劉忠艷，薛瑞旭，吳慶俠，董海龍，李　鵬，金藝鵬，林德貴（.西藏農(nóng)牧學院，西藏 林芝 860000；.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 700；.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 海淀 009）

Undifilum oxytropis次級代謝產(chǎn)物GC-MS分析及抗腫瘤活性研究

劉忠艷1，薛瑞旭2，吳慶俠1，董海龍1，李鵬3，金藝鵬3，林德貴3
（1.西藏農(nóng)牧學院，西藏 林芝 860000；2.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100；3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 海淀 100193）

研究瘋草內(nèi)生真菌（Undifilum oxytropis），次級代謝產(chǎn)物成分與活性，通過GC-MS對菌絲體及發(fā)酵液進行了分析，并通過MTT法測定抗腫瘤活性。結(jié)果表明，菌絲體和發(fā)酵液中均以烷烴和酯類物質(zhì)為主，菌絲體中檢出活性物質(zhì)角鯊烯（0.863%）；菌絲體對HCT-8人回盲腸癌細胞和OS-RC-2人腎癌細胞抑制率均較高，發(fā)酵液對HCT-8人回盲腸癌細胞抑制率相對較弱。

瘋草；內(nèi)生真菌；代謝產(chǎn)物；抗腫瘤

Corresponding authors：LI Peng；JIN Yi-peng

瘋草（locoweed）是一類含有毒性成分苦馬豆素（Swainsonine），并能引起動物出現(xiàn)典型神經(jīng)癥狀和廣泛空泡變性的黃芪屬（Astragalus）和棘豆屬（Oxytropis）有毒植物的總稱，是世界范圍內(nèi)分布最為廣泛、危害最為嚴重的毒草[1-2]?？囫R豆素屬吲哚里西啶類（indolizidine）生物堿，該類生物堿具有多樣的生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、抑菌等。2003年，國外學者Braun等從瘋草中分離到內(nèi)生真菌，之后國內(nèi)外學者相繼從瘋草中分離到內(nèi)生真菌，并得到產(chǎn)苦馬豆素活性菌株，經(jīng)鑒定為Undifilum spp.同時證明其與瘋草中苦馬豆素的產(chǎn)生存在一定關(guān)系[3-8]。

內(nèi)生真菌已成為生物活性次級代謝產(chǎn)物的一個重要來源。內(nèi)生真菌的多樣性、復(fù)雜性和特殊性的特點，使其產(chǎn)生的活性產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型遠遠超出它們的寄主植物，而且，內(nèi)生真菌產(chǎn)生新穎化學結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物的比例（51%）比土壤微生物（38%）要高很多，因此內(nèi)生真菌也成為生物活性產(chǎn)物篩選熱點[9-10]。本文以Undifilum oxytropis為樣本，通過GC-MS分析次級代謝產(chǎn)物小極性段化學成分，同時通過MTT法研究其抗腫瘤活性，為其活性產(chǎn)物篩選奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗材料莖直黃芪內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis，由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院生物毒素與分子毒理試驗室提供。HCT-8人回盲腸癌細胞、OS-RC-2人腎癌細胞，由中國科學院細胞庫提供。

1.2次級代謝產(chǎn)物分析培養(yǎng)過濾得到的Undifilum oxytropis菌絲和濃縮發(fā)酵液采用乙醇熱回流法提取其代謝產(chǎn)物，制得浸膏懸浮于蒸餾水，后經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分段萃取，分別得到各自萃取段。其中石油醚萃取段采用GC-MS進行分析。

氣相色譜條件：色譜柱為ZB-SMSI 5%Phe?nyl-95%DiMethylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫60℃（保留2 min），以5℃/min升溫至310℃，保持10 min；運行時間：60 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純氦氣；柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0 mL/min，不分流，溶劑延遲時間：3.0 min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 294 V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍29～500 amu。

1.3抗腫瘤活性研究HCT-8人回盲腸癌細胞、OS-RC-2人腎癌細胞接種于96微孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)至對數(shù)期。設(shè)3個平行組。陰性對照組添加細胞培養(yǎng)液200 μL，試驗I-VII組按38 μg/ μL、19 μg/μL、9.5 μg/μL、4.75 μg/μL、2.375 μg/ μL、1.188 μg/μL、0.594 μg/μL梯度濃度加入菌絲乙醇提取物，按170 μg/μL、85 μg/μL、42.5 μg/ μL、21.25 μg/μL、10.625 μg/μL、5.313 μg/μL、2.656 μg/μL梯度濃度加入發(fā)酵液乙醇提取物，培養(yǎng)36 h。分別加入0.5%MTT溶液20 μL培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩至甲臜紫色結(jié)晶溶解完全，酶標儀490 nm測其OD值。按下列公式計算癌細胞抑制率。

癌細胞抑制率=（1-給藥組平均OD值/對照組平均OD值）×100%

2　結(jié)果

2.1GC-MS檢測結(jié)果按照上述條件對Undifilum oxytropis菌絲體和發(fā)酵液乙醚提取樣品進行分析，分別獲得其總離子流色譜圖（圖1和圖2），對色譜圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist2008和Wiley275標準質(zhì)譜圖，分別鑒定出菌絲體和發(fā)酵液樣品中的22個和28個化合物，未定化合物分別為5個和10個，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對百分含量，鑒定出的化合物分別占總提取物的88.580%和66.734%，結(jié)果見表1和表2。

圖1　Undifilum oxytropis菌絲體總離子流色譜圖

圖2　Undifilum oxytropis發(fā)酵液總離子流色譜圖

表1　菌絲體石油醚萃取段GC-MS檢測結(jié)果

Undifilum oxytropis菌絲體中油酸（39.82%）、油酸甲酯（21.531%）、棕櫚酸（10.336%）、棕櫚酸甲酯（5.306%）等含量較高，發(fā)酵液中則以苯二甲酸丁酯（40.643）含量最高。菌絲體和發(fā)酵液中均以烷烴和酯類物質(zhì)為主，同時菌絲體中還檢測到活性物質(zhì)角鯊烯，其含量為0.863%。

2.2抗腫瘤活性研究Undifilum oxytropis菌絲體乙醇提取物對HCT-8、OS-RC-2均有較強的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度分別為9.5 μg/μL和2.375 μg/ μL，發(fā)酵液乙醇提取物對OS-RC-2抑制作用較強，半數(shù)抑制濃度為42.5 μg/μL，對HCT-8則相對較弱，半數(shù)抑制濃度為170 μg/μL。結(jié)果見圖3。

表2　發(fā)酵液石油醚萃取段GC-MS檢測結(jié)果

圖3　UNDIFILUMOXYTROPIS菌絲體與發(fā)酵液腫瘤細胞抑制曲線

3　討論

本文從Undifilum oxytropis菌絲體和發(fā)酵液中檢出化合物均以烷烴類和酯類化合物為主，同時含有少量的揮發(fā)性酸，菌絲體檢出化合物種類低于發(fā)酵液中化合物檢出種類。從菌絲體中檢測到的角鯊烯具有促進動物機體組織攜氧、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化、抑制微生物生長等能力[11]。王建軍[12]還首次從瘋草植物莖直黃芪中分離得到角鯊烯，可以推測其產(chǎn)生也可能與Undifilum內(nèi)生菌有關(guān)。從發(fā)酵液中檢測出的異黃蝶呤常被用作腫瘤標志代謝物進行研究，其具有抗腫瘤、抗突變等作用[13-14]。

Undifilum oxytropis菌絲體和發(fā)酵液均具有明顯的抑制腫瘤活性，且抗腫瘤活性物質(zhì)主要分布于菌絲體中。因瘋草中活性成分吲哚里西啶類生物堿主要為大極性物質(zhì)，因此其抗腫瘤活性是否完全與苦馬豆素有關(guān)還需對其次級代謝產(chǎn)物大極性段進行研究。

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GC-MS and antitumor activity study on thesecondary metabolites ofUndifilum oxytropis

LIU Zhong-yan1，XUE Rui-xu2，WU Qing-xia1，DONG Hai-long1，LI Peng3，JIN Yi-peng3，LIN De-gui3
（1.Tibet Agriculture and Animal Husbandry College，Linzhi 860000，China；2.College of Veterinary Medicine，Northwest A&F University，Yangling 712100，China；3.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

In order to study the active ingredients of secondary metabolites in locoweed endophyte，Undifilum oxytropis，the mycelium and fermentation broth were analyzed by GC-MS，and antitumor activity was measured by MTT assay.It showed that：al?kanes and esters were mainly active substances in both mycelium and fermentation broth.And squalene（0.863%）was detected in the mycelium；HCT-8 human ileocecal cancer and OS-RC-2 human renal cancer were highly inhibited by the mycelium.Inhibi?tion rate of fermentation broth to HCT-8 human ileocecal cancer was relatively weak.

locoweed；endophyte；metabolites；antitumor

S856.9

A

0529-6005（2016）07-0019-03

2016-02-23

中國農(nóng)業(yè)大學基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費專項資金（2015-TC027）；西藏自治區(qū)科技廳自然科學基金（2015ZR-13-31）

劉忠艷（1982-），男，講師，碩士，主要從事動物中毒性與營養(yǎng)代謝性疾病研究，E-mail：yjkdhqc@163.com

李鵬，E-mail：Vetli@cau.edu.cn；金藝鵬，E-mail：yipengjin@sina.com