李軍朝，邸　濤，陳　靜，劉慧謀，張信軍，王彥紅，3

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

1株鸚鵡源多殺性巴氏桿菌的鑒定

李軍朝1，2，邸濤1，2，陳靜1，2，劉慧謀1，2，張信軍1，2，王彥紅1，2，3

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）屬于革蘭陰性球桿菌，定居于家禽和野禽的鼻咽部，能引起宿主出血性敗血癥，發(fā)病率和死亡率都很高，但不同類型的家禽易感性不同。多殺性巴氏桿菌有5個(gè)莢膜血清型，分別為A、B、D、E和F，引起禽類動(dòng)物的多殺性巴氏桿菌莢膜血清型多為A型[1]。此外，有較多技術(shù)對(duì)多殺性巴氏桿菌進(jìn)行分型，其中多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（multilo?cus sequence type analysis，MLST）自2010年在禽源多殺性巴氏桿菌開展研究以來迅速發(fā)展[2]。本試驗(yàn)從1只死亡的鸚鵡臟器中分離到1株多殺性巴氏桿菌，并對(duì)其莢膜血清型和序列型進(jìn)行鑒定。

1　材料與方法

1.1材料綿羊血平板、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基按通用的組方自行配制。其中麥康凱瓊脂粉，購自上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司；瓊脂粉與氯化鈉，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨與胰酶，購自O(shè)XOID公司；綿羊血、腸桿菌科細(xì)菌生化管和藥敏試紙，購自杭州天和微生物試劑有限公司；16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit以及莢膜血清型鑒定所需的試劑，均購自TaKaRa公司；本試驗(yàn)用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2細(xì)菌分離2014年9月，揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院接到1例鸚鵡突然死亡的病例，該鸚鵡死亡之前有輕微垂翅現(xiàn)象，排白綠色糞便，無其他表現(xiàn)。臨床檢查發(fā)現(xiàn)鸚鵡肛門附近羽毛沾有少量糞便。剖檢可見胸肌淤血，肝臟腫大。無菌條件下用接種環(huán)挑取肝臟和心臟部分組織于綿羊血瓊脂平板上，置于37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。24 h后挑取綿羊血瓊脂平板上的單個(gè)菌落分別接種于麥康凱平板和綿羊血瓊脂平板上，置于37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.3生化試驗(yàn)采用微量生化反應(yīng)管對(duì)分離到的菌株進(jìn)行生化指標(biāo)的鑒定，置于37℃培養(yǎng)24 h后觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.416S rDNA基因序列分析根據(jù)文獻(xiàn)記載的煮沸裂解法[3]制取細(xì)菌DNA，然后按照TaKaRa公司16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit說明標(biāo)準(zhǔn)對(duì)模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到500 pb大小的酶切DNA片段后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到目的條帶后切膠測序，結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www. ncbi.nlm.gov/BLAST）進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，鑒定所屬菌種。

1.5莢膜血清型鑒定根據(jù)Townsend等描述的方法[4]，應(yīng)用特異性基因引物capA對(duì)1.4中細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，并用已知的細(xì)菌作為陽性對(duì)照[5]。

1.6多位點(diǎn)序列分析采用多殺性巴氏桿菌的7個(gè)管家基因（adk，est，pmi，zwf，mdh，gdh和pgi）進(jìn)行多位點(diǎn)序列分析[2]。PCR引物、PCR反應(yīng)組成和反應(yīng)條件等均參考P.multocida RIRDC MLST（http：//pubmlst. org/pmultocida_rirdc/）的數(shù)據(jù)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，切膠送于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。序列經(jīng)上傳后（http：//pubmlst.org/pmultoci?da_rirdc/）獲取相關(guān)的ST。

1.7藥敏試驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏片的規(guī)格為頭孢曲松鈉（30 μg/片）、氧氟沙星（10 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、丁胺卡那霉素（30 μg/片）、復(fù)方新諾明（23.75 μg/片）、痢特靈（300 μg/片）、美洛西林（75 μg/片）、多粘菌素B （300 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、強(qiáng)力霉素（30 μg/片）、鏈霉素（10 μg/片）、妥布霉素（10 μg/片）、氟苯尼考（30 μg/片）、新霉素（30 μg/片）。藥敏結(jié)果判定按照杭州天和微生物試劑有限公司發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌分離血平板上分離出無色露珠狀的、均勻的半透明菌落，該菌在麥康凱培養(yǎng)基上不生長。鏡檢可見分離菌為革蘭陰性的小桿菌。

2.2生化鑒定生化鑒定如表1所示，生化鑒定表明，該菌可發(fā)酵葡萄糖、果糖、乳糖、木糖，甘露醇，硝酸鹽還原陽性，符合多殺性巴氏桿菌的生化特點(diǎn)。

表1　細(xì)菌分離株生化鑒定

2.316S rDNA基因序列分析分離菌用16S rDNA試劑盒擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)約500 bp的目的片段，切膠后測序，結(jié)果在NCBI網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)后，與數(shù)據(jù)庫的多殺性巴氏桿菌同源性100%。

2.4莢膜血清型測定如圖1所示：分離菌經(jīng)PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)約1 000 bp的目的片段，因此，該菌株應(yīng)為莢膜血型A型。

2.5MLST結(jié)果分離菌分別以adk，est，gdh，mdh，pgi，pmi和zwf2引物進(jìn)行PCR，結(jié)果各出現(xiàn)約570、641、702、620、784、739 bp和614 bp條帶，目的片段切膠測序，結(jié)果上傳數(shù)據(jù)庫（http：//pubmlst. org/pmultocida_rirdc/），獲得相應(yīng)的等位基因序列號(hào)，分離菌的7個(gè)等位基因序列號(hào)est，mdh，pgi，pmi，adk，gdh和zwf分別是33，17，20，26，21，20和2，因此，ST型為129。

圖1　用PCR進(jìn)行莢膜血清分型

2.6藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)顯示，該菌復(fù)方新諾明和強(qiáng)力霉素耐藥；對(duì)慶大霉素等藥物都呈高度敏感或中度敏感；結(jié)果如表2所示。

表2　分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

3.1根據(jù)分離菌株的生長特點(diǎn)、生化特性和16S rDNA序列分析可知從病死鸚鵡體內(nèi)分離出的1株多殺性巴氏桿菌，其序列型為ST129。根據(jù)MLST數(shù)據(jù)（http：//pubmlst.org/pmultocida/）最新數(shù)據(jù)可知，ST129是江蘇地區(qū)禽源多殺性巴氏桿菌的已知的惟一基因型[6]，已研究顯示在雞、鴨和鵝等家禽分離菌株為此基因型，但在鸚鵡上是首次分離到多殺性巴氏桿菌，研究表明其能在動(dòng)物體內(nèi)通過各種方式感染人[7]，因此，飼養(yǎng)過程中要注意一些鳥類攜帶或感染多殺性巴氏桿菌從而感染人。

3.2分離菌株生化結(jié)果顯示，該細(xì)菌除具有多殺性巴氏桿菌發(fā)酵葡萄糖和硝酸鹽還原陽性共性之外，該細(xì)菌還能發(fā)酵麥芽糖，此特點(diǎn)與已知文獻(xiàn)有差異[1]。

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[3]邵慧君，孫化露，吳白，等.1株鴨源性都柏林沙門菌的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2012，48（4）：38-40.

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S858.39文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

0529-6005（2016）07-0033-02

2015-03-04

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（R1406）

李軍朝（1989-）,男,碩士生,主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)的研究工作，E-mail：june5210@163.com

王彥紅，E-mail：wyh7405@163.com