趙能，原曉龍，陳劍，楊宇明，王娟，王毅

(1.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南　昆明650224；2.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南　昆明650201)

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不同碳氮源對(duì)牛樟芝菌絲體生長的影響*

趙能1,2，原曉龍2，陳劍2，楊宇明2，王娟2，王毅2

(1.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南昆明650224；2.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201)

為研究不同碳氮源對(duì)牛樟芝菌絲體生長的影響，采用不同碳源(甘露醇、麥芽糖、山梨醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、肌醇、果糖、可溶性淀粉)、不同氮源(麥芽浸粉、酵母提取物、番茄浸粉、馬鈴薯浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉浸粉、酪蛋白胨、麥芽浸粉肉湯)及不同濃度果糖(0.2%～3.2%)對(duì)牛樟芝菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)，觀測(cè)其菌落大小、菌落長勢(shì)、生長速率及菌絲生長指數(shù)。結(jié)果表明，以麥芽浸粉與酵母提取物為氮源，9種糖類中果糖作為碳源時(shí)，牛樟芝菌絲生長速度最快，培養(yǎng)30d時(shí)的菌絲生長速率為1.47mm/d，且菌絲呈紅色，與野生牛樟芝子實(shí)體顏色接近。以麥芽糖和果糖為碳源，9種提取物中牛肉浸粉作為氮源時(shí)，牛樟芝生長最佳，培養(yǎng)30d時(shí)的菌絲生長速率為1.51mm/d，但其菌絲呈黃白色。果糖濃度在4%以內(nèi)，生長的各個(gè)指標(biāo)均隨著果糖濃度的升高而升高。本研究為今后研究牛樟芝菌種擴(kuò)繁、大規(guī)模發(fā)酵及椴木接種提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

牛樟芝；不同碳氮源；生長速度；菌絲顏色

牛樟芝(Antrodiacinnamomea)又名樟芝、牛樟菇、樟生薄孔菌等，是擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)的珍稀藥用真菌[1]，子實(shí)體表面呈橘紅色或黃色，寄生在臺(tái)灣特有樹種牛樟樹(Cinnamomumkanehirai)上與其共生生長[2]。在臺(tái)灣，牛樟芝是一種家喻戶曉的民族藥物，不僅具有醒酒與緩解疲勞的作用，還具有抗癌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、保護(hù)肝臟等作用，同時(shí)還能夠治療腹瀉、腹痛、高血壓等多種疾病。因此，牛樟芝有“臺(tái)灣森林紅寶石”的美譽(yù)[3～4]?；谂Ｕ林サ姆N種藥效，從20世紀(jì)90年代開始，對(duì)牛樟芝的研究也不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)，牛樟芝子實(shí)體內(nèi)三萜類化合物含量高達(dá)63%[5]；迄今為止，從牛樟芝中共分離鑒定出的化合物有78個(gè)，其中有39個(gè)化合物都為三萜類[6]。大多數(shù)三萜類化合物都具有抗腫瘤、消炎等生物活性，其中，四環(huán)三萜和五環(huán)三萜類化合物具有較好的抗腫瘤活性[7]，對(duì)于治療癌癥有巨大的幫助。由于牛樟芝中三萜類化合物含量較高，臺(tái)灣地區(qū)將其大量加工處理成為保健品[8]，用于治療多種疾病。

雖然牛樟芝具有顯著的藥效，但是，牛樟芝在自然界中生長緩慢，加之牛樟樹作為保護(hù)樹種，人工狀態(tài)下培養(yǎng)成形通常需要2-3年[9]，運(yùn)用傳統(tǒng)食用菌栽培技術(shù)難以培養(yǎng)牛樟芝[10]，致使采用普通栽培方法大量獲得牛樟芝菌體十分困難。氮源是菌類生長發(fā)育最重要的營養(yǎng)源，是合成碳水化合物、蛋白質(zhì)和核酸的原料，也為菌絲生長發(fā)育提供各種關(guān)鍵的細(xì)胞組分，包括氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等[11]。而碳源是構(gòu)成細(xì)胞的主要物質(zhì)，能提供生長發(fā)育所需能量，同樣是食用菌最重要的營養(yǎng)源之一，也是食用菌子實(shí)體中含量最高的元素，培養(yǎng)基中碳源以及栽培材料中營養(yǎng)成分對(duì)滿足食用菌的生長發(fā)育至關(guān)重要[12～13]。菌類對(duì)不同碳源、氮源的利用情況不同，因此，碳源與氮源的篩選能夠有效地尋找到促進(jìn)牛樟芝菌絲體生長的最佳成分。

雖然目前已經(jīng)有一些對(duì)牛樟芝發(fā)酵條件及培養(yǎng)基配方的報(bào)道[14～16]，但其多關(guān)注活性化合物的產(chǎn)生，并沒有全面地討論碳源、氮源對(duì)牛樟芝生長速度的影響。而目前通過發(fā)酵培養(yǎng)大量獲得牛樟芝產(chǎn)生的獨(dú)特的活性成分依然面臨一些困難[14,17]。為了使牛樟芝菌絲體快速生長，本研究采用不同碳源與氮源對(duì)牛樟芝菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)，以期尋找到最適合牛樟芝生長的氮源與碳源，為其菌種擴(kuò)繁以及大規(guī)模發(fā)酵及椴木接種提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

材料牛樟芝斜面菌株由昆明食用菌研究所提供。

藥品瓊脂、甘露醇、麥芽糖、山梨醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、肌醇、果糖、可溶性淀粉、麥芽浸粉、酵母提取物、番茄浸粉、馬鈴薯浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉浸粉、酪蛋白胨、麥芽浸粉肉湯等。

1.2方法

1.2.1牛樟芝菌種活化

配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，滅菌冷卻后，在無菌條件下，將菌種接于母種培養(yǎng)基斜面上，于25℃恒溫暗培養(yǎng)，待菌絲長滿斜面后備用。

1.2.2不同培養(yǎng)基配制

不同碳源培養(yǎng)基配制以麥芽浸粉(6g/L)與酵母提取物(3g/L)為氮源，編號(hào)分別為M與Y，以40g/L的甘露醇、麥芽糖、山梨醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、肌醇、果糖、可溶性淀粉為碳源，編號(hào)分別為man，mal，sor，suc，lac，glu，ino，fru，sta，配制成氮源相同碳源不同的固體培養(yǎng)基。每個(gè)處理重復(fù)3次。

不同氮源培養(yǎng)基配制以麥芽糖(1.8g/L)與果糖(40g/L)為碳源，編號(hào)為MA與F，以4g/L的麥芽浸粉、酵母提取物、番茄浸粉、馬鈴薯浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉浸粉、酪蛋白胨、麥芽浸粉肉湯為氮源，編號(hào)分別為M1，Y，T，P，S，Y，B，L，M2，配制成碳源相同氮源不同的固體培養(yǎng)基。每個(gè)處理重復(fù)3次。

不同果糖濃度培養(yǎng)基配制以麥芽糖(6g/L)、酵母提取物(3g/L)為共同成分，分別加入2g/L、4g/L、8g/L、16g/L、32g/L的果糖，配制成固體培養(yǎng)基。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3培養(yǎng)方法及觀察指標(biāo)

采用平板培養(yǎng)法[18]，將牛樟芝菌絲體(1mm)接種于50mm的平板中央，24℃暗培養(yǎng)。在平板底部以接種塊為中心劃兩條垂直線用于測(cè)定菌絲生長速度和菌落直徑，每3d在菌絲最前端劃線直至長滿平板。恒溫培養(yǎng)30d后，測(cè)量菌落直徑，并對(duì)菌落長勢(shì)進(jìn)行評(píng)分。菌落長勢(shì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：5分，菌絲長勢(shì)濃密，顏色偏紅；4分，菌絲長勢(shì)較濃密，顏色偏紅；3分，菌絲長勢(shì)較稀疏，顏色偏紅；2分，菌絲長勢(shì)較稀疏，顏色淺白色；1分，菌絲長勢(shì)稀疏，顏色淺白色；未長出，0分。

為便于比較不同碳源與不同氮源的影響，引入了菌絲生長指數(shù)的概念[19～20]。

菌絲生長指數(shù)=菌落長勢(shì)評(píng)分×菌絲生長速率(mm/d)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同碳源對(duì)牛樟芝菌絲體生長指標(biāo)的影響

以麥芽浸粉與酵母提取物為氮源，選取不同碳源對(duì)牛樟芝菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長速率以及菌落直徑等變化。不同碳源對(duì)牛樟芝菌絲體生長指標(biāo)的影響見表1。

表1　不同碳源對(duì)牛樟芝菌絲體生長指標(biāo)的影響

注：“+”多少表示菌絲密度、菌絲紅色度優(yōu)劣情況，“-”表示沒有生長。

由表1可以看出，牛樟芝菌絲體只在以甘露醇、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、果糖和可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中生長，在其余3種培養(yǎng)基中均沒有生長。在6種有生長的培養(yǎng)基中，以果糖為碳源的培養(yǎng)基中，牛樟芝菌絲直徑最大，可達(dá)到44.07mm，且在其中生長的菌絲密度最高，顏色最紅，長勢(shì)評(píng)價(jià)最高，為5分。在甘露醇、麥芽糖及葡萄糖中生長的菌絲其直徑較果糖的小，但優(yōu)于乳糖和可溶性淀粉。菌絲生長速度與菌落直徑大小相符，果糖培養(yǎng)基生長速率顯著高于其他8種培養(yǎng)基。

圖1為不同碳源對(duì)牛樟芝菌絲生長指數(shù)的影響。由圖1可以看出，牛樟芝在不同碳源上，生長指數(shù)各不相同，表現(xiàn)為果糖>麥芽糖>葡萄糖>甘露醇>可溶性淀粉>乳糖，而在山梨醇、蔗糖及肌醇上均沒有生長指數(shù)。綜合牛樟芝在不同碳源上的生長勢(shì)、生長速率和生長指數(shù)可知，果糖碳源是最適宜牛樟芝菌絲體生長的碳源。

圖1　不同碳源對(duì)牛樟芝菌絲生長指數(shù)的影響

2.2不同氮源對(duì)牛樟芝菌絲體生長指標(biāo)的影響

將麥芽糖與果糖作為碳源，選用不同氮源對(duì)牛樟芝菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長速率以及菌落直徑等變化。表2為不同氮源對(duì)牛樟芝菌絲體生長指標(biāo)的影響。從表2可以看出，當(dāng)把果糖作為碳源時(shí)，牛樟芝菌絲體在9種氮源培養(yǎng)基上均能生長，菌

絲生長直徑在39～45mm之間。但在不同氮源培養(yǎng)基上，菌絲的濃密程度、菌落的長勢(shì)、顏色不一致。從顏色和濃密程度來看，酵母提取物培養(yǎng)基菌落長勢(shì)評(píng)價(jià)最高，為5分。以牛肉浸粉為氮源的培養(yǎng)基評(píng)分次之，為3.5分，但菌落直徑比酵母提取物大。其余7種培養(yǎng)基雖然菌落直徑都基本達(dá)到40mm，但是菌落長勢(shì)均不好，菌絲密度較低且顏色多為白色，與自然界中生長的紅色牛樟芝菌有較大差別。

由表2可知，在不同培養(yǎng)基上統(tǒng)一培養(yǎng)30d后，菌落直徑大小表現(xiàn)為牛肉浸粉>番茄浸粉>麥芽浸粉肉湯>酪蛋白胨>大豆蛋白胨>酵母提取物>麥芽浸粉>胰蛋白胨>馬鈴薯浸粉，牛肉浸粉中生長的菌落直徑最大，但是牛肉浸粉中生長的牛樟芝菌絲體在21d后就停止了生長。不同培養(yǎng)基上的菌絲生長速率快慢與菌落直徑表現(xiàn)相同，明顯看出牛肉浸粉的生長速率高于其他幾種浸粉的生長速率。

表2　不同氮源對(duì)牛樟芝菌絲體生長指標(biāo)的影響

圖2　不同氮源對(duì)牛樟芝菌絲生長指數(shù)的影響

圖2為不同氮源對(duì)牛樟芝菌絲生長指數(shù)的影響。由圖2可以看出，不同氮源培養(yǎng)基牛樟芝菌絲生長指數(shù)各不相同，表現(xiàn)為牛肉浸粉>酵母提取物>番茄浸粉>麥芽浸粉>麥芽浸粉肉湯>酪蛋白胨>大豆蛋白胨>胰蛋白胨>馬鈴薯浸粉?？梢钥闯雠Ｈ饨壑信Ｕ林ゾz生長指數(shù)高于其他8種氮源，酵母提取物生長指數(shù)略低于牛肉浸粉，麥芽浸粉以及番茄浸粉的牛樟芝菌絲生長指數(shù)相差不大，略高于其余5種氮源，剩余的5種氮源生長指數(shù)基本相同。

2.3不同濃度果糖對(duì)牛樟芝菌絲體生長指標(biāo)的影響

不同濃度果糖對(duì)牛樟芝菌絲體生長的影響見表3。

表3　不同濃度果糖對(duì)牛樟芝菌絲體生長指標(biāo)的影響

由表3可以看出，3.2%果糖濃度的牛樟芝菌絲生長最好，菌落長勢(shì)評(píng)價(jià)最高，得分5分，且菌落直徑最大，達(dá)到39.75mm。表3與表1中4%濃度果糖相比，4%濃度果糖菌落直徑明顯大于表3中所有濃度果糖的生長直徑，說明果糖濃度在4%以內(nèi)，生長勢(shì)隨著果糖濃度的升高而升高，菌落直徑也同樣隨果糖濃度的增加而增大。3.2%濃度果糖中菌絲生長速率最高，且明顯高于其余4種濃度果糖培養(yǎng)基，但又低于表1中4%濃度果糖中菌絲生長速率。

圖3為不同果糖濃度對(duì)牛樟芝菌絲生長指數(shù)的影響。由圖3可以看出，3.2%濃度果糖生長指數(shù)明顯高于其余濃度果糖的生長指數(shù)，因此可以進(jìn)一步斷定在4%濃度范圍內(nèi)，果糖濃度越高，牛樟芝菌絲體生長越快。

圖3　不同濃度果糖對(duì)牛樟芝菌絲生長指數(shù)的影響

3　結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

以麥芽浸粉與酵母提取物為氮源、果糖作為碳源時(shí)，牛樟芝菌絲體生長明顯加快，且濃度在4%以內(nèi)，果糖濃度越高，牛樟芝菌絲體生長越快，當(dāng)果糖濃度為4%時(shí)，生長速度可達(dá)1.47mm/d，菌落直徑在生長30d時(shí)可達(dá)44.07mm，生長勢(shì)評(píng)價(jià)也越高，為5分，菌落呈現(xiàn)紅色，與野生牛樟芝子實(shí)體顏色極為接近。以果糖作為碳源時(shí)，以牛肉浸粉為氮源，牛樟芝菌絲體長勢(shì)最好，生長速度可達(dá)2.16mm/d，菌落直徑最大，達(dá)到45.4mm，且生長指數(shù)也最大，但此時(shí)牛樟芝菌絲不呈現(xiàn)紅色，菌絲顏色較白，呈淡黃色。前后兩種培養(yǎng)基上菌絲顏色不同，由此可以推斷，牛樟芝菌絲的顏色可能是由牛樟芝所吸收的氮源所決定的。由此可以確定，如果單純讓牛樟芝菌絲體生長速度最快，最佳碳源與氮源為果糖與牛肉浸粉。如果要得到紅色菌體，且有一定生長速度，可以選擇果糖為碳源，酵母提取物為氮源。

3.2討論

不同碳氮源培養(yǎng)基上生長的牛樟芝菌絲體形態(tài)及生長速度上出現(xiàn)的變化，極有可能是由于不同的培養(yǎng)基所含成分刺激牛樟芝中某些基因的表達(dá)導(dǎo)致牛樟芝生長出現(xiàn)的差異[21]，也有可能是由于牛樟芝對(duì)不同碳氮源利用程度不同而直接導(dǎo)致牛樟芝生長速度以及形態(tài)上的不同，菌類對(duì)于不同碳氮源的利用導(dǎo)致其菌絲生長速度出現(xiàn)差異[22]。

[1]胡鷗,張君逸,盧喜.樟芝及其研究開發(fā)概況[J].福建熱作科技,2006,31(4):40-42.

[2]Lu M C,El-Shazly M,Wu T Y,etal.Recent research and development ofAntrodiacinnamomea[J].Pharmacology & therapeutics,2013,139(2):124-156.

[3]陳體強(qiáng),方忠王.珍稀藥用菌樟芝研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].食用菌學(xué)報(bào),2003,10(4):55-60.

[4]張毅紅,趙宗杰,謝海濤,等.樟芝三萜類化合物的抗炎作用[J].中國病理生理雜志,2015,31(2):369-373.

[5]Chen C C,Liu Y W,Ker Y B,etal.Chemical characterization and anti-inflammatory effect of polysaccharides fractionated from submerge-culturedAntrodiacamphoratamycelia[J].Journal of agricultural and food chemistry,2007,55(13):5007-5012.

[6]Geethangili M,Tzeng Y M.Review of pharmacological effects ofAntrodiacamphorataand its bioactive compounds[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2011(1):1-17.

[7]盧丹,劉金平,李平亞.三萜類化合物抗癌活性研究進(jìn)展[J].特產(chǎn)研究,2010,32(1):65-69.

[8]戰(zhàn)林華,董云,蔣麗芹.樟芝的藥用保健價(jià)值及市場(chǎng)研究分析[J].中外企業(yè)家,2013(5):63-64.

[9]郭立忠,賈培培,郭奇林,等.一種微通氣椴木栽培樟芝的方法[P].CN102047814A,2011.

[10]浦躍武,熊冬生.樟芝的研究及其應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2005,25(2):171-173.

[11]林辰壹,馬娟,楊婷婷,等.優(yōu)化氮源種類及碳氮比對(duì)阿魏菇液體種生長的效應(yīng)[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,49(11):2042-2047.

[12]林衍銓,林興生,余應(yīng)瑞,等.繡球菌生物學(xué)特性若干問題的研究[J].菌物研究,2007,5(4):237-239.

[13]王偉科,袁衛(wèi)東,周祖法.不同碳、氮源對(duì)繡球菌菌絲生長的影響研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(1):47-49.

[14]Chang T T,Wang W R.Basidiomatal formation ofAntrodiacinnamomeaon artificial agar media[J].Botanical Bulletin- Academia Sinica Taipei,2005,46(2):151-154.

[15]劉華,賈薇,劉艷芳,等.珍稀藥用真菌——樟芝深層發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報(bào),2007,34(1):70-74.

[16]賀元川.臺(tái)灣特產(chǎn)珍稀藥用真菌樟芝的深層發(fā)酵研究[D].中國科學(xué)院研究生院,2011.

[17]Lu M C,El-Shazly M,Wu T Y,etal.Recent research and development ofAntrodiacinnamomea[J].Pharmacology & Therapeutics,2013,139(2):124-56.

[18]林衍銓,馬璐,應(yīng)正河,等.碳源和氮源對(duì)繡球菌菌絲生長的影響[J].食用菌學(xué)報(bào),2011,18(3):22-26.

[19]徐鴻雁,杜雙田,孟勝楠,等.不同碳氮源對(duì)紅汁乳菇菌絲生長的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,41(10):125-130.

[20]陳斌,郭愛珍,趙毅,等.不同氮源對(duì)白靈菇菌絲生長的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(1):28-30.

[21]韋洪娟,林貞建,李德海,等.單菌多次級(jí)代謝產(chǎn)物方法及其在微生物代謝產(chǎn)物研究中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào),2010,50(6):701-709.

[22]王爽,李新民,劉春來,等.不同碳氮源對(duì)球孢白僵菌生長及產(chǎn)孢的影響[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(8):47-50.

Effect of Different Carbon and Nitrogen Sources on Mycelia Growth of Antrodia cinnamomea

ZHAO Neng1,2,YUAN Xiao-long2,CHEN Jian2,YANG Yu-ming2,WANG Juan2,WANG Yi2

(1.College of Forestry,Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650224,P.R.China;2.Yunnan province Key Laboratory of Forest Plant Cultivation and Utilization,Yunnan Academy of Forestry,Kunming Yunnan 650201,P.R.China)

In order to studying the effect of different carbon sources and nitrogen sources on mycelia growth ofAntrodiacinnamomea,9 kinds of carbon sources and nitrogen sources were selected and control variable method were used to prepare the medium.The growth of mycelia on different carbon sources,different nitrogen sources and different concentrations of fructose were observed.The result showed that using yeast extract as nitrogen source and using maltose and fructose as carbon source can promote the growth of mycelium rapidly.The growth rate reached1.47mm/d after 30 d’s culturing,and this medium can make the color of mycelium change to be red.The different nitrogen sources experiments showed,using beef extract powder as a nitrogen source can significantly promote the growth ofA.cinnamomea.The growth rate reached 1.51mm/d after 30 d’s culturing,and the color of mycelium was white.When the concentrate of fructose were within 4 %,all relevant indicators increased with the increasing concentrate.This study provide a groundwork for expand breeding culture and large-scale fermentation ofA.cinnamomea,and lay an important theoretical basis to inoculate on the basswood.

Antrodiacinnamomea;different carbon and nitrogen sources;growth rate;color of mycelium

2016-05-04

云南省對(duì)外科技合作計(jì)劃(2015IA004),國家自然科學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31400488),云南省面上基金項(xiàng)目(2016FB055)。

趙能(1991-)，男，碩士研究生，主要從事植物化學(xué)的研究。E-mail：247677981@qq.com

簡介：王毅(1981-)，男，博士，助理研究員，主要從事植物學(xué)和分子生物學(xué)研究。E-mail: 22825818@qq.com

S 646

A

1672-8246(2016)04-0007-06

doi:10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.04.002