薛　原，禹靄靈，張彥龍，何　瑩，呂九云，王麗萍，柴龍會，孫　穎，黃顯光，華育平

（1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北虎林園，黑龍江 哈爾濱 150040）

圈養(yǎng)虎源大腸桿菌耐藥性和整合子特性分析

薛原1，禹靄靈1，張彥龍1，何瑩1，呂九云1，王麗萍1，柴龍會1，孫穎1，黃顯光2，華育平1

（1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北虎林園，黑龍江 哈爾濱 150040）

對東北虎林園分離的具有耐藥性的大腸桿菌進(jìn)行了整合子-基因盒的研究，結(jié)果表明：61株分離菌中整合酶Ⅰ檢出率為52.46%，整合酶Ⅱ和整合酶Ⅲ均沒檢出。分離株對阿莫西林/克拉維酸、氨曲南和安普霉素較敏感；對氨芐青霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明高度耐藥。序列分析表明，含有3種基因盒，分別是dfrA15、dfrA12和aadA2。

東北虎；耐藥性；大腸桿菌；整合子—基因盒

抗菌療法用于治療臨床感染效果十分顯著，但是耐藥菌的出現(xiàn)對于人類、動物和環(huán)境是一個全球性的公共衛(wèi)生問題。臨床分離株耐藥性增加的原因可能是由于抗生素的選擇壓力和整合子中的廣泛存在。整合子是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種可移動基因元件，通過位點特異性重組捕獲并表達(dá)外源性基因盒。這是導(dǎo)致耐藥基因在細(xì)菌間水平傳播的重要原因。因此，本項研究對圈養(yǎng)虎源耐藥性大腸桿菌菌株進(jìn)行了篩選和分析。

1　材料

1.1菌株質(zhì)控菌：大腸桿菌ATCC25922，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；臨床菌株：2012-2013年從東北虎林園分離的61份大腸桿菌。

1.2藥品阿莫西林/克拉維酸（AMC）、氨芐西林（AMP）、安普霉素（APR）、頭孢噻吩（CEF）、環(huán)丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OF）、諾氟沙星（NOR）、恩諾沙星（EN）、氨曲南（ATM）、慶大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、氯霉素（CMP）、多西環(huán)素（DOX）、復(fù)方新諾明（SXT）、氟苯尼考（FFC）、多黏菌素B（PB）、四環(huán)素（TET），購自杭州天和微生物試劑有限公司。

2　方法

2.1細(xì)菌的分離、純化及培養(yǎng)將從東北虎林園采集的新鮮糞樣分別于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)瓊脂平板上培養(yǎng)，革蘭染色鏡檢，生化鑒定。

2.2藥敏試驗采用WHO推薦的Kirby-Bauer法[1]。依據(jù)CLSI有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，每次測定均以質(zhì)控菌為對照，只有當(dāng)質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)測試菌株結(jié)果才有效。

2.3整合酶基因檢測采用25 μL PCR擴(kuò)增體系：2.5 μL 10×Buffer，2 μL dNTP，上下游引物各1 μL。設(shè)計整合酶Ⅰ基因、Ⅱ基因、Ⅲ基因擴(kuò)增引物。循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53.9℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。

2.4整合子-基因盒插入?yún)^(qū)的檢測設(shè)計整合子基因盒插入?yún)^(qū)擴(kuò)增引物。

2.5DNA序列分析擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接到pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，測序結(jié)果經(jīng)Blast檢索GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得同源信息，分析其可能的功能。

3　結(jié)果

3.1藥敏試驗結(jié)果61株虎源大腸桿菌對17種抗菌藥物均有不同程度的耐藥性，藥敏結(jié)果見圖1。菌株對阿莫西林/克拉維酸、氨曲南和安普霉素有較高的敏感率，分別是73.66%、71.46%、71.71%。菌株對氨芐青霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明有較強(qiáng)的耐藥性，分別是100.00%、85.12%、80.24%。見圖1。

圖1　61株大腸桿菌對17種抗菌藥物的體外藥敏試驗結(jié)果

3.2整合酶基因和基因盒檢測結(jié)果I型整合酶基因PCR產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相符，經(jīng)測序和序列同源性分析，與GenBank中I型整合酶基因同源性為99%。61株大腸桿菌中32株I型整合酶基因擴(kuò)增為陽性，檢出率為52.46%，Ⅱ型整合酶和Ⅲ型整合酶均未檢出，見圖2。存在2種明顯的基因盒特征dfrA15和dfrA12-aadA2。見圖3、表1。

圖2　部分I型整合酶基因PCR產(chǎn)物的電泳圖譜

圖3　PCR擴(kuò)增基因盒插入?yún)^(qū)電泳結(jié)果

表1　大腸桿菌的耐藥模式與整合子-基因盒的關(guān)系

4　討論

國內(nèi)外對于圈養(yǎng)野生動物和野生動物的耐藥性研究報道較少。針對圈養(yǎng)野生動物和野生動物的耐藥性研究，具有重要的生態(tài)學(xué)意義。同時對于野生動物細(xì)菌感染性疾病的防治和物種的保護(hù)具有積極的意義。從本研究可以看出，東北虎林園的受試虎源大腸桿菌對試驗所采用的17種抗生素均有不同程度耐藥性。分離的菌株中對氨芐西林的耐藥比例高達(dá)到100%。同時也看出，受試大腸桿菌對阿莫西林/克拉維酸、氨曲南和安普霉素敏感性相對較高，敏感比例達(dá)到70%以上。虎源耐藥性的產(chǎn)生原因可能是圈養(yǎng)虎日常食用家畜家禽，耐藥質(zhì)粒通過食物鏈進(jìn)行傳播。另外一個主要的原因是圈養(yǎng)虎的疾病防治過程中抗菌藥物的使用。因此，應(yīng)定期對菌株進(jìn)行抗生素敏感性的監(jiān)測。以臨床用藥或在飼料中添加藥物時，盡量不要長期大量使用同幾種藥物，以免影響臨床治療效果及細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散。

整合子可捕獲和整合細(xì)菌的耐藥基因，在細(xì)菌耐藥性的傳播和擴(kuò)散中起到了至關(guān)重要的作用[3]。本研究采用PCR技術(shù)擴(kuò)增特異性的整合酶基因，調(diào)查Ⅰ型整合子的存在及流行情況。結(jié)果表明，虎源大腸桿菌Ⅰ型整合子流行普遍，61株大腸桿菌中32株檢出Ⅰ型整合子，檢出率達(dá)52.46%?；⒃创竽c桿菌Ⅰ型整合子攜帶有aadA、dfrA等。整合子中最常見的基因盒為dfrA15（甲氧芐啶耐藥基因）、aadA2（鏈霉素、大觀霉素耐藥基因），最主要的基因盒排列為dfrA15。與朱小玲等[4]報道的多重抗藥大腸桿菌Ⅰ型整合子的平均檢出率高，大多數(shù)整合aadA基因和dfrA基因相似。這表明Ⅰ型整合子廣泛分布于大腸桿菌中。為了減少整合子介導(dǎo)和傳播細(xì)菌耐藥性，必須合理使用抗生素，減少抗生素的選擇性壓力。

[1]Khan A，Dass C，Ramamurthy T，et al.Antibiotic resistance，viru?lence gene，and molecular profiles of Shiga toxin producing Esch?erichia coli isolates from diverse sources in calcutta[J].India.J Clin Microbiol，2002，40（6）：2009-2015.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；16th information?al supplement.Document M100-S16.CLSI[J].Wayne，PA.2009：1-123.

[3]Gu B，Pan S，Wang T，et al.Novel cassette arrays of integrons in clinical strains of Enterobacteriaceae in China[J].Int J A ntimi?crob A gents，2008，32（6）：529-533.

[4]朱小玲，沈建忠，劉玉慶.多重抗藥大腸桿菌中Ⅰ型整合子的分布與抗藥關(guān)系[J].中國人獸共患病學(xué)報，2009，25（2）：135-138.

Characterization of integron-mediated antimicrobial resistanceamong Escherichia colistrains isolated from A CaptivePopulation OF Amur tiger

XUE Yuan1，YU Ai-ling1，ZHANG Yan-long1，HE Ying1，LV Jiu-yun1，WANG Li-ping1，CHAI Long-hui1，SUN Ying1，HUANG Xian-guang2，HUA Yu-ping1
（1.College of Wildlife Resources of Northeast Forest University，Harbin 150040，China；2.The siberian Tiger park，Harbin 150040，China）

The present study was performed to identify and characterize integrons and integrated resistance gene cassettes among multidrug resistant Escherichia coli isolates from a captive population of Amur tigers in China.Among the isolates，52.46% （32 of 61）were positive for intI1，but no isolates carried intI2 or intI3.Most isolates were susceptible to amoxicillin/clavulanic ac?id，aztreonam and polymyxin B，while they also exhibited high incidence rates of resistance to ampicillin，doxycycline，chloram?phenicol，tetracycline and trimethoprim sulfur.Sequencing analysis revealed three gene cassettes，which encoded resistance to dihy?drofolate reductase（dfrA15），dihydrofolate reductase（dfrA12）and adenyltransferase（aadA2）.

Amur tiger；antimicrobial resistance；Escherichia coli；gene cassette

HUA Yu-ping

S858.9

A

0529-6005（2016）07-0087-02

2015-04-16

國家自然科學(xué)基金（31502119）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究（指導(dǎo)）項目（12543010）

薛原（1978-），女，講師，博士，主要從事動物藥理學(xué)與毒理學(xué)方面的研究，E-mail：xueyuan-1978@163.com

華育平，E-mail：huayuping@yeah.net