王子赫 湯傳昊 劉毅 許彬 秦海峰 雷陽陽 高紅軍 何昆 劉曉晴

隨著近年來肺癌的分子遺傳學(xué)研究的進(jìn)展，晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）治療步入了以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變?yōu)榇淼膫€體化分子靶向治療新時代[1]。近年來EGFR基因檢測方法不斷推陳出新，循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）已作為組織標(biāo)本檢測的補(bǔ)充和替代[2,3]。

然而，臨床實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn)即使EGFR突變陽性患者并非EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）治療都敏感有效，考慮到除EGFR突變以外，下游信號變化等更多生物學(xué)改變對于TKI治療效果存在影響。因此較單從基因突變角度分析而言，腫瘤蛋白組學(xué)研究蛋白表達(dá)可進(jìn)一步精確預(yù)測疾病的發(fā)展變化。隨著蛋白質(zhì)譜技術(shù)平臺的進(jìn)步，自動化和高度平行檢測分析血清蛋白質(zhì)譜變化成為可能[4-6]。

為研究血液蛋白組學(xué)在NSCLC患者EGFR-TKI治療過程中的改變，本研究使用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)，動態(tài)分析治療過程中不同時間節(jié)點(diǎn)的血清差異多肽并分析其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 收集2011年10月-2013年5月在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院肺部腫瘤科就診經(jīng)病理證實(shí)為晚期NSCLC患者接受EGFR-TKI治療的血清。研究對象入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織學(xué)檢測證實(shí)，病理類型為NSCLC；②患者分期為IIIb期或IV期［參照2009年第七版肺部腫瘤腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期］；③肺內(nèi)明確可測量病灶；④服用厄洛替尼、吉非替尼或?？颂婺?，能夠評價客觀療效且服用EGFR-TKI后生存時間不少于3個月；⑤對TKI的最佳總療效均為疾病穩(wěn)定（stable disease, SD）或部分緩解（partial response, PR），所有的患者隨后均出現(xiàn)疾病進(jìn)展（progressive disease, PD），參照2011年版實(shí)體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）；⑥患者可提供足夠血清標(biāo)本；⑦無其他原發(fā)惡性腫瘤；⑧所有患者均經(jīng)臨床檢查排除重要臟器（心、肝、腎等）疾??；⑨所有患者采血均獲得知情同意。

共有34例晚期NSCLC患者符合病例標(biāo)準(zhǔn)入組。本研究每例患者采血3次，分別為：①基線時：入組口服TKI治療前采集血液標(biāo)本；②最佳療效時：臨床評價PR或SD時所留取的血液標(biāo)本；③疾病進(jìn)展時：臨床評價PD后所留取的血液標(biāo)本。34例患者共收集102份血清，102份血清樣本均成功完成質(zhì)譜檢測分析。患者基本情況見表1。

1.2 主要試劑和儀器 2%三氟乙酸、50%乙腈溶液、甲醇、混合標(biāo)肽及銅離子螯合納米磁珠（國家生物醫(yī)學(xué)分析中心）、基質(zhì)輔助激光解析離子化-時間飛行質(zhì)譜儀（matrix-assisted laser desorption ionization time-of- flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）（Ultra flex）、自動平衡離心機(jī)、納米磁珠分離器（MBS），ClinProTools 2.1軟件均為Bruker公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 血清樣品的采集 在患者簽署知情同意后，晨起8：30空腹采集外周靜脈全血 3mL置于 EDTA 管常溫下靜置2 h；后于4 ℃、3,500 r/min、離心10 min；取上清液（血清）100 μL至于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 磁珠處理血清樣品 ①吹打混勻磁珠，吸取5 μL磁珠及50 μL結(jié)合液置于樣品管中；②凍融血清樣本，吸取5 μL血清及20 μL結(jié)合液至樣品管混勻，室溫下于磁珠分離器內(nèi)靜置10 min，編號；③每管在磁珠分離器上移動4次，仔細(xì)用加樣槍吸去懸浮液體→加入100 μL洗滌液→在磁珠分離器上移動4次，用加樣槍棄去懸浮液；④每管加入100 μL洗滌液后在磁珠分離器上移動4次，直至懸浮液清澈用加樣槍棄去，此步驟重復(fù)2次；⑤每管加入20 μL洗脫液，用加樣槍反復(fù)吹打混勻，避免吸取磁珠，后靜置于室溫下 20 min；⑥每支樣品管于磁珠分離器上移動8次，室溫下靜置30 s直至懸浮液清澈；⑦將上清液移至新的樣品管內(nèi)重新編號，完成血清樣本處理過程。

1.3.3 點(diǎn)靶及質(zhì)譜檢測 ①為避免人為操作誤差，MALDITOF儀器使用前用已知標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行誤差校正；②清洗Anchorchip靶；③吸取基質(zhì)（3 mg/mL HCCA、50%乙腈、2%三氟乙酸）與樣品1：1混合，后置于室溫待干燥后上機(jī)檢測；④將樣品靶放入MALDI-TOF儀器進(jìn)行分析；⑤采用線性、正離子模式下打擊樣品，將峰譜累加至3,000次，從而獲得準(zhǔn)確的由不同質(zhì)荷（mass-to-charge ratio, m/z）的多肽峰構(gòu)成的血清多肽指紋譜。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用ClinProTools 2.1軟件對MALDITOF質(zhì)譜儀采集數(shù)據(jù)進(jìn)行處理：首先進(jìn)行Top H at Baseline基線處理和Savitsky Golay Smoothing平滑處理，并過濾掉信噪比＜4的峰，將數(shù)據(jù)校正和歸一化（TIC總離子流）。應(yīng)用峰面積作為選用蛋白峰量化指標(biāo)，得到處理后圖譜。結(jié)果由隨機(jī)軟件ClinPro Tools（Version：2.1）采集信號并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。血清蛋白峰分析統(tǒng)計方法為配對樣本t檢驗，規(guī)定曲線下面積（area under curve,AUC）≥0.9，P＜0.001的多肽峰有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 所有入組患者的一般臨床特征 共入組34例患者，所有患者具體情況見表1。

2.2 療效評價 34例接受EGFR-TKI治療的NSCLC患者按RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)，最佳療效為CR共0例，PR共11例， SD共23例。從開始口服TKI治療起計算，PFS為8.0個月（95%CI： 6.6-11.2），OS為11.4個月（95%CI：10.6-16.5）。以O(shè)S為主要研究終點(diǎn)，隨訪至2015年12月，共有31例患者死亡，3例帶瘤生存，生存曲線見圖1。

2.3 血清多肽結(jié)果

2.3.1 血清多肽指紋圖譜的獲得 應(yīng)用ClinProTools 2.1軟件對MALDI-TOF質(zhì)譜儀采集數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分別得出34例患者整體基線時、最佳療效時及疾病進(jìn)展時多肽指紋圖譜，結(jié)果見圖2。初步觀察，發(fā)現(xiàn)3個時間點(diǎn)指紋圖譜均不相同。為進(jìn)一步明確其間差異多肽峰，使用統(tǒng)計學(xué)軟件對結(jié)果分別進(jìn)行差異鑒定。

2.3.2 基線時與最佳療效時血清自身配對差異多肽結(jié)果 最佳療效時與基線時質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)軟件分析后共鑒定出差異多肽峰87個，篩選出兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001, AUC≥0.9）的多肽峰1個，差異表達(dá)多肽是1,897.16（m/z）。該多肽由基線時表達(dá)水平251.39±277.83，下調(diào)為最佳療效時的36.19±32.01。

圖1 34例患者生存曲線Fig 1 Kaplan-Meier curves of survival of all patients.PFS:progression-free survival; OS: overall survival.

表1 患者基本情況Tab 1 Basic information of patients

2.3.3 基線時與疾病進(jìn)展時血清自身配對差異多肽結(jié)果疾病進(jìn)展時與基線時經(jīng)統(tǒng)計學(xué)軟件分析后共鑒定出差異多肽峰96個，篩選出兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001, AUC≥0.9）的多肽峰3個，具體結(jié)果見表2。差異表達(dá)蛋白分別是7,476.88、6,192.62及7,571.91（m/z）。與基線時相比，最佳療效時m/z為7,476.88及7,571.91的多肽表達(dá)下調(diào)，m/z為6,192.62的多肽表達(dá)上調(diào)。

2.3.4 最佳療效時與疾病進(jìn)展組血清自身配對差異多肽結(jié)果 最佳療效時與疾病進(jìn)展時經(jīng)統(tǒng)計學(xué)軟件分析后共鑒定出差異多肽峰115個，篩選出兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001, AUC≥0.9）的多肽峰4個，具體結(jié)果見表3。差異表達(dá)蛋白分別是8,946.26、7,933.99、4,210.20及5,338.48（m/z）。與最佳療效時相比，疾病進(jìn)展時4個多肽均下調(diào)。

2.3.5 相關(guān)性分析 通過質(zhì)譜軟件分析，最佳療效時與基線時自身配對得出1個差異多肽峰（1,897.16），疾病進(jìn)展時與基線時自身配對得出3個差異多肽峰（7,476.88、6,192.62及7,571.91），最佳療效時與疾病進(jìn)展時自身配對得出4個差異多肽峰（8,946.26、7,933.99、4,210.20及5,338.48）。

將兩兩比較共檢測到的8個差異多肽峰根據(jù)P值從低到高的順序進(jìn)行排列，結(jié)合臨床預(yù)后參數(shù)PFS和OS，并與EGFR突變情況進(jìn)行相關(guān)分析。發(fā)現(xiàn)最佳療效時與基線時自身配對得出的m/z為1,897.16差異多肽峰與PFS有相關(guān)性。疾病進(jìn)展時與基線時自身配對得出3個差異多肽峰中，2個多肽峰（6,192.62及7,571.91）與PFS有相關(guān)性，m/z為7,476.88的多肽峰與OS有統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)。最佳療效時與疾病進(jìn)展時自身配對得出4個差異多肽峰中，7,933.99與OS有統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)，3個多肽峰（8,946.26、4,210.20及5,338.48）與PFS及OS均無相關(guān)性。在24例行基因突變檢測的患者中，14例為EGFR基因突變型患者10例為野生型患者。將EGFR突變檢測結(jié)果與8個差異多肽峰進(jìn)行相關(guān)分析，得出二者之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討論

圖2 血清多肽指紋圖譜。A：基線時；B：最佳療效時；C：疾病進(jìn)展時。Fig 2 Serum peptide profiles of 3 point of time.A:Baseline; B: Best effect; C: Progression of disease.

表2 基線時與疾病進(jìn)展時差異多肽質(zhì)荷比及表達(dá)變化Tab 2 m/z and expression change between the time of baseline and progression of disease

表3 最佳療效時與疾病進(jìn)展時差異多肽質(zhì)荷比及表達(dá)變化Tab 3 m/z and expression change between the time of best effect and progression of disease

對于EGFR基因檢測，目前推薦腫瘤組織標(biāo)本檢測的基礎(chǔ)上，血液（血漿）標(biāo)本檢測ctDNA成為補(bǔ)充手段。與基因檢測相比蛋白質(zhì)組學(xué)包含著基因組學(xué)表達(dá)、執(zhí)行以外的生物學(xué)信息[7-9]，可進(jìn)一步有助于我們深入了解和分析影響肺癌靶向治療敏感性的復(fù)雜因素。質(zhì)譜技術(shù)可以對標(biāo)本中所有的蛋白或多肽進(jìn)行檢測和質(zhì)量測定，能夠找到其他檢測方法可能發(fā)現(xiàn)不到的特定分子量的物質(zhì)[10-12]。

近年來，使用磁珠輔助MALDI-TOF-MS分析NSCLC患者EGFR-TKI治療前血清發(fā)現(xiàn)，通過該方法建立的分類模型，可用于預(yù)測TKI治療效果，從而輔助指導(dǎo)NSCLC患者個體化治療。Taguchi等[13]利用MALDI-TOF檢測139例接受TKI治療前的NSCLC患者血清。通過該方法建立的VeriStrat分類模型可以有效地將96例服用TKI的患者分為“好”（good，中位生存期為306天）和“差”（poor，中位生存期為107天）兩組，且這兩組EGFR-TKI治療后的TTP也有明顯差異，分別為3.2個月和1.9個月（HR=0.53,95%CI： 0.33-0.85,Log-rank：P=0.007）。該模型在多中心證實(shí)有良好的重復(fù)性，可通過檢測TKI治療前患者血清，鑒定TKI獲益人群。Wu等[14]的實(shí)驗對象為68例使用TKI進(jìn)行二線或三線治療的NSCLC患者TKI治療前血請。首先使用MALDI-TOF檢測訓(xùn)練組血清，建立由3個多肽組成的分類模型。使用該模型盲法將44例測試組血清分為“好”組與“差”組的準(zhǔn)確性為93%?！昂谩苯M的OS與PFS明顯高于“差”組。該實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)了使用蛋白分級算法預(yù)測NSCLC患者TKI治療效果的可行性。同時既往我們實(shí)驗組楊琳等[15]通過檢測訓(xùn)練組100例晚期NSCLC患者TKI治療前血清，得出EGFR基因TKI敏感型突變與野生型EGFR基因差異多肽，建立分級算法。該算法在后續(xù)123例確認(rèn)組中證實(shí)有良好的敏感性和特異性。

然而，對于EGFR-TKI治療過程中及疾病進(jìn)展后的血清蛋白組學(xué)發(fā)生了怎樣的變化缺乏系統(tǒng)研究。既往楊學(xué)寧等[16]收集9例晚期NSCLC患者接受吉非替尼（gefitinib）治療前后自身配對的血清樣本20份。使用MALDI-TOF血清蛋白質(zhì)譜檢測，發(fā)現(xiàn)有7個血清蛋白質(zhì)表達(dá)水平在耐藥前后的血清中有統(tǒng)計學(xué)差異，且其中6個差異多肽與TTP相關(guān)，但與OS均不相關(guān)。但遺憾的是，該實(shí)驗樣本例數(shù)較少，需要在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上對結(jié)果加以驗證。

為了明確分析EGFR-TKI治療全程血清蛋白組學(xué)變化，我們選取34例晚期NSCLC患者TKI治療前、最佳療效時及疾病進(jìn)展后的自身配對血清樣本102份進(jìn)行分析。入組的34例患者從開始口服TKI治療起計算，中位PFS為8.0個月，中位總生存期OS為11.4個月，其中TKI治療時機(jī)為一線的8例患者PFS為9.1個月，OS為11.3個月，二線及之后的26例患者PFS為7.8個月，OS為11.1個月。結(jié)果均與大部分臨床試驗數(shù)據(jù)接近。

對患者得出基線時、最佳療效時及疾病進(jìn)展時三個時間點(diǎn)多肽指紋圖譜通過肉眼觀察，可大致發(fā)現(xiàn)三個指紋圖譜均不相同。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，得出有統(tǒng)計學(xué)意義的多肽峰：①最佳療效時與基線時自身配對得出1個差異多肽峰（1,897.16）；②疾病進(jìn)展時與基線時自身配對得出3個差異多肽峰（7,476.88、6,192.62及7,571.91）；③最佳療效時與疾病進(jìn)展時自身配對得出4個差異多肽峰（8,946.26、7,933.99、4,210.20及5,338.48）。

將兩兩比較時共檢測到的8個差異多肽峰根據(jù)P值從低到高的順序進(jìn)行排列，結(jié)合臨床預(yù)后參數(shù)PFS和OS，并與EGFR突變情況進(jìn)行相關(guān)分析。發(fā)現(xiàn)最佳療效時與基線時自身配對得出的m/z為1,897.16差異多肽峰與PFS有相關(guān)性，由此推測在患者治療獲益時血清可檢測到一過性改變，且其與療效預(yù)測相關(guān)。疾病進(jìn)展時與基線時自身配對得出3個差異多肽峰中，2個多肽峰與PFS有相關(guān)性，m/z為7,476.88的多肽峰與OS有統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)。最佳療效時與疾病進(jìn)展時自身配對得出4個差異多肽峰中，7,933.99與OS有統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)，3個多肽峰與PFS及OS均無相關(guān)性。與楊學(xué)寧的結(jié)論不同在于，我們分析出的差異多肽與OS存在相關(guān)性。原因可能在于此次樣本例數(shù)的擴(kuò)大，避免了因為樣本例數(shù)不足而未能與OS產(chǎn)生相關(guān)的可能。另外，這些有差異的多肽其性質(zhì)是什么、特點(diǎn)和功能如何，還需我們今后的多肽功能分析工作中得以驗證。

該研究以MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)為支撐，通過對肺癌患者血液中多肽組的變化，單純檢測EGFR基因突變相比無疑包含著EGFR突變下游信號變化等更多生物學(xué)信息，因此較單從基因突變角度分析更全面。

然而，因本研究僅為單中心、小樣本的探索性研究，且34例患者接受EGFR-TKI治療時機(jī)有所不同，雖然通過自身配對減少個體代謝差異等生物學(xué)差異對結(jié)果的解釋偏倚，但仍不可避免的給本研究帶來了混雜因素。所以未來還需要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那罢靶匝芯俊４送?，為了明確差異多肽的具體性質(zhì)，應(yīng)對差異多肽進(jìn)行分離純化鑒定以進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)功能，探討其對于TKI治療的指導(dǎo)意義。