： 1)對(duì)照，完全營(yíng)養(yǎng)液(CK)； 2)200 μmol/L CuSO4·7H20(Cu)； 3)200 μmol/L CuSO4·7H20+300 μmol/L SNP(Cu+S)； 4)200 μmol/L CuSO4·7H20+ 300 μmol/L NaNO2+300 μmol/L NaNO3(Cu+N)； 5)200 μmol/L CuSO4·7H20 +300 μmol/L K3[Fe(CN)6](Cu+F)； 6)200 μmol/L CuSO4·7H20 + 300 μmol/L SNP+25 μmol/L Nitro-L-arginine(NO抑制劑)(Cu+S+L)。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每4 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液(每次取樣后更換營(yíng)養(yǎng)液)，在處理后的0、 4、 8、 12 d上午九點(diǎn)測(cè)定各處理植株第3片完全展開(kāi)的功能葉的凈光合速率，并取相同節(jié)位的功能葉用液氮速凍后保存于-80℃的冰箱中備用。

1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法

1)小白菜葉片凈光合速率測(cè)定采用美國(guó)生產(chǎn)的CI-340便攜式光合測(cè)定儀，于上午九點(diǎn)測(cè)定植株第3片完全展開(kāi)的功能葉的凈光合速率(Pn)。

2)小白菜葉片總RNA提取與cDNA合成采用Trizol法提取小白菜葉片總RNA(Trizol購(gòu)于Invitrogen公司)，并對(duì)所獲得的總RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)和OD值的測(cè)定。利用RevertAit First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Thermo公司)，將所提取的質(zhì)量較高的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為模板。

3)SBPase基因的克隆 RT-PCR引物序列為，SBPaseF： 5′-ATGGAGACCAGCATCGCGTGCT-3′；SBPaseR： 5′-AGTTTCTAAGCGGTAACTCC-3′。

RT-PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)體系為1 μL cDNA、 1 μLSBPaseF、 1 μLSBPaseR、 2.5 μL 10×Ex-taqbuffer、 0.2 μL Ex-Taq(5U/μL)、 0.5 μL dNTP(10 mmol/L)、 加ddH2O至體積25 μL。RT-PCR反應(yīng)步驟： 94℃ 5 min； 94℃ 45 s，52℃ 40 s，72℃ 75 s，共35個(gè)循環(huán)； 72℃ 10 min。

4)SBPase基因的生物信息學(xué)分析利用相關(guān)軟件分析小白菜SBPase編碼的氨基酸序列，即用Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進(jìn)行同源序列搜索；用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)基本的理化性質(zhì)；用ProScal (http://web.expasy.org/protscale/) 默認(rèn)算法(Hphob./Kyte&Doolittle)預(yù)測(cè)該蛋白的疏水性；用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 預(yù)測(cè)信號(hào)肽；應(yīng)用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)；用MEGA5.2構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

5)SBPase基因的特異性表達(dá)分析分別提取處理0、 4、 8、 12 d的小白菜葉片總RNA，控制用于逆轉(zhuǎn)錄的RNA起始濃度相同，用SuperscriptTMШ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR試劑盒合成cDNA。利用小白菜actin為內(nèi)參基因(引物為actin-qF5′-GTCCTGTTCCAGCCTTCGTTC-3′，actin-qR5′-CAAG TCCTTCCTGATATCCACGTC-3′)。根據(jù)已得到的小白菜SBPase基因的ORF序列設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物(SBPase-qF：5′-AGGTGGGTTTAGT GTGGCATTTG -3′，SBPase-qR：5′-CTTGATCTCC TCCCGTGACTCC -3′)。用SYBR Premix ExTaq試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)該基因在不同處理、 相同處理不同處理時(shí)長(zhǎng)的表達(dá)情況。

qRT-PCR反應(yīng)體系為： 1 μL cDNA、 0.4 μL上游引物、 0.4 μL下游引物、 10 μL SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)、 加ddH2O2至體積20 μL。Real-time PCR反應(yīng)步驟采用兩步法，95℃ 10 min， 95℃ 15 s， 58℃ 30 s(回到第二步共40個(gè)循環(huán))。

2　結(jié)果與分析

2.1外源NO對(duì)銅脅迫下小白菜葉片凈光合速率的影響

2.2SBPase基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技術(shù)獲得SBPase基因開(kāi)放閱讀框的cDNA序列(圖2)，長(zhǎng)為1182bp(GenBank 登錄號(hào)：AHY18974.1)，推測(cè)其編碼393個(gè)氨基酸，含有起始密碼子ATG和終止密碼子TAG(表1)。

2.3生物信息學(xué)分析

用ProtParam軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，小白菜SBPase基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為42.34 kD，理論等電點(diǎn)為5.85，所帶的正電荷總數(shù)(Arg+Lys)為39，負(fù)電荷總數(shù)(Asp+Glu)為43為堿性蛋白。理論推導(dǎo)半衰期是30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為34.19，為穩(wěn)定蛋白。

圖1　外源NO對(duì)銅脅迫下小白菜葉片凈光合速率的影響Fig.1　Effects of exogenous nitric oxide on the net photosynthetic rate in leaves of Brassica chinensis L. under the copper stress[注(Note): 柱上不同字母表示處理間差異達(dá)5%顯著水平Different letters above the bars mean significant difference at the 5%level.]

序號(hào)SBPase基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2　SBPase基因ORF區(qū)段擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　Amplification product of SBPase[注(Note): M—DL2000; A—SBPase]

利用Expasy對(duì)蛋白質(zhì)親水性、 疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，疏水性氨基酸占42.44%，親水性氨基酸占57.56，該蛋白為親水性蛋白。由圖3可以看出，在圖中所有的SBPase氨基酸序列中，有5個(gè)Cys是保守的，其中的2和3形成CGGTAC結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是很多酶的氧化還原活性位點(diǎn)，參與光的調(diào)節(jié)反應(yīng)[19-20]。由圖3還可以發(fā)現(xiàn)，不同植物的SBPase氨基酸序列的N-末端同源性較低，但它們都具有葉綠體蛋白轉(zhuǎn)移肽的共同特征，即含有較多的絲氨酸，較少的天冬氨酸、 谷氨酸。利用ChloroP 1.1 Prediction Server分析發(fā)現(xiàn)，由小白菜SBPase基因推導(dǎo)的氨基酸序列含有一個(gè)包含59個(gè)氨基酸殘基的葉綠體轉(zhuǎn)移肽序列，這與前人的研究結(jié)果一致[2, 21]。

圖3　小白菜SBPase基因推測(cè)的氨基酸序列與其他植物中該序列的同源性比對(duì)Fig.3　Alignment of amino acid sequence of Brassica chinensis L. SBPase with other species[注(Note): NP 001267658.1—黃瓜Cucumis sativus; XP 006355654.1—馬鈴薯Solanum tuberosum; NP 191139.1—擬南芥Arabidopsis thaliana; XP 002263049.1—葡萄Vitis vinifera; AHY18974.1—小白菜 Brassica chinensis L.]

將小白菜SBPase編碼的蛋白與GenBank中登錄的12個(gè)物種的SBPase蛋白進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建SBPase進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖4所示，小白菜SBPase推測(cè)的氨基酸序列與同為十字花科的擬南芥SBPase的親緣關(guān)系最近，同源性為95.67%。同玉米的SBPase的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，同源性為73.75%。

圖4　小白菜SBPase氨基酸序列與其他物種SBPase氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 Fig.4　Phylogenetic tree of amino acid sequences of Brassica chinensis L. SBPase with other species

圖5　外源NO對(duì)銅脅迫下小白菜葉片中SBPase基因表達(dá)的影響Fig. 5　Effects of exogenous nitric oxide on the expression of SBPase in leaves of Brassica chinensis L. under the copper stress[注(Note): 柱上不同字母表示差異達(dá)5%顯著水平Different letters above the bars mean significant difference at the 5%level.]

2.4外源NO對(duì)銅脅迫下小白菜葉片中SBPase基因表達(dá)特性的影響

由圖5可以看出，200 μmol/L的銅處理小白菜，脅迫4 d時(shí)小白菜葉片中SBPase基因的表達(dá)量顯著下降，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)小白菜葉片中SBPase基因的表達(dá)量下降程度加劇，而在銅脅迫的基礎(chǔ)上同時(shí)外施300 μmol/L的SNP處理(Cu+S)，能提高銅脅迫下小白菜葉片SBPase基因的表達(dá)量，但其表達(dá)量仍低于對(duì)照處理。在添加NO抑制劑處理后(Cu+S+L)，SNP的緩解效果被消除。在銅處理液中加入300 μmol/L NaNO2/NaNO3(Cu+N)或300 μmol/L K3[Fe(CN)6](Cu+F)，與只添加銅脅迫處理的差異不顯著。說(shuō)明外源NO可以在一定程度上緩解銅脅迫引起的小白菜葉片中SBPase基因表達(dá)量的下降。

3　討論

前人研究表明，在煙草、 番茄、 水稻中SBPase基因表達(dá)量下降及酶活下降時(shí)，其凈光合能力、 生長(zhǎng)速度及生物量的積累都會(huì)明顯下降[3-6]，表明SBPase基因表達(dá)量及酶活的變化會(huì)對(duì)植物光合作用的變化產(chǎn)生相應(yīng)的影響。Wang等[15]研究表明低溫脅迫下，番茄葉片的SBPase基因表達(dá)量及SBPase酶活性降低，且番茄葉片的Pn出現(xiàn)同樣的變化趨勢(shì)，表明部分非生物脅迫引起的植物葉片中的SBPase基因表達(dá)量下降，是植物在對(duì)應(yīng)脅迫下光合速率下降的原因之一。本研究結(jié)果表明，銅脅迫4 d就會(huì)引起小白菜葉片中的SBPase基因表達(dá)量出現(xiàn)顯著的下降，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SBPase表達(dá)量下降加??；在銅脅迫4 d時(shí)小白菜葉片的Pn也降低，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)Pn下降加劇，即小白菜受到銅脅迫時(shí)SBPase表達(dá)量與Pn的值均呈下降趨勢(shì)。在銅脅迫的基礎(chǔ)上施加適宜濃度的SNP處理后小白菜葉片的SBPase的表達(dá)量增加，且小白菜葉片中Pn也出現(xiàn)同樣的升高趨勢(shì)。崔金霞[22]研究也表明適宜濃度的SNP處理，可以提高黃瓜葉片中多個(gè)參與卡爾文循環(huán)過(guò)程的酶對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)水平。本研究結(jié)果表明小白菜葉片中SBPase表達(dá)量的變化可能是引起小白菜在銅脅迫及銅脅迫的基礎(chǔ)上添加外源NO時(shí)小白菜葉片凈光合速率出現(xiàn)相應(yīng)的降低或升高的原因之一。

[1]Anja S, Marco B, Rudiger H. Overexpression of the potential herbicide target sedoheptrlose from spinacia oleracea in transgentic tobacco[J]. Molecular Breeding, 2002, 99(1): 53-61.

[2]冀憲領(lǐng), 蓋英萍, 馬建平, 等. 桑樹(shù)景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶基因的克隆、 原核表達(dá)與植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 林業(yè)科學(xué), 2008, 44(3): 62-69.

Ji X L, Gai Y P, Ma J P,etal. Cloning and prokaryotic expression of the sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase cDNA from mulberry and construction of plant expression vector[J]. Scientia Silvae Sinicea, 2008, 44(3): 62-69.

[3]Raines, C A, Harrison E P, Olcer H,etal. Investigating the role of thethiolregu-lated enzyme sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase in the control of photosynthesis[J]. Plant Physiology, 2000, 110(2): 303-308.

[4]Olcer H, Lloyd J C, Raines C A,etal. Photosynthetic capacity is differentially affected by reductions in sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase activity during leaf development in transgentic tobacco plants[J]. Plant Physiology, 2001, 125(2): 982-989.

[5]Raines C A. The calvin cycle revisited[J]. Photosynthesis Research, 2003, 75(1): 1-10.

[6]Lawson T, Bryant B, Lefebver S. Decreased SBPase activity alters growth and development in transgenic tobacco plants[J]. Plant Cell and Environment, 2006, 29(1): 48-58.

[7]王松華, 楊志敏, 徐朗萊. 植物銅毒害及其抗逆性機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)環(huán)境, 2003, 12(3): 336-341.

Wang S H, Yang Z M, Xu L L. Research progress of plant copper toxicity and mechanism of resistance[J]. Ecology and Environment, 2003, 12(3): 336-341.

[8]林義章, 徐磊, 林碧英. Cu脅迫對(duì)小白菜保護(hù)酶系統(tǒng)及其他相關(guān)抗性指標(biāo)的影響[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 36(4): 369-372.

Lin Y Z, Xu L, Lin B Y. Effects of copper stress onBrassicachinensisL. resistant enzyme system and other resistant indexes[J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University, 2007, 36(4): 369-372.

[9]徐磊, 林義章. 銅脅迫對(duì)小白菜品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2009, 25(14): 161-163.

Xu L, Lin Y Z. The change ofBrassicachinensisL. quality indicators under the copper stress[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2009, 25(14): 161-163.

[10]林義章, 張淑媛, 朱海生. 銅脅迫對(duì)小白菜葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 16(4): 948-951.

Lin Y Z, Zhang S Y, Zhu H S. Effect of copper stress on ultra-structure of mesophyll cells in Chinese cabbage[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2008, 16(4): 948-951.

[11]林義章, 徐磊. 銅污染對(duì)高等植物的生理毒害作用研究[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2007, 15(1): 201-204.

Lin Y Z, Xu L. Physiological toxicity of copper pollution to higher plant[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2007, 15(1): 201-204 .

[12]Ouzounidou G. Root growth and pigment composition in relationship to element uptake in Silene compact Plants treated with copper[J]. Plant Nutrition, 1994, 17(6): 933-943.

[13]史慶華, 賴齊賢, 朱祝軍, 等. 一氧化氮在植物中的生理功能[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2005, 27(1): 39-42.

Shi Q H, Lai Q X, Zhu Z J,etal. The physiological function of nitric oxide in plant[J]. Chinese Journal of Cell Biology, 2005, 27(1): 39-42.

[14]余肇端. 外源NO緩解黃瓜、 油菜幼苗鎘脅迫的生理效應(yīng)[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文, 2010.

Yu Z D. Physiological alleviating effects of exogenous nitric oxide on the cucumber and Chinese cabbage seedlings under cadmium stress[D]. Tai’an: MS Thesis of Shandong Agricultural University, 2010.

[15]Wang M L, Bi H G, Liu P P,etal. Molecular cloning and expression analysis of the gene encoding sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase fromcucumisstativus[J]. Scientia Horticulturae, 2011, 129(3): 414-420.

[16]樊洪泓, 李延春, 李正鵬, 等. 強(qiáng)光脅迫下外源NO對(duì)霍山石斛葉綠素?zé)晒夂涂寡趸到y(tǒng)的影響[J].園藝學(xué)報(bào), 2008, 35(8): 1215-1220.

Fan H H, Li Y C, Li Z P,etal. Effects of exogenous nitric oxide on the chlorophyⅡ fluorescence and antioxidant system of dendrobium huoshanense under high light stress[J]. Acta Horticulterae Sinica, 2008, 35(8): 1215-1220.

[17]張義凱, 崔秀敏, 楊守祥, 等. 外源NO對(duì)鎘脅迫下番茄活性氧代謝及光合特性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 21(6): 1432-1438.

Zhang Y K, Cui X M, Yang S X,etal. Effects of exogenous nitric oxide on active oxygen metabolism and photosymthetic characteristics of tomato seedling under cadmium stress[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2010, 21(6):1432-1438.

[18]鐘韜韜. 外源NO對(duì)銅脅迫玉米幼苗生理生化特性的影響[D]. 南昌: 南昌大學(xué)碩士論文, 2012.

Zhong T T. Physiological and biochemical effects of exogenous nitric oxide on seedlings of maize (ZeamaysL.) under copper stress[D]. Nanchang: MS Thesis of Nanchang University, 2012.[19]Fox B S, Walsh C T. Mercuric reductase: homology to glutathione reductase and lipoamide dehydrogenase.Iodoacetamide alkylation and sequence of the active site peptide[J]. Biochemistry, 1983, 22(17): 4082-4088.

[20]Dunford R P, Catley M A, Raines C A,etal. Expression of wheat sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase inE.coliand affinity purification of functional protein[J]. Protein Expression and Purification, 1998, 14(1): 139-145.

[21]Nishizawa A N, Buchanan B B. Enzyme regulation in C4 photosynthesis. Purification and properties of thioredoxin-linked fructose bisphosphatase and sedoheptulose bisphosphatase from corn leaves[J]. Journal Biological Chemistry, 1981, 256(12): 6119-6126.

[22]崔金霞. 一氧化氮和MAPK在油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)黃瓜抗氧化防御中的作用[D]. 杭州: 浙江大學(xué)博士論文, 2010.

Cui J X. The role of nitric oxide and MAPK in brassinosteroids-induced antioxidant defense inCucumissativus[D]. Hangzhou: PhD Dissertation of Zhejiang University, 2010.

[23]王麗娜, 楊鳳娟, 王秀峰, 等. 外源NO對(duì)銅脅迫下番茄幼苗生長(zhǎng)及其抗氧化酶編碼基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2010, 37(1): 47-52.

Wang L N, Yang F J, Wang X F,etal. Effects of exogenous nitric oxide on growth and transcriptional expression of antioxidant enzyme mRNA in tomato seedings under copper stress[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2010, 37(1): 47-52.

[24]陳蕤, 崔盛, 唐江川, 等. NO對(duì)百草枯脅迫下玉米胚根氧化損傷的效應(yīng)[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 21(4): 479-485.

Chen R, Cui S, Tang J C,etal. Effects of treatment of nitric oxide (NO) on active oxygen species damages in maize radical under MV stress[J]. Journal of Yunnan Agricultural University, 2006, 21(4): 479-485.

Effects of exogenous nitric oxide onSBPasegene expression characteristics and photosynthetic rate ofBrassicachinensisL. under copper stress

YE Li-ping, ZHONG Feng-lin, LIN Yi-zhang*, LIN Lin-lin

(CollegeofHorticulture,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China)

【Objectives】 In order to provide a theoretical basis for comprehensive understanding mechanism of adding exogenous nitric oxide(NO) to alleviate the decline of net photosynthetic rate(Pn), the gene of sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase (SBPase) which is one of the key enzymes to restrict RuBP regeneration in calvin cycle was cloned, and the different expression of theSBPasegene inBrassicachinensisL. leaves under copper stress and adding theSNPwas analyzed combined with the net photosynthetic rate changes. 【Methods】 TheSBPasegene ofBrassicachinensisL. was cloned by RT-PCR, and seedlings ofBrassicachinensisL. (named Shanghai green) with three to four real leaves were used as materials. Copper concentration was 200 μmol/L, and the SNP concentration was 300 μmol/L. At the same time, four related groups were set to exclude the disruptive factors. The Pn and the expression ofSBPasegene ofBrassicachinensisL. leaves at the same position and moment after the treatment of 0, 4, 8 and 12 days were determined. The environmental conditions of the experiment were light intensity, 200 μmol/(m2·s); photoperiod, 12 h; and temperature, 25℃/18℃.【Results】1) The sequence of the open reading frame ofSBPase gene is 1182bp, encoding 393 amino acids. The molecular weight of the predicted protein is 42.34kD and the theoretical isoelectric point is 5.85. 2) The sequence analysis show that it contains a redox active site and a 59-amino acid chloroplast transfer peptide. The amino acid sequence has high homology with other SBPase separated from other species. 3) The qRT-PCR analysis show that theSBPasegene expression inBrassicachinensisL.leaves is declined under copper stress, and with time extending the degree of decline is aggravated. Besides, the expression ofSBPasegene is increased after the addition of NO. 4) The application of exogenous NO increases the Pn ofBrassicachinensisL. leaves under the copper stress, and the variation tendency of Pn and the expression ofSBPasegene are in a good agreement. 【Conclusions】The expression ofSBPasegene inBrassicachinensisL. leaves is changed under the copper stress and the addition of NO, which may be one of the causes of the change of Pn inBrassicachinensisL. under the copper stress and the addition of NO.

BrassicachinensisL.; copper stress; NO; sedoheptulose-1,7-bisphosphatase; real-time PCR

2014-12-08接受日期： 2015-05-28網(wǎng)絡(luò)出版日期： 2015-09-29基金項(xiàng)目: 福建省大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)體系(2012K83139294)； 福建省自然科學(xué)基金(2012j01082)； 福建農(nóng)林大學(xué)校重點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目(6112c0409)資助。

葉麗萍(1989—)， 女， 福建浦城人， 碩士研究生， 主要從事蔬菜遺傳育種方面的研究。 E-mail: yeliping1202@163.com

E-mail: lyz2003007@163.com

S634.3.601； Q945.78

A

1008-505X(2016)03-0736-08