李 鵬， 李恒平， 周 東， 丁正華， 黃衛(wèi)東， 王 俊， 張玉毅

(湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽醫(yī)院1普外科，2婦產科，湖北襄陽441000)

PDL1Ig基因修飾的骨髓間充質干細胞誘導大鼠肝移植免疫耐受

李 鵬1， 李恒平1， 周 東1， 丁正華1， 黃衛(wèi)東1， 王 俊1， 張玉毅2△

(湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽醫(yī)院1普外科，2婦產科，湖北襄陽441000)

目的:探討程序性死亡因子配體1免疫球蛋白(PDL1Ig)基因轉染骨髓間充質干細胞(BMSCs)抑制大鼠原位肝移植免疫排斥反應的機制。方法:培養(yǎng)并鑒定大鼠的BMSCs，重組腺病毒pAdEasy-1/PDL1Ig感染BMSCs 72 h后，提取細胞總蛋白，采用Western blot法檢測轉染后BMSCs中PDL1Ig的蛋白表達?；旌狭馨图毎磻獧z測未轉染和轉染后的BMSCs對外周血T淋巴細胞活力的抑制作用。以雄性Wistar大鼠為供體，以雄性SD大鼠為受體，采用改良的兩袖套法進行原位肝移植，建立大鼠原位肝移植急性排斥反應模型。隨機分為對照組、BMSCs治療組、空載體BMSCs治療組(BMSCs/GFP)和轉基因治療組(BMSCs/PDL1Ig)，每組10對。每組隨機取5只于術后第7天處死，檢測外周血白細胞介素(IL)-2、IL-4和干擾素γ(IFN-γ)水平，檢測肝功能情況，光學顯微鏡下觀察移植肝的病理學變化，另外5只觀察生存情況及時間。結果:重組pAdEasy-1/PDL1Ig感染BMSCs 72 h后，BMSCs中有PDL1Ig的蛋白表達。BMSCs/PDL1Ig抑制淋巴細胞活力的作用強于BMSCs/GFP。BMSCs/PDL1Ig組的IL-4水平明顯高于其它3組，IL-2和IFN-γ水平也明顯降低(P＜0.05)。各實驗組移植后7 d檢測肝功能，發(fā)現BMSCs/PDL1Ig組的肝功能改善最明顯，ALT、AST和TBil基本達到正常水平，與對照組比較差異有統計學顯著性，與BMSCs治療組和空載體BMSCs治療組比較差異也有統計學顯著性。肝組織病理檢查結果顯示對照組移植肝發(fā)生了重度排斥反應，BMSCs治療組和空載體BMSCs治療組移植肝亦發(fā)生排斥反應，但與對照組比較程度較輕，BMSCs/PDL1Ig組移植肝幾乎沒有排斥反應，受體存活時間大部分超過100 d，顯著長于其它3組(P＜0.05)。結論:PDL1Ig修飾的BMSCs可抑制大鼠肝移植排斥反應，誘導肝移植免疫耐受，其效果優(yōu)于BMSCs單用。

肝移植;免疫耐受;腺病毒;骨髓間充質干細胞;程序性死亡因子配體1免疫球蛋白

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種多能干細胞，具有多向分化潛能和免疫調節(jié)作用，可有效延長移植物的存活時間。程序化死亡因子配體免疫球蛋白(programed death ligand-1 immunoglobulin，PDL1Ig)屬于B7家族成員，主要在抗原呈遞細胞(antigen presenting cell，APC)、實質器官(心臟、胎盤和肺)、炎癥反應細胞及惡性腫瘤細胞中表達，介導免疫負調控，通過阻止第二信號通路抑制T淋巴細胞的激活，抑制機體對自身抗原的不適度應答，在維持中樞和外周免疫耐受中發(fā)揮著重要作用，近來在器官移植免疫中研究較多［1］。由于存在其它第二信號通路，單純應用PDL1Ig往往不能維持移植物長期存活，研究表明外源基因容易轉染BMSCs并能穩(wěn)定表達，并且不影響B(tài)MSCs的功能和狀態(tài)［2-4］。本實驗用重組腺病毒pAdEasy-1/PDL1Ig轉染BMSCs，探討其對同種異體肝移植急性排斥反應的抑制作用。

材料和方法

1 動物

成年雄性SD大鼠和Wistar大鼠各40只，體重250 g，由我院實驗動物中心提供。大鼠肝移植相關藥品、器械由本室提供。

2 主要試劑

檢測IL-2、IL-4和IFN-γ的ELISA檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);重組pAdEasy-1/ PDL1Ig病毒液(已在前期工作中構建完畢，構建方法詳見本課題組已發(fā)表的文獻［5］);CCK-8細胞活力檢測試劑盒(Roche);Western blot試劑盒和胎牛血清(HyClone);L-DMEM培養(yǎng)基和 0.25%胰蛋白酶(Gibco)。流式細胞儀(Beckman Coulter);倒置顯微鏡和U-RFLT50顯微光源系統(Olympus)。

3 主要方法

3.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 取出生7 d的SD大鼠脫頸椎處死，分離股骨與脛骨，用LG-DMEM培養(yǎng)基反復沖洗髓腔直至骨質呈白色，移入培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液，去除漂浮的細胞及其它組織，以后每隔3 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)細胞接近80%融合后，用0.25%胰酶消化，傳代培養(yǎng)，傳至第20代細胞后，離心沉淀細胞，棄去上清液，加入PBS用吸管重浮，轉移到10 mL離心管以相同方法再離心，重復3次。倒置顯微鏡下計數充分清洗后的細胞，PBS稀釋法將細胞濃度降低到1×1010/L，取標準無菌的流式管，每個加入100 μL細胞懸液和5 μL標記的細胞表面抗原(CD29、CD34、CD45和CD90)，混勻后放置在4℃冰箱內，避光孵育30 min后離心收集底層細胞，將制備好的樣品用流式細胞術檢測其抗原表達。

3.2 重組pAdEasy-1/PDL1Ig轉染BMSCs及目的蛋白表達的檢測 按感染復數(multiplicity of infection，MOI)=200的濃度用重組pAdEasy-1/PDL1Ig病毒液轉染BMSCs，轉染率達到90%，37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)72 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，將4×106細胞用生理鹽水1 mL重懸。提取細胞總蛋白，采用Western blot法檢測轉染后BMSCs 中PDL1Ig的蛋白表達，使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白。

3.3 基因轉染后BMSCs的鑒定 使用流式細胞術檢測轉染后BMSCs的表面標記物CD29、CD90、CD34 和CD45;體外誘導BMSCs的成骨、成脂肪分化，將第20代細胞加入培養(yǎng)基中以每孔1×105的密度接種到6孔板。24 h后加入誘導介質。成骨誘導介質為L-DMEM，含10%胎牛血清、10 mmol/L β-磷酸甘油、100 nmol/L地塞米松和0.2 mmol/L抗壞血酸。成脂誘導介質為L-DMEM，含10%胎牛血清、1 μmol/L地塞米松、5 mg/L胰島素、0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤和60 μmol/L吲哚美辛。每周換液2次。誘導2周后分別用茜素紅和油紅O溶液染色來檢測骨細胞中的礦物質沉淀和脂肪組織中的中性脂肪滴。

再次，《知識產權基本法》需要以“開放互惠”為視野。在國際知識產權規(guī)則加快變革的歷史背景下，迫切需要以積極推動建立知識產權全球治理新結構為方向，打擊知識霸權、促進知識產權發(fā)展的多樣性，積極抵制垂直論壇轉移、總結推廣知識產權發(fā)展的“中國模式”、提出知識產權國際戰(zhàn)略，推動形成全面開放新格局。因此，《知識產權基本法》不僅是嚴格保護知識產權的實現法、有效激勵創(chuàng)新發(fā)展的促進法，還需要成為提高知識產權國際競爭力、引導知識產權國際規(guī)則發(fā)展的范式立法例，成為發(fā)展中國家知識產權制度的示范法。

3.4 混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR) 以Wistar大鼠脾細胞為刺激細胞，SD大鼠T細胞為反應細胞，一組加入BMSCs，另一組加入轉染過PDL1Ig的BMSCs，作單向混合淋巴細胞實驗，采用CCK-8試劑盒，檢測T淋巴細胞的活力。

3.5 實驗動物模型的建立與分組 以近交系Wistar雄性大鼠為供體，以雄性SD大鼠為受體，體重約250 g，各40只。采用改良的Kamada兩袖套法進行原位肝移植，建立大鼠原位肝移植急性排斥反應模型［5］。40只受體大鼠隨機分為4組，各10只，分為對照組(control;肝移植時不使用任何干預措施)、BMSCs治療組、空載體BMSCs(BMSCs/GFP)治療組和轉PDL1Ig基因BMSCs(BMSCs/PDL1Ig)治療組。以上分組在肝移植時均由門靜脈輸注。每組大鼠術后第7天隨機取出5只檢測外周血白細胞介素(interleukin，IL)-2、IL-4、干擾素(interferon，IFN)-γ水平和肝功能情況。第9天處死后石蠟包埋肝組織切片，用蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。

4 統計學處理

采用SPSS 22軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，4組間均數的兩兩比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。繪制4組大鼠的Kaplan-Meier生存曲線，通過log-rank檢驗比較各組生存時間。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 BMSCs的培養(yǎng)、鑒定及體外誘導BMSCs成骨、成脂肪分化

BMSCs通過不斷傳代得以純化，但在20代以后，部分細胞生長逐漸緩慢，呈成纖維細胞樣細胞，寬大扁平，有的呈多角形或長梭形，傳代周期延長，培養(yǎng)上清中細胞裂片增多，見圖1。選擇 CD29、CD34、CD45和 CD90使用流式細胞術對第20代BMSCs進行表面標記物檢測，結果顯示細胞高表達CD29和CD90(98.6%和99.7%)，低表達造血干細胞系的標志物CD34和CD45(1.8%和5.0%)，見圖2。成骨誘導培養(yǎng)3 d，細胞體積增大，呈短梭形，誘導第7天，細胞呈多角形，胞質內細胞顆粒增多。第14天，胞質內充滿顆粒，細胞呈集落樣生長，細胞間可見鈣質沉積。第21天，細胞結節(jié)中心的細胞逐漸融合失去細胞結構，鈣結節(jié)形成明顯，經茜素紅染色呈紅色結節(jié)。成脂誘導72 h后，細胞內有小脂滴出現，約2周后脂滴數量增加并相互融合，細胞由長梭形變?yōu)閳A形或多邊形，油紅染色顯示有大量脂質沉淀，可見紅色深染的大量脂滴，說明脂肪細胞生成，說明具有成骨和成脂的能力，見圖3。

重組 pAdEasy-1/PDL1Ig轉染 BMSCs 72 h后，Western blot法檢測轉染后 BMSCs中 pAdEasy-1/ PDL1Ig的蛋白表達結果見圖4A。pAdEasy-1/PDL1Ig轉染BMSCs 72 h后的裂解液中檢測到分子量約為35.5 kD的特異性條帶，符合PDL1Ig蛋白質分子量，表明重組pAdEasy-1/PDL1Ig轉染BMSCs后，可表達目的PDL1Ig。轉染后可見綠色熒光也提示目的基因在BMSCs中的表達，見圖4B。

Figure 1.Cultured bonemarrow mesenchymalstem cells (×100).圖1 骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)

Figure 2.The surface markers of BMSCs were detected by flow cytometry with high expression of CD29 and CD90，and low expression of CD34 and CD45.圖2 流式細胞術檢測骨髓間充質干細胞的表面標志物

Figure 3.The adipogenic(A)and osteogenic(B)differentiations of the BMSCs(×200).圖3 BMSCs的成脂和成骨分化

3 轉染后的BMSCs的“干性”和“多能性”鑒定

使用流式細胞術對轉染后的骨髓間充質干細胞表面標記物檢測，細胞高表達CD29和CD90(97.3% 和99.1%)，低表達造血干細胞系的標志物CD34和CD45(2.1%和4.8%)，見圖5。誘導其出現成骨和成脂分化，證實轉染后的骨髓間充質干細胞仍為骨髓間充質干細胞，見圖6。

Figure 4.The protein expression of PDL1Ig in the BMSCs transfected with pAdEasy-1/PDL1Ig determined by Western blot(A)and green fluorescent protein observation(B，×200).圖4 Western blot和綠色熒光蛋白觀察重組pAdEasy-1/PDL1Ig轉染BMSCs后PDL1Ig蛋白的表達

Figure 5.The surface markers of BMSCs/PDL1Ig were analyzed by flow cytometry with high expression of CD29 and CD90 and low expression of CD34 and CD45.圖5 流式細胞術檢測轉染后骨髓間充質干細胞的表面標志物

Figure 6.The adipogenic(A)and osteogenic(B)differentiations of the BMSCs after transfected with pAdEasy-1/ PDL1Ig(×200).圖6 BMSCs/PDL1Ig成脂和成骨分化

4 轉染前后BMSCs抑制外周血淋巴細胞活力的比較

重組PDL1Ig轉染BMSCs 72 h后，混合淋巴細胞反應檢測其抑制淋巴細胞活力的作用分別為90.5%，未轉染的BMSCs為42.3%，轉染后的抑制淋巴細胞活力的作用增強(P＜0.05)，見圖7。

Figure 7.BMSCs inhibited the viability of T-lymphocytes in peripheral blood detected by mixed lymphocyte reaction (MLR).Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs BMSCs.圖7 混合淋巴細胞反應檢測未轉染和轉染后的BMSCs對外周血T淋巴細胞活力的抑制作用

5 大鼠肝移植術后生存情況、生存時間的比較

Control、BMSCs、BMSCs/GFP及 BMSCs/PDL1Ig組大鼠肝移植術后存活時間分別為(10.0±4.1)d、(23.4±4.0)d、(23.1±3.9)d和(100.0±5.0)d。BMSCs/PDL1Ig組的術后表現均較前3組良好，該組動物在術后7 d時無明顯黃疸，活動量正常，進食及飲水正常，活動敏捷，體重有增加，接近術前正常狀況，大部分大鼠存活超過100 d，顯著長于其它3組(P＜0.05);BMSCs組和BMSCs/GFP組的受鼠存活時間也明顯長于control組(P＜0.05)，BMSCs組與BMSCs/GFP組受鼠之間存活時間的差別無統計學顯著性。Kaplan-Meier生存曲線的比較見圖8。

6 大鼠肝移植術后外周血細胞因子水平的比較

與control組比較，BMSCs組和BMSCs/GFP組的IL-4水平明顯升高，差異均有統計學顯著性(P＜0.05)，但BMSCs組和BMSCs/GFP組之間的差異無統計學顯著性，BMSCs/PDL1Ig組的IL-4水平明顯高于其它3組，差異均有統計學顯著性(P＜0.05)。與control組比較，BMSCs組和BMSCs/GFP組的IL-2 和IFN-γ水平明顯降低(P＜0.05)，但BMSCs組和BMSCs/GFP組的IL-2和IFN-γ水平相近，差異無統計學顯著性。BMSCs/PDL1Ig組的IL-2和IFN-γ的水平明顯低于其它3組，差異均有統計學顯著性(P＜0.05)，見表1。

Figure 8.Kaplan-Meier survival curves showed rat survival time of the 4 groups.圖8 4組大鼠的Kaplan-Meier生存曲線

表1 各實驗組大鼠肝移植術后細胞因子水平的比較Table 1.Comparison of serum cytokine levels of the rats in the 4 groups after liver transplantation(ng/L.Mean±SD.n=5)

7 肝移植術后肝功能的檢測

在各實驗組肝移植后第7天檢測肝功能，發(fā)現BMSCs組和BMSCs/GFP組的肝功能有改善，總膽紅素和轉氨酶均明顯下降，與control組比較差異有統計學顯著性(P＜0.05)，兩組之間比較差異無統計學顯著性。BMSCs/PDL1Ig組的肝功能改善最明顯，在術后7 d肝功能指標基本達到正常水平，與其它2組比較差異均有統計學顯著性(P＜0.05)，見表2。

表2 各實驗組肝移植受體術后7 d的肝功能檢測Table 2.The liver function of the recipients after 7 d of liver transplantation(Mean±SD.n=5)

8 大鼠肝移植術后病理學檢查結果的比較

肝移植術后第9天，肝組織病理學檢查結果顯示control組為重度典型的排斥反應，表現為肝細胞排列紊亂，部分肝細胞變性壞死，匯管區(qū)大量淋巴細胞和嗜酸細胞浸潤，膽管炎癥破壞，中央靜脈炎癥細胞浸潤，中重度靜脈炎，部分肝實質出現壞死區(qū)域。BMSCs組和BMSCs/GFP組的移植肝亦發(fā)生排斥反應，部分屬于輕度排斥反應，炎癥細胞浸潤少數匯管區(qū)的膽管和血管，數量較少，但與control組比較程度較輕。BMSCs/PDL1Ig組的炎癥反應最輕，幾乎無移植排斥反應，肝小葉結構排列整齊，類似正常肝組織，偶爾僅在匯管區(qū)間隙見到少量的淋巴細胞或中性粒細胞，見圖9。

Figure 9.The pathological changes in liver tissues of the rats in the 4 groups on the 9th day after transplantation(HE staining，×100).圖9 4組大鼠術后第9天的肝組織病理學變化

討論

骨髓間充質干細胞是來源于胚胎發(fā)育早期中胚層的一類多能干細胞，有多向分化潛能，其表面少量表達主要組織相容性復合體MHC-Ⅰ類分子，不表達Ⅱ類分子、B7、CD40L等第二信號分子，具有低免疫原性，不刺激T淋巴細胞的增殖和分化［6］。BMSCs可分泌肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、轉化生長因子TGF-β1、IL-10等可溶性分子，抑制T淋巴細胞的激活［7-8］，可誘導輔助性T(T helper，Th)細胞向Th1/Th2細胞分化偏離，使Th2細胞比例增多，IL-2和IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，調節(jié)免疫的功能［9-10］。BMSCs還可通過直接接觸和分泌負性調節(jié)細胞因子抑制APC的作用，多項體外、體內實驗顯示，BMSCs可向肝細胞分化，修復受損肝組織。BMSCs還可被外源基因轉染并表達外源基因，且其免疫調節(jié)作用、損傷修復作用、分化作用不受影響，這些功能對減輕移植器官的排斥反應有一定的作用［11-12］。

本研究中，體外混合淋巴細胞反應實驗發(fā)現，BMSCs能抑制淋巴細胞活力，轉染PDL1Ig后的BMSCs抑制淋巴細胞作用更強。采用BMSCs可使原位肝移植急性排斥反應模型大鼠的生存時間延長，機體內IL-2和IFN-γ水平較對照組下降，IL-4水平較對照組升高，術后肝臟病理學檢查結果顯示排斥反應程度減輕，轉染PDL1Ig后的BMSCs以上作用更強。因此，本研究證實了在體內、體外BMSCs均可抑制同種異體肝移植排斥反應的發(fā)生［13］，器官移植排斥反應有多種機制參與，對其中一種機制的干預往往不能起到明顯的抑制排斥反應的理想效果，要想達到免疫耐受，我們認為需要涉及多條路徑［14-15］。研究發(fā)現BMSCs有明確的抑制排斥反應的作用，但也有向腫瘤組織分化的可能，具有一定風險，其表面的Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)結合配體后可導致其抑制T淋巴細胞的作用消失;另外BMSCs表達MHCⅠ類分子，在與供、受體MHC不符時，亦可激活CD8+T淋巴細胞，造成移植器官損傷［16］。因此，單獨應用BMSCs往往不能達到理想的移植免疫耐受的效果。排斥反應主要是由T淋巴細胞介導完成的，根據Lafferty的“雙信號”理論，T淋巴細胞的充分激活需要第一信號和第二信號的共同作用才能完成。研究表明，若缺乏第二信號，T淋巴細胞的IL-2產量明顯減少，僅為雙信號作用時的1/30［17］。目前研究最明確的第二信號通路為CD28-B7通路，PDL1Ig可有效阻斷CD28-B7通路，對減輕器官移植術后排斥反應有明確的作用［5］。本研究認為共刺激通路阻斷聯合骨髓間充質干細胞誘導免疫耐受的可能機制在于BMSCs作為外源抗原，會被受體免疫系統攻擊消耗一部分，難以完全發(fā)揮免疫抑制作用，重組腺病毒 PDL1Ig轉染 BMSCs后，利用其表達的PDL1Ig阻斷第二信號通路而達到的免疫抑制作用可以保護BMSCs不受侵害，延長其體內生存期，最終創(chuàng)造出了1+1＞2的負性免疫應答調節(jié)效果，達到了大鼠肝移植免疫耐受，為指導臨床肝移植免疫耐受提供了新的思路。

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(責任編輯:陳妙玲，羅 森)

PDL1Ig gene-modified BMSCs induce immune tolerance in rat liver transplantation

LI Peng1，LI Heng-ping1，ZHOU Dong1，DING Zheng-hua1，HUANG Wei-dong1，WANG Jun1，ZHANG Yu-yi2

(1Department of General Surgery，2Obstetrics and Gynecology Department，The Affiliated Xiangyang Hospital，Hubei Medical College，Xiangyang 441000，China.E-mail:sharpfast@sina.com)

AIM:To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)modified by programed death ligand-1 immunoglobulin(PDL1Ig)gene on immune rejection of orthotopic liver transplantation in rats.METHODS:Rat BMSCs were cultured and identified.The protein expression of PDL1Ig in the BMSCs 72 h after infection with pAdEasy-1/PDL1Ig was detected by Western blot.Mixed lymphocyte reaction was used to detect the inhibitory effect of BMSCs on the viability of T-lymphocytes in peripheral blood.The male Wistar rats were used as donors(n=40)，and the male SD rats were used as recipients(n=40).The rat model of orthotopic liver transplantation was established by improved cuff method for observing acute rejection.The rats were randomly divided into control group，BMSCs treatment group，BMSCs/GFP treatment group and BMSCs/PDL1Ig treatment group with 10 pairs each.Five rats were executed at the 7th day and the remains were used for measuring the survival time.RESULTS:The expression of PDL1Ig in the BMSCs was detected after pAdEasy-1/PDL1Ig infection.The effect of BMSCs/PDL1Ig on the viability of the lymphocytes was stronger than that of BMSCs/GFP.The level of IL-4 in BMSCs/PDL1Ig group was significantly higher than that in the other 3 groups，while the levels of IFN-γ and IL-2 were significantly decreased.The liver function in BMSCs/PDL1Ig group was significantly improved and the levels of ALT，AST and TBil were almost recovered to normal at the 7th day after transplan-tation.Severe rejection reaction was observed in control group，and rejection reactions were decreased with different degrees in BMSCs treatment group and BMSCs/GFP treatment group.Much slighter rejection reaction and significantly longer survival time were showed in BMSCs/PDL1Ig group than those in the other 3 groups.CONCLUSION:PDL1Ig-modified BMSCs inhibit the rejection of liver transplantation in rats and induce the immune tolerance，and the effect is better than that of BMSCs alone.

Liver transplantation;Immune tolerance;Adenovirus;Bone marrow mesenchymal stem cells; Programed death ligand-1 immunoglobulin

R392.4;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.020

1000-4718(2016)07-1279-06

2015-12-24

2016-05-10

△Tel:0710-3420052;E-mail:sharpfast@sina.com