謝 靜， 史棟梁， 郭會(huì)卿

(河南省中醫(yī)院風(fēng)濕骨病科，河南鄭州450002)

SREBP-2沉默抑制衣霉素誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

謝 靜， 史棟梁， 郭會(huì)卿△

(河南省中醫(yī)院風(fēng)濕骨病科，河南鄭州450002)

目的:探究固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(SREBP-2)對(duì)衣霉素誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的影響。方法:分離人正常軟骨細(xì)胞和骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，衣霉素和SREBP-2 siRNA分別處理正常軟骨細(xì)胞。24 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)微小RNA-185(miR-185)表達(dá)的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，Western blot法檢測(cè)對(duì)SREBP-2、CHOP、p-eIF2α和ATF4等ERS相關(guān)蛋白，Bcl-2、Bax和caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白水平的影響;caspase-3活性試劑盒檢測(cè)對(duì)細(xì)胞caspase-3活性的影響。結(jié)果:與對(duì)照組相比，OA組和衣霉素組SREBP-2表達(dá)增加，miR-185表達(dá)降低(P＜0.05)。SREBP-2 siRNA轉(zhuǎn)染可明顯阻斷衣霉素引起的miR-185降低(P＜0.05)。miR-185過(guò)表達(dá)能夠下調(diào)SREBP-2蛋白水平(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，OA組和衣霉素組CHOP、peIF2α和ATF4的蛋白水平明顯上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax和caspase-3表達(dá)增加(P＜0.05);SREBP-2沉默處理則顯著逆轉(zhuǎn)上述蛋白表達(dá)(P＜0.05)。細(xì)胞凋亡率與上述細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化趨勢(shì)一致(P＜0.05)。與衣霉素組相比，SREBP-2 siRNA轉(zhuǎn)染明顯下調(diào)caspase-3活性，miR-185抑制則明顯逆轉(zhuǎn)上述作用(P＜0.05)。結(jié)論: SREBP-2沉默可通過(guò)上調(diào)miR-185抑制衣霉素誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞ERS和細(xì)胞凋亡。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2;衣霉素;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;軟骨細(xì)胞;微小RNA-185

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征，并伴隨關(guān)節(jié)周圍滑膜炎癥的慢性關(guān)節(jié)疾病。研究表明，軟骨細(xì)胞凋亡為軟骨退變的主要誘因和分子生物學(xué)基礎(chǔ)。其中，氧化損傷、炎癥損傷、免疫功能失衡等病理機(jī)制在該病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是由各種刺激引起的亞細(xì)胞器病理狀態(tài)，因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白積聚而產(chǎn)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)。文獻(xiàn)顯示，衣霉素(tunicamycin，Tuni)處理的軟骨細(xì)胞可作為研究OA疾病發(fā)展的細(xì)胞模型［1］，衣霉素通過(guò)引起ERS導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡［2］。因此，可通過(guò)阻斷ERS，減少軟骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而降低OA患者的軟骨缺失，最終防治OA發(fā)生與發(fā)展。

最新研究表明，OA可能是一種代謝類疾?。?］。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory elementbinding proteins，SREBPs)是調(diào)節(jié)脂類代謝的轉(zhuǎn)錄因子，在膽固醇穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］。有報(bào)道SREBP-2與OA病理過(guò)程相關(guān)［4］。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探究SREBP-2對(duì)衣霉素誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞ERS和細(xì)胞凋亡的影響以及相關(guān)機(jī)制。

材料和方法

1 材料與試劑

衣霉素(Sigma);Lipofectamine 2000、胰酶(Invitrogen);胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco);微小 RNA-185(micro-RNA-185，miR-185)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(Gene Copia);BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo);6孔板(Corning);ECL、caspase-3活性檢測(cè)試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠II抗和山羊抗兔II抗(碧云天生物技術(shù)研究所);anti-miR-185 mimics和scrambled mimics(銳博生物公司);靶向人SREBP-2 siRNA、scrambled siRNA以及兔多抗Bcl-2、Bax、β-actin、ATF4和CHOP (Santa Cruz);兔多抗caspase-3(Upstate);兔單抗peIF2α(CST);0.2%Ⅱ型膠原酶(Millipore);其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和傳代 正常軟骨細(xì)胞和OA軟骨細(xì)胞分別來(lái)自河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷截肢患者和OA行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者，此過(guò)程均得到河南中醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者完全知情同意。術(shù)中無(wú)菌條件下削取足量關(guān)節(jié)面軟骨，移至無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基，冰上保存。去除多余組織，切成小顆粒，PBS洗滌后，加入0.25%胰蛋白酶液，37℃搖床中放置30 min。棄酶液，PBS洗3次。加入0.2%Ⅱ型膠原酶溶液，37℃搖床中放置4 h。120目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集懸液。1 000 r/min離心7 min，PBS洗3次后，用含10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，保持培養(yǎng)條件穩(wěn)定。

2.2 細(xì)胞分組處理及轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)軟骨細(xì)胞分為OA軟骨細(xì)胞組、正常軟骨細(xì)胞組、衣霉素組、SREBP-2 siRNA組和衣霉素+SREBP-2 siRNA組。將軟骨細(xì)胞按每孔4×105接種6孔板，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書，分別將 50 nmol/L SREBP-2 siRNA、scrambled siRNA、anti-miR-185 mimics和 scrambled mimics轉(zhuǎn)染正常軟骨細(xì)胞。48 h后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。各組細(xì)胞用相應(yīng)處理的培養(yǎng)基孵育時(shí)間一致。無(wú)水乙醇配制衣霉素儲(chǔ)液，實(shí)驗(yàn)前用含0.5%FBS培養(yǎng)基稀釋至0.5 mg/L。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)細(xì)胞miR-185的表達(dá) 將軟骨細(xì)胞或者轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞按每孔4×105個(gè)接種6孔板，過(guò)夜后無(wú)血清處理。12 h后，向各組分別加相應(yīng)處理的培養(yǎng)液。miR-185表達(dá)的檢測(cè)嚴(yán)格按microRNA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將軟骨細(xì)胞或者轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞按每孔4×105個(gè)的密度接種6孔板，過(guò)夜后無(wú)血清處理。12 h后，向各組分別加相應(yīng)處理的培養(yǎng)液。作用24 h后收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，加入預(yù)冷75%乙醇，4℃固定4 h以上。離心棄上清，PBS洗滌后，加入500 μL binding buffer懸浮細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-EGFP混勻后，再加入5 μL PI，混勻。室溫、避光、反應(yīng)5～15 min。1 h內(nèi)，上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) 將軟骨細(xì)胞或者轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞按每孔4×105接種6孔板，過(guò)夜后無(wú)血清處理。12 h后，向各組分別加相應(yīng)處理的培養(yǎng)液。作用24 h后收集細(xì)胞，加RIPA裂解液，提取細(xì)胞全蛋白。經(jīng)BCA定量、上樣、SDSPAGE分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、I抗孵育、II抗孵育和ECL顯影等步驟，檢測(cè)各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)。

2.6 Caspase-3活性的檢測(cè) 獲取細(xì)胞裂解液，置于冰上，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定caspase-3的活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 SREBP-2和miR-185在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)

通過(guò)酶兩步消化法成功獲得原代人正常軟骨細(xì)胞和OA軟骨細(xì)胞。與正常軟骨細(xì)胞對(duì)照組相比，OA組和衣霉素組SREBP-2蛋白表達(dá)顯著增加，miR-185水平顯著降低(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of SREBP-2 and miR-185 in the normal chondrocytes and OA chondrocytes.Tuni:tunicamycin.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs OA group;#P＜0.05 vs control group.圖1 SREBP-2和miR-185在正常軟骨細(xì)胞和OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)

2 衣霉素處理下SREBP-2和miR-185表達(dá)相互調(diào)節(jié)

SREBP-2 siRNA轉(zhuǎn)染正常軟骨細(xì)胞可顯著降低SREBP-2蛋白表達(dá)，上調(diào)miR-185水平(P＜0.05)。與正常軟骨細(xì)胞對(duì)照組相比，OA組和衣霉素組miR-185水平降低，SREBP-2蛋白水平增加，SREBP-2 siRNA轉(zhuǎn)染則明顯上調(diào)miR-185水平(P＜0.05)，miR-185過(guò)表達(dá)則下調(diào)衣霉素誘導(dǎo)的SREBP-2蛋白水平(P＜0.05)。可見，衣霉素處理下，SREBP-2和miR-185表達(dá)相互影響，相互調(diào)節(jié)，見圖2。

Figure 2.SREBP-2 and miR-185 expression interacted with each other in the normal chondrocytes with tunicamycin(Tuni)treatment.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs OA group;#P＜0.05 vs control group.圖2 衣霉素處理下正常軟骨細(xì)胞SREBP-2和miR-185表達(dá)相互影響

3 SREBP-2沉默抑制衣霉素誘導(dǎo)的ERS

Western blot結(jié)果顯示，與正常軟骨細(xì)胞對(duì)照組相比，OA組和衣霉素組CHOP、p-eIF2α和ATF4蛋白表達(dá)顯著增加，SREBP-2沉默則作用相反。而且SREBP-2沉默顯著下調(diào)衣霉素誘導(dǎo)的ERS相關(guān)蛋白表達(dá)(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of tunicamycin(Tuni)and SREBP-2 silencing on ERS in the normal chondrocytes.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs OA group;#P＜0.05 vs control group.圖3 衣霉素和SREBP-2沉默處理對(duì)正常軟骨細(xì)胞ERS的影響

4 SREBP-2沉默抑制衣霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

Western blot結(jié)果顯示，與正常軟骨細(xì)胞對(duì)照組相比，OA組和衣霉素組Bax和caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少(P＜0.05); SREBP-2沉默組則作用相反。而且SREBP-2沉默處理可顯著抑制衣霉素引起的細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率與上述細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致(P＜0.05)，見圖4。

5 抑制miR-185表達(dá)可阻斷SREBP-2沉默引起的軟骨細(xì)胞caspase-3活性降低

與正常軟骨細(xì)胞對(duì)照組相比，OA組和衣霉素組細(xì)胞相對(duì)caspase-3活性明顯升高。而SREBP-2 si RNA轉(zhuǎn)染明顯下調(diào)衣霉素引起的細(xì)胞相對(duì)caspase-3活性升高，miR-185抑制則阻斷SREBP-2沉默引起的軟骨細(xì)胞caspase-3活性降低(P＜0.05)，見圖5。

討論

OA是一種衰老性疾病，是老年人關(guān)節(jié)疼痛和致殘的主要原因。該病最早最主要的病理變化是由關(guān)節(jié)軟骨起始，影響包括軟骨下骨、滑膜、關(guān)節(jié)囊、肌腱韌帶及周圍肌肉組織在內(nèi)的整個(gè)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨全部脫失，最終關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。若OA患者能早期確診并進(jìn)行干預(yù)，可避免關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)一步惡化，降低中晚期OA發(fā)生率和致殘率。因此，尋找新的OA分子標(biāo)記將有助于OA的早期診斷、治療和發(fā)病機(jī)制的研究。

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中惟一細(xì)胞類型，在維持正常軟骨代謝中具有關(guān)鍵作用。軟骨細(xì)胞凋亡引起的細(xì)胞數(shù)目減少是OA最主要的病理表現(xiàn)之一，進(jìn)而導(dǎo)致OA發(fā)生。細(xì)胞凋亡主要通過(guò)死亡受體途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑等3種信號(hào)通路發(fā)生。適度ERS具有細(xì)胞保護(hù)作用，過(guò)高和持久的ERS則可通過(guò)誘導(dǎo)ERS相關(guān)蛋白表達(dá)和激活相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，ERS引起的軟骨細(xì)胞凋亡促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨退化［2］。SREBP-2在OA軟骨細(xì)胞中高表達(dá)，與OA病理過(guò)程密切相關(guān)［4］。miR-185在多種癌組織中低表達(dá)［5］，miR-185下調(diào)可作為人軟骨肉瘤診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)記［6］，而且miR-185可抑制衣霉素誘導(dǎo)的ERS［7］。本研究表明，與人正常軟骨細(xì)胞相比，OA對(duì)照組和衣霉素組SREBP-2表達(dá)增加，miR-185降低;SREBP-2沉默可顯著上調(diào)衣霉素引起的miR-185降低。

SREBPs是與固醇調(diào)節(jié)元件DNA序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，能激活膽固醇代謝和生物合成基因［8］，促進(jìn)低密度脂蛋白攝?。?］。研究發(fā)現(xiàn)，SREBP-2通過(guò)與Smad3相互作用，參與調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨主要結(jié)構(gòu)成分的形成［10］。ERS可誘導(dǎo)SREBP-2激活和細(xì)胞凋亡，引發(fā)腎臟近曲小管細(xì)胞損傷［11］。此外，miR-185具有心肌保護(hù)作用，能抑制ERS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［7］。文獻(xiàn)進(jìn)一步表明，miR-185可通過(guò)調(diào)控肝細(xì)胞中SREBP-2及相關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)和活性，維持膽固醇穩(wěn)態(tài)，且SREBP-2的調(diào)節(jié)作用依賴于miR-185表達(dá)，SREBP-1c能通過(guò)膽固醇反應(yīng)反饋回路調(diào)節(jié)miR-185表達(dá)［9］。miR-185能通過(guò)下調(diào) SREBP-1和SREBP-2及其靶基因表達(dá)，調(diào)控前列腺癌細(xì)胞中脂肪生成和膽固醇產(chǎn)生，引發(fā)caspase依賴性的細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤進(jìn)程［12］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，OA組和衣霉素處理組軟骨細(xì)胞CHOP、p-eIF2α和ATF4上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax和caspase-3表達(dá)明顯增加，miR-185水平下調(diào);SREBP-2沉默則顯著抑制衣霉素引起的ERS升高和凋亡增加，并上調(diào)miR-185水平。而且，miR-185過(guò)表達(dá)下調(diào)衣霉素引起的SREBP-2增加，miR-185抑制則阻斷SREBP-2沉默引起的軟骨細(xì)胞 caspase-3活性降低。可見，SREBP-2和miR-185之間相互影響，相互調(diào)節(jié)，在衣霉素誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞ERS和細(xì)胞凋亡過(guò)程中共同發(fā)揮著重要作用。

Figure 4.The effects of tunicamycin(Tuni)and SREBP-2 silencing on the apoptosis of the normal chondrocytes.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs OA group;#P＜0.05 vs control group.圖4 衣霉素和SREBP-2沉默處理對(duì)正常軟骨細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5.The effects of tunicamycin(Tuni)，SREBP-2 silencing and miR-185 inhibition on caspase-3 activity in the normal chondrocytes.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs OA group;#P＜0.05 vs control group.圖5 衣霉素、SREBP-2沉默和miR-185抑制處理對(duì)正常軟骨細(xì)胞caspase-3活性的影響

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步探究發(fā)現(xiàn)SREBP-2沉默可通過(guò)上調(diào)miR-185抑制衣霉素誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。但是SREBP-2沉默在軟骨細(xì)胞凋亡中的作用以及調(diào)控OA進(jìn)程的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。SREBP-2有望成為針對(duì)OA疾病的分子作用靶點(diǎn)，亦為其它衰老相關(guān)性疾病的預(yù)防和治療提供新思路。

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅 森)

Effect of SREBP-2 silencing on tunicamycin-induced endoplasmic reticulum stress in chondrocytes

XIE Jing，SHI Dong-liang，GUO Hui-qing

(Department of Rheumatism Bone Disease，Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450002，China.E-mail:qujining@yeah.net)

AIM:To explore the effect of sterol regulatory element-binding protein 2(SREBP-2)on tunicamycin-induced endoplasmic reticulum stress(ERS)in chondrocytes.METHODS:After isolation of human normal chondrocytes and osteoarthritis(OA)chondrocytes，the normal cells were cultured and treated with tunicamycin and SREBP-2 siRNA.After 24 h treatment，fluorescent quantitative RT-PCR(RT-qPCR)was applied to quantify microRNA-185(miR-185)levels.The cell apoptotic rate was determined by flow cytometry.The expression of SREBP-2 and ERS-related proteins，C/EBP homologous protein(CHOP)，phosphorylated eukaryotic initiation factor-2 α(p-eIF2α)and activating transcription factor 4(ATF4)，and the expression of apoptosis-related proteins，Bcl-2，Bax and caspase-3，were determined by Western blot.The caspase-3 activity kit was used to determine the caspase-3 activity.RESULTS:Compared with human normal chondrocytes，both SREBP-2 up-regulation and miR-185 down-regulation were observed in OA chondrocytes (P＜0.05).SREBP-2 siRNA transfection enhanced tunicamycin-inhibited miR-185 level(P＜0.05).miR-185 overexpression reduced tunicamycin-induced SREBP-2 expression(P＜0.05).OA control group and tunicamycin treatment group consistently resulted in ERS and cell apoptosis with concomitant enhancement of CHOP，p-eIF2α and ATF4 proteins，increases in Bax and caspase-3 proteins，and reduction of Bcl-2(P＜0.05).However，SREBP-2 silencing significantly reversed these effects(P＜0.05).The apoptotic rates were consistent with the expression tendency of apoptosis-related proteins(P＜0.05).SREBP-2 siRNA transfection markedly down-regulated tunicamycin-induced caspase-3 activity，which was notably blocked by miR-185 inhibition(P＜0.05).CONCLUSION:SREBP-2 silencing may inhibit tunicamycin-induced ERS and cell apoptosis via up-regulating miR-185 expression.

Sterol regulatory element-binding protein 2;Tunicamycin;Endoplasmic reticulum stress;Chondrocytes;MicroRNA-185

R684.3;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.022

1000-4718(2016)07-1291-06

2016-01-28

2016-05-10

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