王萍　張熊

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miRNA-223,-99a檢測在兒童急性白血病中的臨床應用

王萍張熊

目的探討骨髓微小RNA(MicroRNA，miRNA)-223、-99a檢測在兒童急性白血病(AL)中的臨床應用。方法收集30例急性白血病患兒的骨髓染色及臨床資料，分為復發(fā)組(n=13)和緩解組(n=17)，另選取健康體檢兒童8例作為對照組，采用實時熒光定量PCR(Realtime-PCR，RT-PCR)技術檢測兒童骨髓miR-223和 miR-99a的表達。比較分析以上兩標志物在兒童急性白血病疾病中的變化。結果復發(fā)組和緩解組miR-223和 miR-99a表達與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；復發(fā)組miR-223和 miR-99a表達與緩解組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。復發(fā)組和緩解組miR-223和 miR-99a表達呈負相關(r值分別為-0.529、-0.587，P<0.01)。結論骨髓miR-223和 miR-99a表達與兒童急性白血病的病變發(fā)展有關，其可作為兒童急性白血病診斷和治療的分子標志物。

兒童急性白血??；完全緩解；復發(fā)；miR-223；miR-99a

急性白血病是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，隨著化療技術的進展，完全緩解(CR)率越來越高，但急性白血病緩解患者的復發(fā)仍然是患者長期生存的主要威脅[1]。兒童與成人白血病存在生物學特性、治療反應、治愈率以及造血系統(tǒng)腫瘤類型等方面的不同[2，3]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在細胞的增殖、分化和凋亡等多種生理過程中發(fā)揮重要作用，而且其異常表達可能促進腫瘤的發(fā)生，與白血病的發(fā)生發(fā)展、治療反應和預后有密切聯(lián)系[4-9]。miRNA分子遺傳學異常已成為近年白血病的研究熱點。本研究采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術對30例白血病患兒骨髓miR-223、 miR-99a的表達進行檢測，探討兩標志物與兒童白血病的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2011年3月至2015年3月在我院住院的急性白血病骨髓標本30例, 其中男17例，女13例;年齡2～13歲，平均(6.7±1.9)歲。其中急性淋巴細胞白血病(ALL)19例，急性非淋巴細胞白血病(ANLL)11例。30例患兒中復發(fā)AL(復發(fā)組)13例，完全緩解(緩解組)17例。另選取選8例健康體檢的正常骨髓作為對照組，其中男5例，女3例;年齡3～12歲，平均(6.2±1.7)歲。急性期出現(xiàn)低熱、乏力和面色蒼白者15例，占88.2%，皮膚再現(xiàn)瘀點、瘀斑者3例，占17.6%，出現(xiàn)骨痛者2例。ANLL用DA(正定霉素、阿糖胞昔)方案誘導緩解。ALL用VDCLPL(長春新堿、正定霉素、環(huán)磷酰胺、左旋門冬酰胺酶、強的松)方案誘導緩解。均經(jīng)1個療程完全緩解。本組已持續(xù)緩解1～12個月，平均4．5月，所有樣本經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學診斷(按FAB分型)證實；緩解組患兒診斷標準為患兒白血病的癥狀和體征消失，白細胞分類中無白血病細胞，骨髓中原粒細胞≤5%，M3型原粒細胞+早幼粒細胞≤5%，無Auer小體，紅系和巨核細胞系正常[10]。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，且所有研究對象的家長簽署知情同意書。

1．2方法

1．2．1標本采集:完全緩解期患者骨髓標本均為強化前采。復發(fā)病例均為化療前采集，所有受試對象抽取骨髓0.5 ml，肝素抗凝，加Trizol裂解液充分裂解后凍存于-80℃冰箱備用。

1．2．2總RNA抽提及逆轉錄:Trizol法提取總RNA，取Trizol裂解液加焦碳酸二乙酰(DEPC)水調整至4 g/L，置于冰盒備用。按照美國應用生物系統(tǒng)(ABI)公司逆轉錄試劑盒說明書提供的操作步驟進行操作，采用ABI 9700PCR反應儀逆轉錄合成miR-223和miR-99a特定的cDNA。逆轉錄反應條件設置為：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保存。miR-99a引物序列，正義鏈： 5’-CGTAGCATCCTTAGAACTCAGC-3’；反義鏈： 5’-CCGCTCGAGGAACTATTGTTGAACGGCACT-3’。miRNA-223引物序列，正義鏈：5’-AAAAGTTAACCCCAGAGCAATAAGCCACATTA-3’,反義鏈：5’-AAAAACTCGA GCAGGGACAGCCTTCTTCTTG-3’。β-actin作為內參照，引物序列為：正義鏈5‘-ACCATGGATGATGATATCGCC-3’,反義鏈5’-GCCTTGCACATGCCGG-3’,miRNA-223,-99a表達量用Ct值變化表示?！鰿t(HVCT)-(Xn)Ct，Ct(HVCT)是對照組Ct的平均值，(Xn)Ct表示病例組Ct平均值。急性白血病患兒與對照樣本的miRNA的相對表達量為2-Δct。

2　結果

2.1急性白血病臨床表現(xiàn)和三系細胞結果比較復發(fā)組的WBC、Hb和BPC分別與緩解組和對照組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；緩解組的三項指標與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2miRNA-223,-99a表達水平比較復發(fā)組miRNA-223,-99a表達量分別與緩解組和對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01), 緩解組miRNA-223,-99a表達量與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表13組WBC、Hb和BPC結果比較

組別WBCHbBPC對照組(n=8)6.71±2.35132±9.7153±31.0緩解組(n=17)6.83±1.69123±10.3149±29.7復發(fā)組(n=13)15.97±9.77*#56±15.7*#45±36.2*#

注：與對照組比較，*P<0.05；與緩解組比較，#P<0.05

組別miRNA-223miRNA-99對照組(n=8)0.93±0.170.21±0.06緩解組(n=13)0.89±0.190.23±0.05復發(fā)組(n=17)0.15±0.05*#0.97±0.19*#

注：與對照組比較，*P<0.05；與緩解組比較，#P<0.05

2.3相關性分析復發(fā)組和緩解組miRNA-223,-99a表達量呈負相關(r=-0.529,-0.587,P<0.01)。在兩病例組中，miRNA-223,-99a的表達分別和WBC 、Hb和BPC具有相關性(r值分別為-0.477,0.426,0.437，0.463,-0.413,-0.429，P<0.01)。

3　討論

許多研究顯示，在不同的生物條件下(包括不同的腫瘤或同一腫瘤在不同的發(fā)病年齡)，某些miRNAs的生物作用截然不同[11-16]。miR-99a在不同的腫瘤中可能呈現(xiàn)不同的生物作用。有報道認為miR-99a在舌上皮細胞癌和非侵襲性膀胱上皮癌的初發(fā)患者中存在高表達，推測其可能起原癌基因的作[17,18]；而在肺癌初發(fā)患者中卻低表達，推測其可能發(fā)揮抑癌基因的作用[19]。miR-99a在小兒與成人白血病中存在不同的表達譜?，F(xiàn)已證實有許多小兒與成人白血病在生物學特性、治療反應、治愈率以及造血系統(tǒng)惡性腫瘤類型等方面有明顯不同，有報道認為miR-99a在小兒與成人急性髓性白血病(AML)中存在明顯差異的表達譜[20]。且初發(fā)ALL miRNA表達譜的改變可以作為判斷兒童ALL預后的指標[21]。本研究通過RT-PCR技術檢測30例急性白血病患兒骨髓miR-99a的表達結果顯示復發(fā)組miR-99a的表達明顯高于緩解組和對照組，提示復發(fā)患者的骨髓造血功能可能受到抑制，機體的免疫狀態(tài)可能趨于惡化。而緩解組與對照組miR-99a的表達無差異進一步印證了急性白血病的治療效果。白血病的發(fā)生和發(fā)展是一個錯綜復雜的過程，本研究顯示了miR-99a在兒童急性白血病中的表達水平，其更深層次的作用還需進一步研究，而且與白血病相關的其他更多miRNAs以及它們之間的相互作用關系也期待發(fā)掘和闡明。

有研究收集31例接受瓣膜置換術的風心病患者的心房肌組織，采用時熒光定量聚合酶鏈反應分析其miR-223的表達水平發(fā)現(xiàn)，房顫組和竇性心律組miR-223的表達呈現(xiàn)顯著差異[22]。另外的研究采用PCR技術分析42 例急性白血病患者的骨髓miR-223表達，發(fā)現(xiàn)miR-223在AML、ALL中的表達水平均低于正常對照組，而miR-223在 AML中的表達水平明顯高于 ALL[23]。Mi等[24]報道在AML和ALL中表達差異最顯著的四個miRNA是miR-128a、miR-128b、let-7b和miR-223，而其中任意兩個miRNAs都可以準確有效地區(qū)分97%～100%的ALL和AML患者。有研究采用基因芯片技術檢測兒童ALL初發(fā)-緩解配對的骨髓樣本中miRNA的表達顯示，初發(fā)ALL患兒miR-223和miR-27a表達降低，而在緩解期患兒中升高[25]。本研究結果認為miR-223在急性白血病患兒骨髓中存在低表達，而在緩解組出現(xiàn)表達上升。miR-223在復發(fā)組的低表達反應了白血病患兒的病情狀況，提示了白血病細胞的生長可能沒有得到足夠的抑制。其在緩解期的較高表達印證了白血病緩解治療的效果。進一步顯示了miR-223作為診斷和治療小兒白血病而存在的潛在前景。其有可能用作白血病診斷和治療的分子標志物。

復發(fā)組和緩解組miRNA-223,-99a表達量呈負相關(P<0.01)。兩標志物表達分別與WBC 、Hb和BPC具有相關性，推測兩標志物的異常表達與兒童急性白血病的病理變化有關，進一步顯示miRNA-223,-99a表達可能在小兒急性白血病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用，聯(lián)合檢測兩標志物可作為兒童急性白血病診斷和治療的分子標志物，為完全緩解患者免疫治療提供依據(jù)，以期增加急性白血病患者的長期生存率。 綜上所述，miR-223、miR-99a的表達與急性白血病關系密切相關，檢測miRNA-223,-99a的表達，與患者臨床療效和長期生存有著直接關系， 對治療的選擇和調整具有重要的意義。因此，miRNA-223,-99a有可能作為急性白血病診斷和治療的新標記物，通過分析miRNAs 的表達譜及其不同組合的表達將會是未來急性白血病診斷和治療的新方法。

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The clinical significance of detection of miR-223 and miR-99a in children with acute myeloid leukemia

WANGPing*,ZHANGXiong.

*DepartmentofPediatrics,TheFirstPeople’sHospitalofXianyangCity,Shan’xi,Xianyang712000,China

ObjectiveTo investigate the clinical significance of the detection of marrow MicroRNA (miR-223 and miR-99a) in children with acute myeloid leukemia.MethodsThe marrow staining specimens and clinical data aboult 30 children with acute myeloid leukemia were collected and were divided into relapse group (n=13) and remission group (n=17),moreover,8 healthy children were served as control group.The expression levels of miR-223和 miR-99a in marrow were detected by Real-time fluorescent quantitative PCR (Real time - PCR,RT-PCR),furthermore, the changes of the two markers in children with acute myeloid leukemia were observed and compared among the three groups.ResultsThere were significant differences in the expression levels of miR-223 and miR-99a between relapse group and control group as well as between remission group and control group (P<0.01). Moreover there were significant differences in the expression levels of miR-223 and miR-99a between relapse group and remission group (P<0.01). Besides the expression levels of miR-223 and miR-99a in relapse group were negatively correlated to those in remission group (r=-0.529,-0.587,respectively,P<0.01).ConclutionThe expressions of miR-223 and miR-99a in bone marrow are correlated with the pathogenesis and development of acute myeloid leukemia in children,thus,which can be regarded as molecular markers in diagnosis and treatment of acute myeloid leukemia in children.

acute leukemia in children; complete remission; relapse; miR-223；miR-99a

712000陜西省咸陽市第一人民醫(yī)院兒科(王萍),檢驗科(張熊)

R 733.71

A

1002-7386(2016)16-2416-03

2016-01-13)

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.16.004