于紅紅　吳瑪莉　張智偉　陳　瑞　吳　云　段智璇　田維毅

(貴陽中醫(yī)學院,貴陽550002)

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黃連解毒湯含藥血清對巨噬細胞自噬相關(guān)基因表達的影響①

于紅紅吳瑪莉②張智偉③陳瑞吳云段智璇田維毅

(貴陽中醫(yī)學院,貴陽550002)

①本文為貴州省委組織部人才辦特助項目(TZJF-2009年39號)、貴州省科技廳國際科技合作項目(黔科合外G字[2010]7014號)、貴陽中醫(yī)學院2015年博士科研啟動基金項目。

②貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽550002。

③北京市豐臺中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京100072。

目的：考察黃連解毒湯含藥血清對RAW264.7巨噬細胞自噬的影響，初步探討其抗動脈粥樣硬化的作用機制。方法：采用大、中、小劑量黃連解毒湯水煎劑灌胃干預(yù)SD大鼠，制備含藥血清；經(jīng)MTT法觀察含藥血清對細胞增殖的影響后，選擇各劑量濃度為20%的含藥血清干預(yù)體外培養(yǎng)的巨噬細胞，采用熒光定量PCR方法檢測自噬相關(guān)基因Beclin1和mTOR的mRNA表達水平；Western blot檢測Beclin1、p-mTOR蛋白的表達變化。結(jié)果：與正常對照組血清相比，黃連解毒湯含藥血清干預(yù)后誘導了Beclin1 mRNA及蛋白的表達，抑制了mTOR mRNA及p-mTOR蛋白的表達。結(jié)論：黃連解毒湯含藥血清可誘導RAW264.7巨噬細胞自噬相關(guān)基因Beclin1的表達、抑制mTOR的表達，這可能是該方抗動脈粥樣硬化作用的重要機制之一。

黃連解毒湯；自噬；RAW264.7巨噬細胞；動脈粥樣硬化；Beclin1； mTOR

自體吞噬(Autophagy，簡稱自噬) 是由溶酶體介導的降解胞質(zhì)內(nèi)受損的細胞器或蛋白質(zhì)的代謝過程[1]。動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是動脈管壁內(nèi)膜的一種慢性炎癥性疾病，血管壁產(chǎn)生粥樣斑塊為其特征。近年研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬與AS緊密相關(guān)，自噬參與并調(diào)控著AS的發(fā)生、發(fā)展進程[2，3]。研究表明適度的細胞自噬通過降解細胞內(nèi)受損的結(jié)構(gòu)起到抑制AS的形成和發(fā)展的作用[4]。

黃連解毒湯載于《外臺秘要》，是傳統(tǒng)的清熱解毒方劑，由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成，具有瀉火解毒的功效。臨床實踐和實驗研究方面的數(shù)據(jù)表明,黃連解毒湯能通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點整合起效干預(yù)和防治AS及穩(wěn)定斑塊的作用,相關(guān)的作用機制與其抗炎、降脂、保護血管內(nèi)皮細胞、改善血液流變學、抑制血管平滑肌細胞增殖、調(diào)節(jié)巨噬細胞分化、調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)、抗氧化應(yīng)激等作用有關(guān)[5-9]，但其作用機制尚未完全明了。我們猜想黃連解毒湯具有的抗AS活性機制是否與調(diào)控AS相關(guān)的細胞自噬有關(guān)？作為清熱解毒傳統(tǒng)方劑，黃連解毒湯能否誘導巨噬細胞發(fā)生自噬，以及能否通過自噬表現(xiàn)出抗AS效應(yīng)，國內(nèi)外尚未見相關(guān)文獻報道。本研究采用血清藥理學方法觀察黃連解毒湯對RAW264.7巨噬細胞自噬相關(guān)基因及其蛋白的影響，并初步探討其部分調(diào)控機制，為臨床應(yīng)用黃連解毒湯治療AS積累實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與動物小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞購自American Type Culture Collection(ATCC)。制備含藥血清選用清潔級雄性SD大鼠，體重180～220 g，購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(軍)2012-0011]。

1.1.2藥物與試劑黃連解毒湯按《外臺秘要》原方配伍比例(黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g)組方，所有中藥材一次性購自北京同仁堂貴陽店同一批次，并經(jīng)學院生藥實驗室專家鑒定為正品。采用常規(guī)方法制備水煎液[10]，并將其加熱濃縮至含生藥1 g/ml濃度。胎牛血清購自美國HyClone，Trizol購自美國 Invitrogen，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司，Beclin1、p-mTOR抗體及內(nèi)參抗體β-actin均購自Cell signaling Technology，HRP標記的二抗購自北京中杉金橋，MTT試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，PCR反應(yīng)引物由北京鼎國昌盛生物科技有限公司合成。

1.2方法

1.2.1制備黃連解毒湯含藥血清將實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將其隨機分為大/中/小劑量3個給藥組，另設(shè)一個正常對照組，每組10只。以成人(體重以60 kg計)每日用藥量的等效劑量(粗略按7倍用藥量換算大鼠等效劑量)為大鼠給藥小劑量，中劑量為小劑量的2倍，大劑量為中劑量的2倍，給藥體積為1 ml/100 g(大鼠體重)；正常對照組給予等體積生理鹽水灌胃。2次/d，連續(xù)7 d。末次給藥2 h后股動脈采血，離心后制備各組血清。

1.2.2細胞培養(yǎng)RAW264.7巨噬細胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中恒溫孵育。每2～3 d用Accutase細胞消化液以1∶2或1∶3的比例傳代。取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3MTT法檢測黃連解毒湯含藥血清對巨噬細胞增殖的影響用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整巨噬細胞濃度為1×105個/ml，于96 孔板中加入細胞懸液100 μl/孔，按正常對照組血清、黃連解毒湯大劑量組含藥血清分別加入10%、20%、30%、40%、50%和60%濃度的正常血清和含藥血清，全部加樣均設(shè)8個復孔。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT 10 μl，繼續(xù)孵育4 h，再每孔加入100 μl Formanzan溶解液混勻，4 h后采用酶標儀570 nm處測定吸光度。

1.2.4實時熒光定量PCR檢測巨噬細胞Beclin1、mTOR mRNA的表達用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整巨噬細胞數(shù)為5×105個/ml，于6孔板中加入細胞懸液1 ml/孔；放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h貼壁后，按正常對照組血清、黃連解毒湯含藥血清大、中、小劑量組分別加入20%濃度的正常血清和含藥血清。置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用實時熒光定量PCR檢測各目的基因，采用2-△△Ct方法計算其表達量。PCR反應(yīng)擴增條件為95 ℃ 30 s，循環(huán)1次；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，循環(huán)40次。Beclin1 引物序列：上游5′-CCGCAAGATAGTGGCAGAA-3′，下游5′-CGACCCAGCCTGAAGTTAT-3′；mTOR引物序列:上游5′-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC-3′,下游5′-GAACAATAGGGTGAATGATCCGGG-3′；GAPDH 引物序列：上游5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.2.5Western blot檢測巨噬細胞Beclin1和p-mTOR蛋白的表達收集各組細胞，用RIPA裂解液裂解收集蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。等量樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。室溫下封閉2 h，加各目標分子特異性一抗4℃孵育過夜，次日TBST液洗滌膜3次，加入HRP標記的相應(yīng)二抗室溫孵育1 h。TBST液洗膜3次，ECL法顯影，用ChemiDocXRS化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯色、曝光采圖，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

2　結(jié)果

2.1黃連解毒湯含藥血清對RAW264.7巨噬細胞增殖的影響與正常對照組血清相比，黃連解毒湯含藥血清在10%～40%濃度范圍內(nèi),其OD值差異無顯著性(P>0.05)。根據(jù)含藥血清對巨噬細胞增殖的影響，選擇對細胞數(shù)量穩(wěn)定的血清濃度范圍(40%以下)進行后續(xù)實驗，在本實驗中統(tǒng)一采用文獻常用的20%終濃度的血清加樣檢測相關(guān)指標。

表1　不同濃度黃連解毒湯含藥血清對巨噬細胞增殖的影響±s,n=8)Tab.1　Effects of different concentrations of Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum on macrophages proliferation

Groups10%20%30%40%50%60%Controlgroup0.237±0.0140.252±0.0180.256±0.0130.264±0.0270.252±0.0260.265±0.031Largedosegroup0.240±0.0150.248±0.0260.250±0.0130.261±0.0050.197±0.0161)0.192±0.0202)

表2　黃連解毒湯含藥血清對巨噬細胞Beclin1和mTOR mRNA表達的影響Tab.2　Effects of Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum on Beclin1 and mTOR mRNA expression of macrophages ±s,n=6)

表3　黃連解毒湯含藥血清對巨噬細胞Beclin1和p-mTOR蛋白表達的影響±s,n=6)Tab.3　Effects of Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum on Beclin1 and mTOR protein expression of macrophages ±s,n=6)

圖1　黃連解毒湯含藥血清對巨噬細胞Beclin1和p-mTOR蛋白表達的影響Fig.1　Effects of Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum on Beclin1 and p-mTOR protein expression of macrophagesNote: A.Control group;B.Small dose group;C.Middle dose group;D.Large dose group.

結(jié)果見表1。

2.2黃連解毒湯含藥血清對巨噬細胞Beclin1和mTOR mRNA表達水平的影響與正常對照組血清相比，黃連解毒湯各劑量組含藥血清作用于RAW264.7巨噬細胞24 h后，Beclin1 mRNA表達水平上調(diào)，而mTOR mRNA的表達受到抑制(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表2。

2.3黃連解毒湯含藥血清對巨噬細胞Beclin1和p-mTOR蛋白表達水平的影響與正常對照組血清相比，隨著黃連解毒湯含藥血清作用劑量的增加，Beclin1蛋白的表達水平均受到明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01)；p-mTOR(ser2448)蛋白的表達均受到不同程度的抑制(P<0.01)。結(jié)果見表3，圖1。

3　討論

自噬是細胞利用溶酶體系統(tǒng)降解自身受損的細胞器、細胞毒性蛋白的過程，使其能夠適應(yīng)各種應(yīng)激和饑餓等環(huán)境[1，11]。自噬異常能導致多種疾病的發(fā)生，其與AS的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。在AS進程的不同階段中均存在自噬活性的改變，研究資料顯示適度的自噬對AS具有保護作用，能夠抑制AS的發(fā)生和發(fā)展。近年來，越來越多的研究顯示一些傳統(tǒng)中藥及其有效成分具有誘導細胞自噬的作用[12-14]，研究者們試圖從細胞自噬的角度闡釋某些中藥發(fā)揮作用的分子機制。因此，若能有效調(diào)控細胞自噬，將有可能為AS的防治提供新的治療策略和靶點。

細胞自噬發(fā)生的整個過程是受一系列自噬相關(guān)基因(Autophagy related gene，ATG)所調(diào)控。Beclin1是酵母自噬基因ATG6在哺乳細胞中的同源蛋白，參與自噬體的形成，其表達強度與自噬活性緊密相關(guān)[15]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR) 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在轉(zhuǎn)錄和自噬體形成水平誘導自噬，現(xiàn)已明確在自噬的調(diào)控中扮演重要角色，負性調(diào)控著細胞自噬[16]。在本實驗中，熒光定量PCR結(jié)果顯示：與正

常對照組血清相比，不同劑量濃度的黃連解毒湯含藥血清均能誘導Beclin1 mRNA表達，抑制mTOR mRNA表達。Western blot 結(jié)果顯示：與正常對照組血清相比，黃連解毒湯含藥血清干預(yù)RAW264.7巨噬細胞后Beclin1的蛋白表達水平上調(diào)；p-mTOR(ser2448)蛋白的表達均受到明顯的下調(diào)。

綜上所述，黃連解毒湯含藥血清可誘導RAW264.7巨噬細胞自噬相關(guān)基因Beclin1的表達、抑制mTOR的表達，這可能是該方抗AS作用的重要機制之一。這一研究結(jié)果為進一步探討黃連解毒湯的作用機制及其在抗AS中的作用積累實驗依據(jù)。目前自噬與AS的關(guān)系以及自噬的調(diào)控機制尚未完全清楚，需要進一步、更深入的研究為AS的治療提供新的途徑和靶點。

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[收稿2016-01-06修回2016-03-04]

(編輯張曉舟)

Effects of Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum on expressions of autophagy related gene in macrophages

YU Hong-Hong,WU Ma-Li,ZHANG Zhi-Wei,CHEN Rui,WU Yun,DUAN Zhi-Xuan,TIAN Wei-Yi.Guiyang University of Chinese Medicine,Guiyang 550002,China

Objective:To investigate the effects of Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum for the autophagy of RAM264.7 macrophages，and to explore its possible anti-atherosclerosis mechanism．Methods: The SD rats were intervened with large,middle and small dose Huang-Lian-Jie-Du-Decotion to prepare containing drug serum.Cell proliferation was tested by MTT assay.The gene and protein expressions of Beclin1，mTOR was assessed by fluorescent quantitative PCR and Western blot method．Results: Compared with the normal serum group,Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum enhanced expression of the mRNA and protein level of Beclin1,and decreased the expression of mTOR and p-mTOR(P<0.05 orP<0.01)．Conclusion: Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum could regulate the expressions of Beclin1 and mTOR.These might be one of the mechanisms for preventing atherosclerosis.

Huang-Lian-Jie-Du-Decotion;Autophagy;RAM264.7 macrophages;Atherosclerosis;Beclin1;mTOR

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.014

R392文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1150-04

于紅紅(1987年-)，女，助理實驗師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究，E-mail:731319210@qq.com。

及指導教師：田維毅(1972年-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究，E-mail:tianweiyi1972@sina.com。