杜 斌， 陳俊良， 唐篩娣， 陳 煒， 龐慶豐

(江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無錫214122)

［文章編號］ 1000-4718(2016)07-1307-05

·短篇論著·

亞甲藍(lán)對百草枯中毒大鼠胸腺T淋巴細(xì)胞亞群與氧化應(yīng)激的影響*

杜 斌， 陳俊良， 唐篩娣， 陳 煒， 龐慶豐△

(江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無錫214122)

［文章編號］ 1000-4718
(2016)07-1307-05

目的:研究亞甲藍(lán)(methylene blue，MB)對百草枯(paraquat，PQ)中毒大鼠胸腺T淋巴細(xì)胞亞群免疫功能與氧化應(yīng)激的影響。方法:選取Wistar雄性大鼠40只，隨機(jī)分為正常組、模型組、MB低劑量(2 mg·kg－1· d－1)組和MB高劑量(4 mg·kg－1·d－1)組。72 h后HE染色法觀察胸腺組織形態(tài)，比色法測定各組胸腺組織SOD活性及MDA含量，免疫組化試劑盒檢測Bcl-2和Bax和CD4及CD8的表達(dá)。結(jié)果:MB組胸腺皮、髓質(zhì)分界清楚，胸腺細(xì)胞MDA含量減少，SOD活性增加，抗氧化能力提高，Bcl-2和Bax表達(dá)量下調(diào)、Bcl-2/Bax的比值增加，CD4陽性表達(dá)提高。結(jié)論:MB能夠改善PQ對胸腺細(xì)胞的氧化損傷，調(diào)節(jié)胸腺T淋巴細(xì)胞亞群在皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)的分布，從而緩解機(jī)體持續(xù)性損傷。

亞甲藍(lán);百草枯中毒;氧化應(yīng)激;T淋巴細(xì)胞亞群

百草枯(paraquat，PQ)為聯(lián)吡啶類滅生性除草劑，其致死率極高［1］。PQ中毒可引起多臟器的損害，其中以氧化損傷、線粒體功能障礙、炎細(xì)胞活化、蛋白酶失衡等為主［2-3］。亞甲藍(lán)(methylene blue，MB)成本低廉，簡便易得，安全范圍寬且副作用小，在危重病治療中可作為抗氧化劑應(yīng)用［4］。

目前本實(shí)驗(yàn)室已證實(shí)MB能減輕PQ中毒引起的急性肺損傷［5］。因此，本實(shí)驗(yàn)著重研究MB對PQ大鼠中毒氧化應(yīng)激損傷與T淋巴細(xì)胞亞群免疫功能之間的關(guān)系及影響，為進(jìn)一步闡明亞甲藍(lán)對百草枯大鼠中毒免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

材料和方法

1 試劑和儀器

亞甲藍(lán)(蘇州濟(jì)川制藥有限公司);百草枯(上?；葚S生物農(nóng)藥有限公司);兔IgG-免疫組化試劑盒SABC即用型、兔抗Bcl-2抗體和兔抗Bax抗體(博士德公司);免疫組化染色試劑盒和兔抗CD4抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);兔抗CD8抗體、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和考馬斯亮蘭蛋白試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。RM2135石蠟切片機(jī)(Lecia);80i正置熒光顯微鏡(Nikon);U410超低溫冰箱、5804R多功能臺式離心機(jī)(Eppendorf); TG16A-WS臺式離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司);TS-8型漩渦混勻器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司);DK-8B型電熱恒溫水浴槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);ME204E電子天平(METTLER TOLEDO)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量250～280 g，購自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為SCXK(浙)2014-0001。自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料。隨機(jī)分為正常組、模型組、MB低劑量(2 mg·kg－1·d－1)組和MB高劑量(4 mg·kg－1·d－1)組。每組10只。自造模之日起，除正常組外，其余各組一次染毒灌胃百草枯35 mg/kg［6］。造模2 h起，正常組、模型組灌胃生理鹽水，其它各組MB灌胃給藥，每日1次。72 h后取大鼠胸腺，胸腺左葉于－70℃冷凍保存，待檢測。胸腺右葉固定于10%甲醛溶液中，待組織病理學(xué)檢查。

2.2 胸腺組織學(xué)觀察 取胸腺右葉組織放入10%甲醛溶液中固定，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察。

2.3 氧化損傷指標(biāo)的測定 取胸腺左葉組織，用冰鹽水漂洗，剔除脂肪及結(jié)締組織，吸水紙吸干，稱重，放入10 mL離心管中;加入適量的冷生理鹽水，2 000 min/r勻漿10 s，間歇30 s，反復(fù)3次制成10%的組織勻漿;使用冷凍離心機(jī)，4℃、3 500 min/r離心10 min，取上清液測定胸腺組織中SOD的活性和MDA的含量。各指標(biāo)測定按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.4 SABC免疫組化試劑盒檢測Bcl-2和Bax表達(dá)陽性細(xì)胞 常規(guī)脫蠟至水，根據(jù)SABC免疫組化試劑盒說明，電爐煮沸法進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，切片于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)，滴加正常山羊血清封閉液(50 μL)、Bcl-2或Bax抗體、生物素化山羊抗小鼠抗體(50 μL)及SABC(50 μL)，DAB顯色劑，光鏡下控制顯色時間，待細(xì)胞核呈棕黃色時，終止反應(yīng);再用蘇木精復(fù)染，逆梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.5 Bcl-2及Bax陽性細(xì)胞表達(dá)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)［7］每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)，根據(jù)著色程度及著色細(xì)胞陽性范圍進(jìn)行計(jì)算，著色程度以不著色者為0分，著色淡者為1分，中等著色為2分，著色深者為3。著色細(xì)胞陽性范圍以無著色為0分，著色陽性細(xì)胞小于1/3為1分，著色陽性細(xì)胞1/3～1/2為2分，著色陽性細(xì)胞大于1/2為3分;將每張切片著色程度與著色細(xì)胞陽性范圍得分各自相加為其最后計(jì)分。

2.6 免疫組化SP法檢測CD4和CD8表達(dá)陽性細(xì)胞 處死大鼠時胸腺標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，厚4 μm，連續(xù)切片，每例標(biāo)本分別標(biāo)記CD4、CD8抗體(稀釋度均為1∶200)，DAB顯色，光鏡下觀察細(xì)胞著色情況，CD4+和CD8+均為細(xì)胞膜染棕黃色。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的one-way ANOVA方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用SNK-q法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 胸腺組織的病理觀察

正常組胸腺皮、髓質(zhì)分界清楚，細(xì)胞分布于皮質(zhì)，淋巴細(xì)胞較密集，核呈紫藍(lán)色，胞漿較少，為淡紅色;髓質(zhì)部網(wǎng)狀細(xì)胞染色較淺。模型組胸腺皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞呈松散狀分布，細(xì)胞間隙增寬;皮、髓質(zhì)分界較模糊，網(wǎng)狀細(xì)胞減少。MB低、高劑量組胸腺皮髓質(zhì)分界明顯，皮質(zhì)增厚，淋巴細(xì)胞密集，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)規(guī)則，見圖1。

Figure 1.Observation of thymus pathology in each group (×200).圖1 各組大鼠胸腺的病理觀察

2 胸腺組織SOD活性和MDA含量的變化

與正常組比較，模型組大鼠胸腺組織的SOD含量顯著下降(P＜0.05)，MDA含量顯著升高(P＜0.05);與模型組比較，MB低劑量組、高劑量組大鼠胸腺組織的SOD活性均明顯升高(P＜0.05)，MDA含量明顯下降(P＜0.05);MB低劑量組與高劑量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表1。

3 大鼠胸腺組織Bcl-2和Bax的表達(dá)

Bcl-2與Bax陽性結(jié)果呈棕黃色，主要分布于胞膜及胞質(zhì)內(nèi)，深淺不均。與正常組相比，模型組胸腺淋巴細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)量有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05);與模型組相比，MB低劑量組和高劑量組胸腺淋巴細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯減少，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，MB低劑量組與高劑量組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＞0.05)，見圖2、表2。

表1 MB對PQ中毒大鼠胸腺組織的SOD活性和MDA含量變化的影響Table 1.The effects of methylene blue(MB)on SOD and MDA in the rat thymus with paraquat poisoning(Mean±SD.n=10)

Figure 2.The expression of Bcl-2 and Bax in the thymus tissue of each group(immunohistochemistry，×200).圖2 各組大鼠胸腺Bcl-2和Bax表達(dá)的改變

表2 MB對PQ中毒大鼠胸腺組織Bcl-2和Bax表達(dá)的影響Table 2.The effects of methylene blue(MB)on Bcl-2 and Bax of thymus in rats with paraquat poisoning(Mean±SD.n=10)

4 大鼠胸腺組織CD4和CD8的表達(dá)

CD4和CD8陽性結(jié)果呈棕黃色，主要分布于胞膜，深淺不均。正常組胸腺有明顯的皮質(zhì)和髓質(zhì)分界，皮質(zhì)、髓質(zhì)區(qū)以不同發(fā)育階段的淋巴細(xì)胞為主，皮質(zhì)區(qū)CD4和CD8陽性表達(dá)低于髓質(zhì)區(qū)。模型組胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)分界不清，CD4和CD8陽性表達(dá)較少，且皮質(zhì)、髓質(zhì)區(qū)陽性表達(dá)無變化。與模型組比較，MB低、高劑量組CD4陽性表達(dá)明顯，CD8陽性表達(dá)較少，見圖3。

Figure 3.The expression of CD4 and CD8 in the thymus tissue of each group(immunohistochemistry，×200).圖3 各組大鼠胸腺CD4和CD8表達(dá)的改變

討論

胸腺是重要的中樞免疫器官之一，是T淋巴細(xì)胞分化的重要場所。因此胸腺結(jié)構(gòu)的衰退和功能下降勢必會影響機(jī)體的體液、細(xì)胞免疫功能，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能失調(diào)［8］。胸腺皮、髓質(zhì)分界是否明顯，皮質(zhì)是否增厚，淋巴細(xì)胞密集程度等形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)能間接反映胸腺功能水平。本實(shí)驗(yàn)中，MB低、高劑量組胸腺皮、髓質(zhì)分界清楚，未見其它明顯變化。因此，MB對胸腺功能有一定的保護(hù)作用。

在PQ中毒后，機(jī)體出現(xiàn)持續(xù)性氧化損傷，消耗大量SOD，同時機(jī)體氧自由基產(chǎn)生過多，從而使MDA含量增高，SOD活性下降［9］。研究表明通過增加SOD活性，降低MDA水平，可以判斷PQ中毒后早期炎癥損害有所減輕［10］。本實(shí)驗(yàn)中，MB通過減少胸腺細(xì)胞MDA水平，增加SOD活性，從而減少PQ對機(jī)體早期造成的持續(xù)性氧化損傷。

PQ對機(jī)體造成的持續(xù)性氧化損傷，胸腺出現(xiàn)凋亡時，可能對機(jī)體免疫細(xì)胞造成一定損傷。關(guān)于Bcl-2和Bax參與機(jī)體細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生有關(guān)［11］。Bcl-2 和Bax作為凋亡相關(guān)蛋白，兩者的作用是相互拮抗的，Bcl-2/Bax比值似乎較Bcl-2表達(dá)對抑制凋亡更有意義［12］。MB在PQ中毒大鼠模型中可減輕胸腺細(xì)胞持續(xù)凋亡，其作用機(jī)制與下調(diào)Bcl-2和Bax表達(dá)量、增加Bcl-2/Bax的比值有關(guān)。

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不同淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量發(fā)生異常時，可引起機(jī)體細(xì)胞免疫功能紊亂［13］。正常胸腺的皮質(zhì)、髓質(zhì)區(qū)CD4和CD8陽性表達(dá)分布不同，皮質(zhì)區(qū)CD4和CD8陽性表達(dá)低于髓質(zhì)區(qū)。MB低、高劑量組CD4陽性表達(dá)有差異，CD8陽性表達(dá)無差異。因此，MB可能使CD4/CD8比值出現(xiàn)增高，可緩解機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫細(xì)胞間的相互作用，從而改善PQ引起機(jī)體持續(xù)性免疫功能的紊亂。

因此，MB能夠改善PQ對機(jī)體造成的持續(xù)性氧化損傷，可能與其通過緩解PQ對胸腺細(xì)胞的氧化損傷，調(diào)節(jié)胸腺T淋巴細(xì)胞亞群皮質(zhì)、髓質(zhì)區(qū)的分布，從而緩解機(jī)體持續(xù)性損傷。本研究為探索PQ中毒的發(fā)病機(jī)制和臨床應(yīng)用提供了一種新思路。胸腺組織細(xì)胞及血液中Bcl-2、Bax、CD4和CD8的定量研究及兩者之間的關(guān)系沒有進(jìn)一步探討，也是本實(shí)驗(yàn)室今后研究的方向。

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅 森)

Effect of methylene blue on T-lymphocyte subsets and oxidative stress in rat thymus with paraquat poisoning

DU Bin，CHEN Jun-liang，TANG Shai-di，CHEN Wei，PANG Qing-feng

(School of Wuxi Medicine，Jiangnan University，Wuxi 214122，China.E-mail:qfpang@jiangnan.edu.cn)

AIM:To illustrate the effect of methylene blue(MB)on T-lymphocyte subsets and oxidative stress of the thymus in rats with paraquat(PQ)poisoning.METHODS:Male SD rats(n=40)were randomly assigned to 4 groups:normal group，control group，low-dose(2 mg·kg－1·d－1)MB group and high-dose(4 mg·kg－1·d－1)MB group.After 72 h，the pathological morphological changes of the thymus were observed under microscope with HE staining.The SOD activity and MDA content were measured by colorimetry method.The expression of Bcl-2，Bax，CD4 and CD8 was determined by immunohistochemical method.RESULTS:In MB group，the thymus tissue showed good corticomedullary demarcation.MDA content decreased and SOD activity increased，indicating that the ability of antioxidation enhanced.Bcl-2 and Bax expression was down-regulated，Bcl-2/Bax ratio increased，and CD4 positive cells increased.CONCLUSION:MB protects against oxidative damage induced by PQ，and regulates the distribution of T-lymphocyte subsets in the cortex and medulla，thus relieving the persistent body damage.

Methylene blue;Paraquat;Oxidative stress;T-lymphocyte subsets

R994.6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.025

2016-01-07

2016-04-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81270126)

△Tel:0510-85328363;E-mail:qfpang@jiangnan.edu.cn