李 鵬， 李恒平， 周 東， 丁正華， 黃衛(wèi)東， 王 俊， 張玉毅

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)醫(yī)院1普外科，2婦產(chǎn)科，湖北襄陽(yáng)441000)

PDL1Ig基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受

李 鵬1， 李恒平1， 周 東1， 丁正華1， 黃衛(wèi)東1， 王 俊1， 張玉毅2△

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)醫(yī)院1普外科，2婦產(chǎn)科，湖北襄陽(yáng)441000)

目的:探討程序性死亡因子配體1免疫球蛋白(PDL1Ig)基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)抑制大鼠原位肝移植免疫排斥反應(yīng)的機(jī)制。方法:培養(yǎng)并鑒定大鼠的BMSCs，重組腺病毒pAdEasy-1/PDL1Ig感染BMSCs 72 h后，提取細(xì)胞總蛋白，采用Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMSCs中PDL1Ig的蛋白表達(dá)?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)檢測(cè)未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染后的BMSCs對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞活力的抑制作用。以雄性Wistar大鼠為供體，以雄性SD大鼠為受體，采用改良的兩袖套法進(jìn)行原位肝移植，建立大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型。隨機(jī)分為對(duì)照組、BMSCs治療組、空載體BMSCs治療組(BMSCs/GFP)和轉(zhuǎn)基因治療組(BMSCs/PDL1Ig)，每組10對(duì)。每組隨機(jī)取5只于術(shù)后第7天處死，檢測(cè)外周血白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4和干擾素γ(IFN-γ)水平，檢測(cè)肝功能情況，光學(xué)顯微鏡下觀察移植肝的病理學(xué)變化，另外5只觀察生存情況及時(shí)間。結(jié)果:重組pAdEasy-1/PDL1Ig感染BMSCs 72 h后，BMSCs中有PDL1Ig的蛋白表達(dá)。BMSCs/PDL1Ig抑制淋巴細(xì)胞活力的作用強(qiáng)于BMSCs/GFP。BMSCs/PDL1Ig組的IL-4水平明顯高于其它3組，IL-2和IFN-γ水平也明顯降低(P＜0.05)。各實(shí)驗(yàn)組移植后7 d檢測(cè)肝功能，發(fā)現(xiàn)BMSCs/PDL1Ig組的肝功能改善最明顯，ALT、AST和TBil基本達(dá)到正常水平，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，與BMSCs治療組和空載體BMSCs治療組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。肝組織病理檢查結(jié)果顯示對(duì)照組移植肝發(fā)生了重度排斥反應(yīng)，BMSCs治療組和空載體BMSCs治療組移植肝亦發(fā)生排斥反應(yīng)，但與對(duì)照組比較程度較輕，BMSCs/PDL1Ig組移植肝幾乎沒(méi)有排斥反應(yīng)，受體存活時(shí)間大部分超過(guò)100 d，顯著長(zhǎng)于其它3組(P＜0.05)。結(jié)論:PDL1Ig修飾的BMSCs可抑制大鼠肝移植排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)肝移植免疫耐受，其效果優(yōu)于BMSCs單用。

肝移植;免疫耐受;腺病毒;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;程序性死亡因子配體1免疫球蛋白

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)作用，可有效延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間。程序化死亡因子配體免疫球蛋白(programed death ligand-1 immunoglobulin，PDL1Ig)屬于B7家族成員，主要在抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)、實(shí)質(zhì)器官(心臟、胎盤(pán)和肺)、炎癥反應(yīng)細(xì)胞及惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，介導(dǎo)免疫負(fù)調(diào)控，通過(guò)阻止第二信號(hào)通路抑制T淋巴細(xì)胞的激活，抑制機(jī)體對(duì)自身抗原的不適度應(yīng)答，在維持中樞和外周免疫耐受中發(fā)揮著重要作用，近來(lái)在器官移植免疫中研究較多［1］。由于存在其它第二信號(hào)通路，單純應(yīng)用PDL1Ig往往不能維持移植物長(zhǎng)期存活，研究表明外源基因容易轉(zhuǎn)染BMSCs并能穩(wěn)定表達(dá)，并且不影響B(tài)MSCs的功能和狀態(tài)［2-4］。本實(shí)驗(yàn)用重組腺病毒pAdEasy-1/PDL1Ig轉(zhuǎn)染BMSCs，探討其對(duì)同種異體肝移植急性排斥反應(yīng)的抑制作用。

材料和方法

1 動(dòng)物

成年雄性SD大鼠和Wistar大鼠各40只，體重250 g，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠肝移植相關(guān)藥品、器械由本室提供。

2 主要試劑

檢測(cè)IL-2、IL-4和IFN-γ的ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);重組pAdEasy-1/ PDL1Ig病毒液(已在前期工作中構(gòu)建完畢，構(gòu)建方法詳見(jiàn)本課題組已發(fā)表的文獻(xiàn)［5］);CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(Roche);Western blot試劑盒和胎牛血清(HyClone);L-DMEM培養(yǎng)基和 0.25%胰蛋白酶(Gibco)。流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter);倒置顯微鏡和U-RFLT50顯微光源系統(tǒng)(Olympus)。

3 主要方法

3.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 取出生7 d的SD大鼠脫頸椎處死，分離股骨與脛骨，用LG-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗髓腔直至骨質(zhì)呈白色，移入培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液，去除漂浮的細(xì)胞及其它組織，以后每隔3 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞接近80%融合后，用0.25%胰酶消化，傳代培養(yǎng)，傳至第20代細(xì)胞后，離心沉淀細(xì)胞，棄去上清液，加入PBS用吸管重浮，轉(zhuǎn)移到10 mL離心管以相同方法再離心，重復(fù)3次。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)充分清洗后的細(xì)胞，PBS稀釋法將細(xì)胞濃度降低到1×1010/L，取標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌的流式管，每個(gè)加入100 μL細(xì)胞懸液和5 μL標(biāo)記的細(xì)胞表面抗原(CD29、CD34、CD45和CD90)，混勻后放置在4℃冰箱內(nèi)，避光孵育30 min后離心收集底層細(xì)胞，將制備好的樣品用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其抗原表達(dá)。

3.2 重組pAdEasy-1/PDL1Ig轉(zhuǎn)染BMSCs及目的蛋白表達(dá)的檢測(cè) 按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=200的濃度用重組pAdEasy-1/PDL1Ig病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs，轉(zhuǎn)染率達(dá)到90%，37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，將4×106細(xì)胞用生理鹽水1 mL重懸。提取細(xì)胞總蛋白，采用Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMSCs 中PDL1Ig的蛋白表達(dá)，使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白。

3.3 基因轉(zhuǎn)染后BMSCs的鑒定 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMSCs的表面標(biāo)記物CD29、CD90、CD34 和CD45;體外誘導(dǎo)BMSCs的成骨、成脂肪分化，將第20代細(xì)胞加入培養(yǎng)基中以每孔1×105的密度接種到6孔板。24 h后加入誘導(dǎo)介質(zhì)。成骨誘導(dǎo)介質(zhì)為L(zhǎng)-DMEM，含10%胎牛血清、10 mmol/L β-磷酸甘油、100 nmol/L地塞米松和0.2 mmol/L抗壞血酸。成脂誘導(dǎo)介質(zhì)為L(zhǎng)-DMEM，含10%胎牛血清、1 μmol/L地塞米松、5 mg/L胰島素、0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤和60 μmol/L吲哚美辛。每周換液2次。誘導(dǎo)2周后分別用茜素紅和油紅O溶液染色來(lái)檢測(cè)骨細(xì)胞中的礦物質(zhì)沉淀和脂肪組織中的中性脂肪滴。

再次，《知識(shí)產(chǎn)權(quán)基本法》需要以“開(kāi)放互惠”為視野。在國(guó)際知識(shí)產(chǎn)權(quán)規(guī)則加快變革的歷史背景下，迫切需要以積極推動(dòng)建立知識(shí)產(chǎn)權(quán)全球治理新結(jié)構(gòu)為方向，打擊知識(shí)霸權(quán)、促進(jìn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)發(fā)展的多樣性，積極抵制垂直論壇轉(zhuǎn)移、總結(jié)推廣知識(shí)產(chǎn)權(quán)發(fā)展的“中國(guó)模式”、提出知識(shí)產(chǎn)權(quán)國(guó)際戰(zhàn)略，推動(dòng)形成全面開(kāi)放新格局。因此，《知識(shí)產(chǎn)權(quán)基本法》不僅是嚴(yán)格保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的實(shí)現(xiàn)法、有效激勵(lì)創(chuàng)新發(fā)展的促進(jìn)法，還需要成為提高知識(shí)產(chǎn)權(quán)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力、引導(dǎo)知識(shí)產(chǎn)權(quán)國(guó)際規(guī)則發(fā)展的范式立法例，成為發(fā)展中國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)制度的示范法。

3.4 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR) 以Wistar大鼠脾細(xì)胞為刺激細(xì)胞，SD大鼠T細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞，一組加入BMSCs，另一組加入轉(zhuǎn)染過(guò)PDL1Ig的BMSCs，作單向混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，采用CCK-8試劑盒，檢測(cè)T淋巴細(xì)胞的活力。

3.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立與分組 以近交系Wistar雄性大鼠為供體，以雄性SD大鼠為受體，體重約250 g，各40只。采用改良的Kamada兩袖套法進(jìn)行原位肝移植，建立大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型［5］。40只受體大鼠隨機(jī)分為4組，各10只，分為對(duì)照組(control;肝移植時(shí)不使用任何干預(yù)措施)、BMSCs治療組、空載體BMSCs(BMSCs/GFP)治療組和轉(zhuǎn)PDL1Ig基因BMSCs(BMSCs/PDL1Ig)治療組。以上分組在肝移植時(shí)均由門(mén)靜脈輸注。每組大鼠術(shù)后第7天隨機(jī)取出5只檢測(cè)外周血白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2、IL-4、干擾素(interferon，IFN)-γ水平和肝功能情況。第9天處死后石蠟包埋肝組織切片，用蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，4組間均數(shù)的兩兩比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。繪制4組大鼠的Kaplan-Meier生存曲線，通過(guò)log-rank檢驗(yàn)比較各組生存時(shí)間。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 BMSCs的培養(yǎng)、鑒定及體外誘導(dǎo)BMSCs成骨、成脂肪分化

BMSCs通過(guò)不斷傳代得以純化，但在20代以后，部分細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸緩慢，呈成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，寬大扁平，有的呈多角形或長(zhǎng)梭形，傳代周期延長(zhǎng)，培養(yǎng)上清中細(xì)胞裂片增多，見(jiàn)圖1。選擇 CD29、CD34、CD45和 CD90使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)第20代BMSCs進(jìn)行表面標(biāo)記物檢測(cè)，結(jié)果顯示細(xì)胞高表達(dá)CD29和CD90(98.6%和99.7%)，低表達(dá)造血干細(xì)胞系的標(biāo)志物CD34和CD45(1.8%和5.0%)，見(jiàn)圖2。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，細(xì)胞體積增大，呈短梭形，誘導(dǎo)第7天，細(xì)胞呈多角形，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞顆粒增多。第14天，胞質(zhì)內(nèi)充滿(mǎn)顆粒，細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，細(xì)胞間可見(jiàn)鈣質(zhì)沉積。第21天，細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)72 h后，細(xì)胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn)，約2周后脂滴數(shù)量增加并相互融合，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形或多邊形，油紅染色顯示有大量脂質(zhì)沉淀，可見(jiàn)紅色深染的大量脂滴，說(shuō)明脂肪細(xì)胞生成，說(shuō)明具有成骨和成脂的能力，見(jiàn)圖3。

重組 pAdEasy-1/PDL1Ig轉(zhuǎn)染 BMSCs 72 h后，Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 BMSCs中 pAdEasy-1/ PDL1Ig的蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖4A。pAdEasy-1/PDL1Ig轉(zhuǎn)染BMSCs 72 h后的裂解液中檢測(cè)到分子量約為35.5 kD的特異性條帶，符合PDL1Ig蛋白質(zhì)分子量，表明重組pAdEasy-1/PDL1Ig轉(zhuǎn)染BMSCs后，可表達(dá)目的PDL1Ig。轉(zhuǎn)染后可見(jiàn)綠色熒光也提示目的基因在BMSCs中的表達(dá)，見(jiàn)圖4B。

Figure 1.Cultured bonemarrow mesenchymalstem cells (×100).圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)

Figure 2.The surface markers of BMSCs were detected by flow cytometry with high expression of CD29 and CD90，and low expression of CD34 and CD45.圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物

Figure 3.The adipogenic(A)and osteogenic(B)differentiations of the BMSCs(×200).圖3 BMSCs的成脂和成骨分化

3 轉(zhuǎn)染后的BMSCs的“干性”和“多能性”鑒定

使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)，細(xì)胞高表達(dá)CD29和CD90(97.3% 和99.1%)，低表達(dá)造血干細(xì)胞系的標(biāo)志物CD34和CD45(2.1%和4.8%)，見(jiàn)圖5。誘導(dǎo)其出現(xiàn)成骨和成脂分化，證實(shí)轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞仍為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，見(jiàn)圖6。

Figure 4.The protein expression of PDL1Ig in the BMSCs transfected with pAdEasy-1/PDL1Ig determined by Western blot(A)and green fluorescent protein observation(B，×200).圖4 Western blot和綠色熒光蛋白觀察重組pAdEasy-1/PDL1Ig轉(zhuǎn)染BMSCs后PDL1Ig蛋白的表達(dá)

Figure 5.The surface markers of BMSCs/PDL1Ig were analyzed by flow cytometry with high expression of CD29 and CD90 and low expression of CD34 and CD45.圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物

Figure 6.The adipogenic(A)and osteogenic(B)differentiations of the BMSCs after transfected with pAdEasy-1/ PDL1Ig(×200).圖6 BMSCs/PDL1Ig成脂和成骨分化

4 轉(zhuǎn)染前后BMSCs抑制外周血淋巴細(xì)胞活力的比較

重組PDL1Ig轉(zhuǎn)染BMSCs 72 h后，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)其抑制淋巴細(xì)胞活力的作用分別為90.5%，未轉(zhuǎn)染的BMSCs為42.3%，轉(zhuǎn)染后的抑制淋巴細(xì)胞活力的作用增強(qiáng)(P＜0.05)，見(jiàn)圖7。

Figure 7.BMSCs inhibited the viability of T-lymphocytes in peripheral blood detected by mixed lymphocyte reaction (MLR).Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs BMSCs.圖7 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染后的BMSCs對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞活力的抑制作用

5 大鼠肝移植術(shù)后生存情況、生存時(shí)間的比較

Control、BMSCs、BMSCs/GFP及 BMSCs/PDL1Ig組大鼠肝移植術(shù)后存活時(shí)間分別為(10.0±4.1)d、(23.4±4.0)d、(23.1±3.9)d和(100.0±5.0)d。BMSCs/PDL1Ig組的術(shù)后表現(xiàn)均較前3組良好，該組動(dòng)物在術(shù)后7 d時(shí)無(wú)明顯黃疸，活動(dòng)量正常，進(jìn)食及飲水正常，活動(dòng)敏捷，體重有增加，接近術(shù)前正常狀況，大部分大鼠存活超過(guò)100 d，顯著長(zhǎng)于其它3組(P＜0.05);BMSCs組和BMSCs/GFP組的受鼠存活時(shí)間也明顯長(zhǎng)于control組(P＜0.05)，BMSCs組與BMSCs/GFP組受鼠之間存活時(shí)間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。Kaplan-Meier生存曲線的比較見(jiàn)圖8。

6 大鼠肝移植術(shù)后外周血細(xì)胞因子水平的比較

與control組比較，BMSCs組和BMSCs/GFP組的IL-4水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)，但BMSCs組和BMSCs/GFP組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，BMSCs/PDL1Ig組的IL-4水平明顯高于其它3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)。與control組比較，BMSCs組和BMSCs/GFP組的IL-2 和IFN-γ水平明顯降低(P＜0.05)，但BMSCs組和BMSCs/GFP組的IL-2和IFN-γ水平相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。BMSCs/PDL1Ig組的IL-2和IFN-γ的水平明顯低于其它3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

Figure 8.Kaplan-Meier survival curves showed rat survival time of the 4 groups.圖8 4組大鼠的Kaplan-Meier生存曲線

表1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝移植術(shù)后細(xì)胞因子水平的比較Table 1.Comparison of serum cytokine levels of the rats in the 4 groups after liver transplantation(ng/L.Mean±SD.n=5)

7 肝移植術(shù)后肝功能的檢測(cè)

在各實(shí)驗(yàn)組肝移植后第7天檢測(cè)肝功能，發(fā)現(xiàn)BMSCs組和BMSCs/GFP組的肝功能有改善，總膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶均明顯下降，與control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)，兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。BMSCs/PDL1Ig組的肝功能改善最明顯，在術(shù)后7 d肝功能指標(biāo)基本達(dá)到正常水平，與其它2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組肝移植受體術(shù)后7 d的肝功能檢測(cè)Table 2.The liver function of the recipients after 7 d of liver transplantation(Mean±SD.n=5)

8 大鼠肝移植術(shù)后病理學(xué)檢查結(jié)果的比較

肝移植術(shù)后第9天，肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示control組為重度典型的排斥反應(yīng)，表現(xiàn)為肝細(xì)胞排列紊亂，部分肝細(xì)胞變性壞死，匯管區(qū)大量淋巴細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)，膽管炎癥破壞，中央靜脈炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，中重度靜脈炎，部分肝實(shí)質(zhì)出現(xiàn)壞死區(qū)域。BMSCs組和BMSCs/GFP組的移植肝亦發(fā)生排斥反應(yīng)，部分屬于輕度排斥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少數(shù)匯管區(qū)的膽管和血管，數(shù)量較少，但與control組比較程度較輕。BMSCs/PDL1Ig組的炎癥反應(yīng)最輕，幾乎無(wú)移植排斥反應(yīng)，肝小葉結(jié)構(gòu)排列整齊，類(lèi)似正常肝組織，偶爾僅在匯管區(qū)間隙見(jiàn)到少量的淋巴細(xì)胞或中性粒細(xì)胞，見(jiàn)圖9。

Figure 9.The pathological changes in liver tissues of the rats in the 4 groups on the 9th day after transplantation(HE staining，×100).圖9 4組大鼠術(shù)后第9天的肝組織病理學(xué)變化

討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胚胎發(fā)育早期中胚層的一類(lèi)多能干細(xì)胞，有多向分化潛能，其表面少量表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體MHC-Ⅰ類(lèi)分子，不表達(dá)Ⅱ類(lèi)分子、B7、CD40L等第二信號(hào)分子，具有低免疫原性，不刺激T淋巴細(xì)胞的增殖和分化［6］。BMSCs可分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1、IL-10等可溶性分子，抑制T淋巴細(xì)胞的激活［7-8］，可誘導(dǎo)輔助性T(T helper，Th)細(xì)胞向Th1/Th2細(xì)胞分化偏離，使Th2細(xì)胞比例增多，IL-2和IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，調(diào)節(jié)免疫的功能［9-10］。BMSCs還可通過(guò)直接接觸和分泌負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞因子抑制APC的作用，多項(xiàng)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，BMSCs可向肝細(xì)胞分化，修復(fù)受損肝組織。BMSCs還可被外源基因轉(zhuǎn)染并表達(dá)外源基因，且其免疫調(diào)節(jié)作用、損傷修復(fù)作用、分化作用不受影響，這些功能對(duì)減輕移植器官的排斥反應(yīng)有一定的作用［11-12］。

本研究中，體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMSCs能抑制淋巴細(xì)胞活力，轉(zhuǎn)染PDL1Ig后的BMSCs抑制淋巴細(xì)胞作用更強(qiáng)。采用BMSCs可使原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型大鼠的生存時(shí)間延長(zhǎng)，機(jī)體內(nèi)IL-2和IFN-γ水平較對(duì)照組下降，IL-4水平較對(duì)照組升高，術(shù)后肝臟病理學(xué)檢查結(jié)果顯示排斥反應(yīng)程度減輕，轉(zhuǎn)染PDL1Ig后的BMSCs以上作用更強(qiáng)。因此，本研究證實(shí)了在體內(nèi)、體外BMSCs均可抑制同種異體肝移植排斥反應(yīng)的發(fā)生［13］，器官移植排斥反應(yīng)有多種機(jī)制參與，對(duì)其中一種機(jī)制的干預(yù)往往不能起到明顯的抑制排斥反應(yīng)的理想效果，要想達(dá)到免疫耐受，我們認(rèn)為需要涉及多條路徑［14-15］。研究發(fā)現(xiàn)BMSCs有明確的抑制排斥反應(yīng)的作用，但也有向腫瘤組織分化的可能，具有一定風(fēng)險(xiǎn)，其表面的Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)結(jié)合配體后可導(dǎo)致其抑制T淋巴細(xì)胞的作用消失;另外BMSCs表達(dá)MHCⅠ類(lèi)分子，在與供、受體MHC不符時(shí)，亦可激活CD8+T淋巴細(xì)胞，造成移植器官損傷［16］。因此，單獨(dú)應(yīng)用BMSCs往往不能達(dá)到理想的移植免疫耐受的效果。排斥反應(yīng)主要是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)完成的，根據(jù)Lafferty的“雙信號(hào)”理論，T淋巴細(xì)胞的充分激活需要第一信號(hào)和第二信號(hào)的共同作用才能完成。研究表明，若缺乏第二信號(hào)，T淋巴細(xì)胞的IL-2產(chǎn)量明顯減少，僅為雙信號(hào)作用時(shí)的1/30［17］。目前研究最明確的第二信號(hào)通路為CD28-B7通路，PDL1Ig可有效阻斷CD28-B7通路，對(duì)減輕器官移植術(shù)后排斥反應(yīng)有明確的作用［5］。本研究認(rèn)為共刺激通路阻斷聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受的可能機(jī)制在于BMSCs作為外源抗原，會(huì)被受體免疫系統(tǒng)攻擊消耗一部分，難以完全發(fā)揮免疫抑制作用，重組腺病毒 PDL1Ig轉(zhuǎn)染 BMSCs后，利用其表達(dá)的PDL1Ig阻斷第二信號(hào)通路而達(dá)到的免疫抑制作用可以保護(hù)BMSCs不受侵害，延長(zhǎng)其體內(nèi)生存期，最終創(chuàng)造出了1+1＞2的負(fù)性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)效果，達(dá)到了大鼠肝移植免疫耐受，為指導(dǎo)臨床肝移植免疫耐受提供了新的思路。

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅 森)

PDL1Ig gene-modified BMSCs induce immune tolerance in rat liver transplantation

LI Peng1，LI Heng-ping1，ZHOU Dong1，DING Zheng-hua1，HUANG Wei-dong1，WANG Jun1，ZHANG Yu-yi2

(1Department of General Surgery，2Obstetrics and Gynecology Department，The Affiliated Xiangyang Hospital，Hubei Medical College，Xiangyang 441000，China.E-mail:sharpfast@sina.com)

AIM:To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)modified by programed death ligand-1 immunoglobulin(PDL1Ig)gene on immune rejection of orthotopic liver transplantation in rats.METHODS:Rat BMSCs were cultured and identified.The protein expression of PDL1Ig in the BMSCs 72 h after infection with pAdEasy-1/PDL1Ig was detected by Western blot.Mixed lymphocyte reaction was used to detect the inhibitory effect of BMSCs on the viability of T-lymphocytes in peripheral blood.The male Wistar rats were used as donors(n=40)，and the male SD rats were used as recipients(n=40).The rat model of orthotopic liver transplantation was established by improved cuff method for observing acute rejection.The rats were randomly divided into control group，BMSCs treatment group，BMSCs/GFP treatment group and BMSCs/PDL1Ig treatment group with 10 pairs each.Five rats were executed at the 7th day and the remains were used for measuring the survival time.RESULTS:The expression of PDL1Ig in the BMSCs was detected after pAdEasy-1/PDL1Ig infection.The effect of BMSCs/PDL1Ig on the viability of the lymphocytes was stronger than that of BMSCs/GFP.The level of IL-4 in BMSCs/PDL1Ig group was significantly higher than that in the other 3 groups，while the levels of IFN-γ and IL-2 were significantly decreased.The liver function in BMSCs/PDL1Ig group was significantly improved and the levels of ALT，AST and TBil were almost recovered to normal at the 7th day after transplan-tation.Severe rejection reaction was observed in control group，and rejection reactions were decreased with different degrees in BMSCs treatment group and BMSCs/GFP treatment group.Much slighter rejection reaction and significantly longer survival time were showed in BMSCs/PDL1Ig group than those in the other 3 groups.CONCLUSION:PDL1Ig-modified BMSCs inhibit the rejection of liver transplantation in rats and induce the immune tolerance，and the effect is better than that of BMSCs alone.

Liver transplantation;Immune tolerance;Adenovirus;Bone marrow mesenchymal stem cells; Programed death ligand-1 immunoglobulin

R392.4;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.020

1000-4718(2016)07-1279-06

2015-12-24

2016-05-10

△Tel:0710-3420052;E-mail:sharpfast@sina.com