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        豬藍(lán)耳病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

        2016-08-24 09:33:47張平馬惠琴龍冬梅賀志昊王蕓華楊廷軍貴州省畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心貴州畢節(jié)551700
        甘肅農(nóng)業(yè) 2016年13期
        關(guān)鍵詞:畢節(jié)市病死豬耳病

        張平,馬惠琴,龍冬梅,賀志昊,王蕓華,楊廷軍(貴州省畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,貴州畢節(jié)551700)

        豬藍(lán)耳病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

        張平,馬惠琴,龍冬梅,賀志昊,王蕓華,楊廷軍
        (貴州省畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,貴州畢節(jié)551700)

        2015年8月,畢節(jié)市某豬場(chǎng)發(fā)生一起以發(fā)病豬體溫升高、母豬流產(chǎn)、仔豬高死亡率為特點(diǎn)的傳染病。當(dāng)?shù)孬F醫(yī)根據(jù)臨床癥狀指導(dǎo)用了大量的藥物治療,但效果不佳。通過流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀、剖檢病變,初步診斷為疑似高致病性豬藍(lán)耳病,為確診病原,對(duì)病死豬的組織進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。通過R T-PCR試驗(yàn)檢測(cè),確診為高致病性豬藍(lán)耳病毒陽性。

        豬藍(lán)耳病病毒;實(shí)驗(yàn)室檢測(cè);實(shí)時(shí)熒光R T-PCR

        高致病性豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)變異毒株引起的一種急性、高傳染性、高致病性的疫病,目前已成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。豬藍(lán)耳病病毒于2005年發(fā)生變異后引起高致病性豬藍(lán)耳病,發(fā)病率、致死率均顯著增高。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報(bào)告疫病,我國(guó)列為二類動(dòng)物疫病。由于最先在歐洲的臨床病例出現(xiàn)特有的豬的耳朵藍(lán)灰色病變,我國(guó)學(xué)者、飼養(yǎng)人員和臨床獸醫(yī)將其簡(jiǎn)稱為豬藍(lán)耳病或藍(lán)耳病[1-5]。該病有美洲株和歐洲株兩大類型,美洲株最早在美國(guó)發(fā)現(xiàn),20世紀(jì)90年代后傳入我國(guó)。2015年8月,畢節(jié)市某豬場(chǎng)發(fā)生一起以發(fā)病豬體溫升高、母豬流產(chǎn)、仔豬高死亡率為特點(diǎn)的傳染病。當(dāng)?shù)孬F醫(yī)根據(jù)臨床癥狀指導(dǎo)用了大量的藥物治療,但效果不佳。通過臨床癥狀、剖檢病變,初步診斷為疑似高致病性豬藍(lán)耳病,綜合流行病學(xué)信息、臨床表現(xiàn)及剖檢病變懷疑為豬藍(lán)耳病病毒或豬瘟病毒感染,也可能為二者混合感染,為對(duì)該病例作出確切性診斷,特進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。對(duì)畢節(jié)某規(guī)模豬場(chǎng)出現(xiàn)的妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及部分仔豬發(fā)病的情況,為確診病原,本文利用實(shí)驗(yàn)室實(shí)時(shí)熒光RT-PCR診斷技術(shù),最終確診為豬偽狂犬病毒感染引起。

        一、材料與方法

        (一)材料

        1.病料。采集病死豬只組織(脾臟、淋巴結(jié))放在雙抗PBS溶液中,低溫冷藏保存運(yùn)至畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室。

        2.主要試劑。世紀(jì)元亨豬繁殖與呼吸綜合征病毒(NSP2 1594-1680變異株)檢測(cè)試劑盒,豬藍(lán)耳病病毒熒光定量PCR試劑盒。

        (二)方法

        1.樣品的處理。取病死豬只組織(脾臟、淋巴結(jié)),用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于組織勻漿機(jī)中研磨,加入2mL去離子水,研磨均勻后離心取500μL上清液于滅菌離心管中。

        2.RNA提取。按照豬藍(lán)耳病病毒提取試劑盒說明書進(jìn)行。

        3.實(shí)時(shí)熒光RP-PCR檢測(cè)。反應(yīng)采用25μL體系,反應(yīng)體系為:無菌無核酸水2.7μL,RT-PCR反應(yīng)液10μL,酶混合液0.4μL,熒光探針1.9μL,RNA模板10μL。反應(yīng)條件為:45℃15min,95℃1min;95℃5s,60℃35s,在每個(gè)循環(huán)第二步收集FAM熒光信號(hào),共40循環(huán)(報(bào)告基因“FAM”,淬滅基團(tuán)“NONE”)

        二、試驗(yàn)結(jié)果

        (一)臨床癥狀及藥物治療情況

        采樣時(shí)共有13頭左右發(fā)病,死亡3頭。主要臨床癥狀為:食欲不振、流產(chǎn)、嘔吐、病程短的6~12h死亡,病程長(zhǎng)的死亡前四肢劃動(dòng),有神經(jīng)癥狀。發(fā)病母豬有流產(chǎn)死胎現(xiàn)象腹部發(fā)紅。剖檢主要表現(xiàn)為:肺臟肉變,肝臟充血,腎臟表皮有點(diǎn)狀出血,腸系膜淋巴結(jié)嚴(yán)重腫大。交替使用青鏈霉素、頭孢類、磺胺類等藥物肌肉注射治療,使用多量維生素和干擾素混水飲用,但治療效果不佳。

        (二)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

        經(jīng)畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心采集該場(chǎng)病死豬樣品進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè),結(jié)果顯示,病死豬只組織均檢出疑似高致

        圖1 PRV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果A1:陽性對(duì)照;E1:陰性對(duì)照;B1/C1/D1:待檢樣品

        三、討論

        豬群一旦發(fā)生高致病性豬藍(lán)耳病后極易混合感染或繼發(fā)豬瘟、圓環(huán)病毒、細(xì)菌性疾病等,特別是豬瘟,可以說是豬病的萬惡之源,所以必須搞好豬瘟的預(yù)防和凈化工作[6-9]。其他疾病能使用疫苗免疫預(yù)防的,按免疫程序按時(shí)開展,如果沒有疫苗免疫預(yù)防的,可提前采用一些藥物進(jìn)行預(yù)防[10]。高致病性豬藍(lán)耳病臨床上多表現(xiàn)為母豬的流產(chǎn)和仔豬的腹瀉、神經(jīng)癥狀,僅從臨床表現(xiàn)和剖檢很難將其與有相似癥狀的豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等區(qū)分開來,需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確診。本文采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)流產(chǎn)胎兒組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的檢測(cè),確診了該次疫病由豬偽狂犬病毒引起。為今后實(shí)驗(yàn)室確診豬偽狂犬病提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

        [1]肖琨,徐興斌,李家秀,等.高致病性豬藍(lán)耳病的實(shí)驗(yàn)室診斷[J].貴州畜牧獸醫(yī),2010,34(4):6-7.

        [2]何愛飛,徐春志,方英,等.一起豬瘟與高致病性豬藍(lán)耳病混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷[J].貴州畜牧獸醫(yī),2009,33(4):7-8.

        [3]郭萬正,陳紹柏.豬藍(lán)耳病與豬瘟混合感染的診治報(bào)告[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2001,(9):25-25.

        [4]何海林.豬藍(lán)耳病與豬瘟混合感染診斷的報(bào)告[J].TechnicalAdvisorforAnimalHusbandry,2008(8):77-77.

        [5]張立成,王謝忠,馬麗婭.一起豬瘟和高致病性豬藍(lán)耳病混合感染病例的診斷報(bào)告[C].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2010學(xué)術(shù)年會(huì)暨中國(guó)獸醫(yī)臨床大會(huì),2010:62-62.

        [6]朱意.高致病性豬藍(lán)耳病與豬瘟混感的防制[J].今日畜牧獸醫(yī),2015,(4):22-23.

        [7]滕秀霞,劉國(guó)華,馬秀霞,等.一起豬高致病性豬藍(lán)耳病和豬瘟混合感染疫情發(fā)生的處理和思考[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2011,28(6):66-68.

        [8]王玉梅,張百煉.疑似高致病性豬藍(lán)耳病診治[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2011,(2):66-67.

        [9]吳光明,吳衛(wèi)東.一起高致病性豬藍(lán)耳病和豬副嗜血桿菌病混合感染的診斷[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問,2014,(10):214-215.

        [10]羅洪安.高致病性豬藍(lán)耳病的診斷與防控[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,31(5):98-99.

        (編輯:張瓊瓊)

        S858.28

        B

        1673-9019(2016)13-0034-02

        2016-06-06

        張平(1988-),女,安徽阜陽人,主要從事獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作。病性豬藍(lán)耳病病毒核酸陽性,沒有檢出豬瘟、圓環(huán)病。(見圖1)。由圖可知病死豬組織樣品DNA均呈出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線。

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