李景云， 秦嗣軍， 葛 鵬， 呂德國， 劉靈芝*

(1 沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境學院， 沈陽 110866;2 沈陽農業(yè)大學園藝學院/遼寧省果樹品質發(fā)育與調控重點實驗室， 沈陽 110866)

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不同生育期蘋果園土壤氨氧化微生物豐度研究

李景云1， 秦嗣軍2， 葛 鵬1， 呂德國2， 劉靈芝1*

(1 沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境學院， 沈陽 110866;2 沈陽農業(yè)大學園藝學院/遼寧省果樹品質發(fā)育與調控重點實驗室， 沈陽 110866)

氨氧化微生物； 豐度； 果園酸性土壤； 環(huán)境因子； 熒光定量PCR

果園土壤長期過量施入氮肥導致土壤硝態(tài)氮過量累積問題突出，土壤氮素淋失程度顯著高于一般農田土壤[1]。遼寧省丹東東港地區(qū)自上個世紀90年代初最先開始種植寒富蘋果，近年來果園土壤逐漸呈酸化趨勢，蘋果錳中毒引起的粗皮病[2]、 果實鈣失調等生理障礙發(fā)生較重，制約著寒富蘋果的優(yōu)質安全生產。

硝化作用是土壤氮循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，由氨氧化微生物 (氨氧化細菌, ammonia-oxidizing bacteria， AOB； 氨氧化古菌, ammonia-oxidizing archaea， AOA)參與完成的氨氧化過程是硝化作用的限速步驟，在土壤氮庫調節(jié)方面起著不可替代的作用[3]。氨氧化微生物參與的土壤硝化作用不僅影響果園土壤的進一步酸化，對果園土壤中無機氮素的有效性也具有重要影響。編碼參與氨氧化過程主要酶類的氨單加氧酶(AMO)基因amoA具有較強的保守性，常作為氨氧化微生物的分子標記在許多研究領域被廣泛應用[4]。研究表明，不同土壤生態(tài)系統(tǒng)中AOA與AOB的種群多樣性和amoA基因豐度存在明顯差異[5-6]。AOA多主導酸性土壤中的硝化作用，而AOB則主導中性和堿性土壤中的硝化作用[7]。由于AOA和AOBamoA基因豐度及比值與環(huán)境因子密切相關[8-10]，Wessén等[11]提出氨氧化古菌和細菌的amoA基因豐度可作為生物指標，在一定程度上反映土壤理化因子(氮肥、 pH等)的變化[12-14]。與傳統(tǒng)清耕制果園土壤環(huán)境日趨惡化相比，實行生草制、 提倡施加有機肥等對于重建果園土壤健康具有重要意義。本試驗針對該區(qū)域多年清耕和生草且不同施肥管理的兩種土壤管理方式蘋果園，在不同生育時期(萌芽期、 新梢停長期和落葉期)，采用實時熒光定量PCR技術，研究果園土壤中氨氧化古菌和氨氧化細菌豐度，結合環(huán)境因子與硝化強度分析，以期為預警土壤質量變化，科學調控蘋果園土壤環(huán)境，促進植株生長發(fā)育等提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1土壤樣品采集及處理

采樣地點位于遼寧省丹東地區(qū)東港市長山鎮(zhèn)七股頂村兩個相鄰果園，編號分別為D1和D2。果園為淺緩丘陵地，海拔7至20 m，土壤為棕壤。其中，D1果園自2001年栽植寒富蘋果，果園土壤采用清耕管理； D2果園自1995年栽植寒富蘋果，果園土壤采用自然生草、 人工刈割管理。兩園施用化肥的時間、 種類基本相同，均為每年4月上旬以尿素和磷酸二銨為主配施少量復合肥、 6月下旬施復合肥、 9月上旬施復合肥和硫酸鉀，個別年限還少量施用鈣鎂硼等肥料。全年氮磷鉀施肥量折合: D1果園N、 P2O5、 K2O分別為485、 85、 443 kg/hm2，D2果園N、 P2O5、 K2O分別為418、 143、 300 kg/hm2。另外，D1和D2果園于9月上旬各撒施少量雞糞與秸稈堆漚的農家肥15 t/hm2和37.5 t/hm2。

試驗分別于2012年4月28日(萌芽期)、 7月24日(新梢停長期)、 10月23日(落葉期)采樣。取樣點位于樹冠下，距樹干1.5 m處。垂直向下取0—20 cm的土壤樣品，去除表層尚未腐爛的雜草等覆蓋物，5點采樣混合處理作為1次重復，去除根系和石礫等土壤入侵物，采用“四分法”取1 kg土樣于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，每個果園取3個重復土樣。土壤理化性質測定參照鮑士旦等[15]方法。

1.2土壤硝化強度測定

土壤硝化強度的測定參照趙爽等[16]的方法: 稱取5 g鮮土樣3份，分別置于100 mL三角瓶中，加2.5 mL NaClO3(75 mmol/L)，其中兩份在25℃下培養(yǎng)24 h，另一份置于-20℃冰箱中24 h作對照。培養(yǎng)結束后每份加5 mL去離子水、 10 mL 2 mmol/L KCl溶液，完全搖勻后立即過濾，吸取5 mL濾液放入試管中，加3 mL NH4Cl緩沖溶液(0.19 mmol/L, pH 8.5)、 2 mL磺胺試劑，搖勻后室溫下放置15 min，520 nm波長下比色。按以下公式計算:

1.3土壤微生物總DNA提取

土壤微生物DNA的提取采用CWBIO Soil Gen DNA Kit說明書方法進行。獲得DNA樣品后用微量核酸蛋白質分析儀(Nanodrop2000 UV-Vis Spectrophotometer, Thermo Scientific)測其濃度，并采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的質量，-20℃保存。

1.4熒光定量PCR

表1　AOA和AOB定量PCR 擴增引物及反應條件

2　結果與分析

2.1不同生育時期寒富蘋果園土壤基本理化性質和硝化強度

不同采樣時期的果園土壤硝化強度表明，果園土壤硝化強度隨季節(jié)變化表現(xiàn)出先降后增的趨勢(圖1)，除7月份D2果園土壤硝化強度顯著高于D1果園土壤外，4月與10月D2果園土壤硝化強度均顯著低于D1果園土壤。

圖1　不同生育時期蘋果園土壤硝化強度的變化Fig.1　Potential nitrification of soils at different growth stages of apple

表2　不同生育時期蘋果園土壤理化性質

注(Note): D1—果園1 Orchard 1； D2—果園2 Orchard 2. 表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差，數(shù)值后不同字母表示不同采樣期處理間差異顯著 Data are mean±standard error. Values followed by different letters indicate significant differences among treatments of different sampling dates (P<0.05).

2.2不同生育期土壤氨氧化微生物種群豐度的變化情況

由圖2所示，同一采樣時期，D2果園土壤的AOA和AOBamoA基因拷貝數(shù)均顯著高于D1土壤； 隨生育期延長，D1果園土壤AOAamoA基因表達量呈上升趨勢，D2果園土壤除4月顯著高于后兩個時期，后兩個時期無顯著差異； D1果園土壤 AOBamoA基因隨生育期延長先增后降，D2果園土壤卻表現(xiàn)出一定的上升趨勢。

圖2　不同生育時期蘋果園土壤中氨氧化微生物amoA基因的豐度與比值Fig.2　Abundances and ratios of amoA gene of AOA and AOB in soils at different growth stages of apple[注(Note): D1—果園1 Orchard 1； D2—果園2 Orchard 2. 方柱上不同字母表示處理間在0.05水平差異顯著 Values followed by different letters are significantly different among treatments at 0.05 level. ]

2.3不同生育時期氨氧化微生物豐度與土壤硝化強度(PN)和土壤理化性質的相關關系

表3　氨氧化微生物豐度和土壤硝化強度、 理化性質的相關性分析

注(Note): PN—土壤硝化強度Potential nitrification; *—P<0.05; **—P< 0.01.

3　討論

果樹不同生育期，因溫度、 水分、 施肥量等因素的改變，可導致植株根系分泌物的變化，進而影響土壤理化性質與土壤微生物種群及其活性的相互關系[10]。本研究采用實時熒光定量PCR 技術研究了不同生育時期寒富蘋果園土壤氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細菌(AOB)的豐度，并分析了氨氧化微生物豐度與土壤硝化強度及環(huán)境因子之間的相關性。

氨氧化微生物的硝化潛能、 土壤氮素養(yǎng)分有效性以及果樹氮素養(yǎng)分吸收利用三者之間相互作用，密切相關。微生物合成的胞外酶是調控氮素轉化的重要因素，施肥處理、 不同生育時期根系生理活性及土壤環(huán)境因子的差異都將形成不同功能的微生物群落，從而改變土壤脲酶、 磷酸酶和蛋白酶等的合成與活性，干擾氮轉化的酶調控過程[32]。一些報道認為，蘋果是喜硝植物，盡管一些施肥處理整體上可以增加土壤氨氧化細菌的數(shù)量，與AOB相比，不論有機肥、 無機肥單獨施用還是配施，AOA多為土壤硝化作用的優(yōu)勢類群[33]。因此，在果樹根系-硝化微生物-果園土壤氮循環(huán)系統(tǒng)中，長期或過量施用氮素養(yǎng)分直接或間接地改變根際環(huán)境，影響了氨氧化微生物的種群結構組成與活性，進而影響了植株根系對氮素吸收利用。由于AOA和AOB分別主導不同pH條件下土壤氮代謝的轉化過程，而果園pH值與施肥及土壤管理等有密切的關系。因此，通過檢測AOA與AOB種群結構、 基因豐度與硝化活性的變化，作為潛在的土壤環(huán)境預測指標，分析氮肥施入與土壤酸化的關系，可為科學調控果園投入氮肥種類、 數(shù)量，減緩土壤酸化，維持果園肥力提供參考依據(jù)。

4　結論

不同生育時期‘寒富’蘋果園土壤理化性狀、 氨氧化微生物豐度及土壤硝化強度均表現(xiàn)出不同程度的差異。蘋果園土壤受長期施肥影響逐漸呈酸化趨勢，AOA是蘋果園土壤硝化作用的優(yōu)勢類群，與土壤pH值變化呈顯著正相關。土壤硝化強度受多種土壤環(huán)境因子的調控，蘋果園無機氮肥混合有機肥的施入，同時自然生草、 人工刈割等管理制度，可在一定程度上改變土壤AOA與AOB的豐度與比例，以及土壤氮素的含量與種類，減緩土壤酸化。

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Abundance of ammonia oxidizers in apple orchard soil at different growth stages

LI Jing-yun1, QIN Si-jun2, GE Peng1, Lü De-guo2, LIU Ling-zhi1*

(1CollegeofLandandEnvironment,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China；2CollegeofHorticulture/KeyLabofFruitQualityDevelopmentandRegulationofLiaoningProvince,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China)

ammonia oxidizer; abundance; orchard acidic soil; environmental factor; real-time PCR

2015-01-26接受日期: 2015-04-01網絡出版日期: 2015-12-11

國家自然科學基金項目(31101504, 31171917)； 中國博士后科學基金項目(2011M500575)； 遼寧省高等學校果樹栽培與生理生態(tài)創(chuàng)新團隊(LT2014014)； 遼寧省蘋果科技創(chuàng)新團隊(2014204004)； 遼寧省高等學校優(yōu)秀人才支持計劃(LJQ2014070)； 沈陽市大型儀器共享服務專項(F14-194-4-00)資助。

李景云(1988—)， 女， 河北邯鄲人， 碩士研究生， 主要從事土壤微生物研究。 E-mail: lijingyun08@163.com

E-mail: liulingzhi2006@163.com

S154.54

A

1008-505X(2016)04-1149-08