朱永俊， 夏云峰， 鐘良寶， 梁海琴， 王善智， 林欣然， 甘 華△

(1海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，海南?？?70102;2重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶400016)

自噬對腎大部切除大鼠腎小管上皮細胞程序性壞死的影響*

朱永俊1，2， 夏云峰2， 鐘良寶1， 梁海琴1， 王善智1， 林欣然1， 甘 華2△

(1海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，海南?？?70102;2重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶400016)

目的:探討自噬是否參與腎大部切除(SNx)大鼠腎小管上皮細胞的過度死亡，及其與程序性壞死的關系。方法:48只雄性SD大鼠隨機分為control組(6只)和SNx組(42只)，分別行假手術和SNx。將24只SNx大鼠分為0、4、8和12周組;其余SNx大鼠分為SNx+vehicle組、SNx+necrostatin-1(Nec-1)組和SNx+3-甲基腺嘌呤(3-MA)組，每組6只。檢測0、4、8和12周組大鼠腎組織RIP1、RIP3、LC3和beclin-1的mRNA和蛋白表達水平; 用Nec-1和3-MA干預SNx大鼠，Western blot法檢測LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和beclin-1的蛋白水平，透射電鏡和TUNEL染色判定Nec-1和3-MA對SNx大鼠腎小管上皮細胞死亡的影響，并觀察Nec-1和3-MA對SNx大鼠腎組織的病理變化、活性氧簇(ROS)、血尿素氮(BUN)和血肌酐(SCr)含量的影響。結(jié)果:SNx術后8周大鼠腎組織RIP1、RIP3、LC3和beclin-1的mRNA和蛋白水平達最高值(P＜0.01);Nec-1和3-MA干預SNx大鼠的LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1蛋白水平、發(fā)生程序性壞死的腎小管上皮細胞及TUNEL陽性細胞數(shù)量均顯著降低(P＜0.01)。另外，Nec-1減低SNx大鼠腎組織的ROS含量，但3-MA無此作用。結(jié)論:自噬參與了SNx大鼠腎小管上皮細胞過度死亡;抑制自噬可減輕SNx大鼠腎小管上皮細胞程序性壞死及其腎損傷。

腎大部切除;程序性壞死;自噬;Necrostatin-1;3-甲基腺嘌呤

自噬在細胞自我穩(wěn)定、分化成熟等方面發(fā)揮著重要作用，但有研究表明自噬在某些腎臟疾病的病理過程中加劇了腎損傷［1］，并且它能與細胞凋亡相互作用，促進了腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展［2］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)程序性壞死(necroptosis)是引起腎大部切除(subtotal nephrectomy，SNx)大鼠腎小管上皮細胞死亡、導致慢性腎損傷進展的一個重要機制，程序性壞死特異性抑制劑necrostatin-1(Nec-1)能明顯減輕大鼠腎損害［3］。但自噬在慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)進展中的作用及其與程序性壞死的相互關系尚不清楚。本文旨在探討CKD進展過程中，自噬是否參與了腎小管上皮細胞的過度死亡，及其與程序性壞死的關系。

材料和方法

1 主要試劑

總RNA提取試劑盒RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Erase和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa);小鼠RIP1單克隆抗體(R＆D Systems);兔RIP3多克隆抗體(Abcam);兔LC3多克隆抗體(Novus Biologicals);兔LC3和beclin-1單克隆抗體(Cell Signaling Technology);兔β-actin單克隆抗體(Santa Cruz);熒光原位細胞死亡檢測試劑盒(Roche);熒光探針DCFH-DA(南京建成生物工程研究所)。

2.1 實驗動物分組及模型的建立 48只健康雄性Sprague-Dawley大鼠(體重200～230 g)購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。所有動物的飼養(yǎng)和使用都嚴格遵循重慶醫(yī)科大學動物管理委員會的要求。大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為control(6只)組和SNx (42只)組。參照文獻［3］給SNx組大鼠行SNx，在戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉下，首先行背外側(cè)切口，摘除右腎。7 d后，切除左腎上、下極皮質(zhì)(約占右腎質(zhì)量的60%～70%)，保留左腎1/3。control組大鼠接受假手術(僅剝?nèi)ツI臟包膜)。取24只SNx大鼠按時間點分為0、4、8和12周組。其余SNx大鼠分為SNx+vehicle組、SNx+Nec-1組和SNx+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)組，每組6只。從SNx術后4周開始，對SNx+vehicle、SNx+Nec-1和SNx+3-MA組的大鼠分別給予vehicle(10%DMSO-PBS液)、Nec-1(1.65 mg·kg－1·d－1［3］)和3-MA(15 mg·kg－1·d－1［4］)，腹腔注射，每日1次，連續(xù)給藥4周。control組大鼠僅給予10%DMSO-PBS液。

2.2 采樣與血生化檢測 戊巴比妥麻醉下，經(jīng)左心室采集血樣檢測尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(serum creatinine，SCr)后，灌注PBS液移除腎臟血液，取數(shù)個1 mm3大小的腎組織塊固定于2.5%的戊二醛磷酸鹽緩沖液中。取部分腎組織固定于4%的多聚甲醛溶液，其余腎組織快速凍存于液氮中，然后轉(zhuǎn)移至 －80℃保存，用于實時熒光定量 PCR (qPCR)和Western blot法分析。

2.3 腎組織病理學檢查 將固定于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液的腎組織塊脫水，包埋于環(huán)氧樹脂中，制成超薄切片。醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后在透射電鏡下觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)。4%多聚甲醛固定腎組織24 h后，石蠟包埋，制成4 μm厚的石蠟切片，HE染色。采用雙盲的方式在400倍光學顯微鏡下對腎小球和小管間質(zhì)損害進行半定量分析［5］，并計算腎小球硬化指數(shù)(glomerulosclerosis index，GSI)和小管間質(zhì)損傷分數(shù)(tubulointerstitial injury score，TIS)。免疫組化染色觀察RIP3和LC3在腎小管的表達部位，光鏡下細胞胞漿內(nèi)有棕色或棕黃色染色為陽性著色;采用全自動數(shù)碼成像及分析系統(tǒng)檢測RIP3和LC3蛋白的表達情況，至少評估10個不連續(xù)的皮髓交界區(qū)視野，并計算腎組織RIP3和LC3陽性細胞百分數(shù)。

2.4 TUNEL染色 將4 μm厚的石蠟切片脫蠟至水，滴加TUNEL reaction mixture進行TUNEL染色，DAPI復染細胞核，50%甘油封片。在熒光顯微鏡下采集圖像，并隨機取5個高倍視野，計數(shù)200個細胞中TUNEL陽性細胞數(shù)，計算TUNEL陽性細胞百分比。

2.5 qPCR檢測腎組織中RIP1、RIP3、LC3和beclin-1的mRNA表達 應用TRIzol RNA提取液提取腎組織中總的RNA;采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Erase試劑盒將 RNA逆轉(zhuǎn)錄;采用 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行實時熒光定量PCR擴增，引物見表1。cDNA擴增時，每個樣本設置3個重復孔。根據(jù)標準曲線計算擴增效率，采用相對定量2－ΔΔCt法，計算每個目的基因cDNA的相對拷貝數(shù)，求平均值作最終結(jié)果。內(nèi)參照為GAPDH。

表1 RIP1、RIP3、LC3、beclin-1和GAPDH的引物序列Table 1.The primer sequences for RIP1，RIP3，LC3 and GAPDH

2.6 Western blot法檢測LC3和beclin-1蛋白的表達 將腎組織標本研碎，勻漿后，用RIPA裂解液/ PMSF混合液提取組織蛋白，測定蛋白濃度，各孔上樣量為40 μg，用溴酚藍調(diào)整各孔上樣體積為8 μL;凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，5%BSA-TBST室溫封閉;加I抗:LC3(1∶1 000)、beclin-1(1∶1 000、β-actin (1∶2 000)，4℃過夜;TBST洗膜，加II抗37℃孵育1 h;TBST洗膜，ECL發(fā)光顯色［6］。以β-actin作為內(nèi)參照，采用VILBER FUSION FX7分析軟件進行定量分析。

2.7 ROS水平的測定 將腎組織制成勻漿，取上清，加入熒光探針DCFH-DA，37℃孵育30 min，用熒光酶標儀測定熒光強度。同時，取部分勻漿上清測定蛋白濃度。計算熒光強度/蛋白濃度。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 不同時期SNx大鼠腎組織RIP1、RIP3、LC3和beclin-1的表達變化

qPCR檢測發(fā)現(xiàn) SNx術后 8周腎組織 RIP1、RIP3、LC3和beclin-1的mRNA相對表達量均明顯高于0周、4周和12周，差異有統(tǒng)計學顯著性(P＜0.01)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)RIP3和LC3的蛋白主要表達于SNx大鼠近端腎小管上皮細胞胞漿，并且腎小管RIP3和LC3陽性細胞百分比在SNx術后8周遠高于0周、4周和12周(P＜0.01)，見圖1。

2 Nec-1和3-MA對 SNx大鼠腎組織 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、beclin-1蛋白表達及ROS生成的影響

Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1蛋白在SNx+vehicle組大鼠腎組織中表達較control組分別高 2.1倍(P＜0.01)和 4.5倍(P＜0.01)。與SNx+vechile組比較，3-MA干預SNx大鼠后，增高的LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1蛋白水平明顯下降(P＜0.01);而Nec-1干預也能顯著降低LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1的蛋白水平(P＜0.01)。另外，化學熒光法檢測腎組織ROS的含量，發(fā)現(xiàn)與control組相比，SNx+vehicle組大鼠的ROS含量明顯增高(P＜0.05);Nec-1干預后增高的 ROS得以抑制(P＜0.05)，但3-MA干預并未降低ROS的含量，見圖2。

3 Nec-1和3-MA對SNx大鼠腎小管上皮細胞死亡的影響

在SNx+vehicle組大鼠腎組織中，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)部分小管上皮細胞和細胞器腫脹，核膜和漿膜崩解，細胞內(nèi)容物外溢，線粒體增多，并可伴有細胞內(nèi)囊泡的廣泛形成;在control組和Nec-1、3-MA干預的SNx大鼠腎組織中均未發(fā)現(xiàn)發(fā)生典型程序性壞死的腎小管上皮細胞。

TUNEL染色分析發(fā)現(xiàn)SNx+vehicle組大鼠的TUNEL陽性腎小管上皮細胞百分比是control組的4.8倍(P＜0.01)。Nec-1干預SNx大鼠后，TUNEL陽性腎小管上皮細胞百分比明顯降低(P＜0.01)。重要的是，3-MA干預也明顯降低了SNx大鼠腎組織TUNEL陽性細胞(P＜0.01)，且與SNx+Nec-1組比較差異無統(tǒng)計學顯著性(P＜0.05)，見圖3。

4 Nec-1和3-MA對SNx大鼠腎損傷的影響

HE染色結(jié)果顯示，SNx+vehicle組大鼠部分腎小球的結(jié)構(gòu)被破壞，系膜基質(zhì)呈中、重度彌漫增生，毛細血管節(jié)段閉塞及硬化;還可見包曼氏囊增厚、球囊粘連;相應區(qū)域的腎小管萎縮，伴中、重度間質(zhì)纖維化及慢性炎細胞浸潤;相鄰區(qū)域腎小球代償性肥大、腎小管灶性擴張、小管內(nèi)可見大量蛋白管型。Nec-1或3-MA干預的SNx大鼠腎臟病理損害有所減輕，GSI和TIS較SNx+vehicle組明顯降低(P＜0.01)。control組大鼠的腎小球、小管形態(tài)基本正常，見圖4。

Figure 1.The expression of RIP1，RIP3，LC3 and beclin-1 in the renal tissues of SNx rats at various time points.The mRNA expression of RIP1(A)，RIP3(B)，LC3(C)and beclin-1(D)in the kidneys of SNx rats at various time points was detected by qPCR.The quantitative analysis of RIP3-positive cells(E)and LC3-positive cells(F)in the SNx rats at various time points was shown.The protein expression of RIP3(G)and LC3(H)in the kidneys of SNx rats at various time points was observed by immunohistochemistry.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs 8W group.圖1 不同時期SNx大鼠腎組織RIP1、RIP3、LC3和beclin-1表達的變化

腎功能結(jié)果表明，SNx+vehicle組大鼠SCr和BUN水平遠遠高于control組(P＜0.01)，Nec-1和3-MA干預明顯降低SNx大鼠BUN和SCr水平(P＜0.05)，見圖4。

討論

腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)是所有CKD走向終末期腎衰的主要病理變化，與CKD的預后關系密切，但是其分子機制尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞進行性死亡及繼發(fā)的細胞外基質(zhì)聚積是TIF進展的重要機制［7-8］。因此，探討TIF進展中腎小管上皮細胞過度死亡的主要方式并加以調(diào)控可能是防治CKD進展的新靶點。

Figure 2.The effect of Nec-1 and 3-MA on the changes of LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ，beclin-1 and ROS levels in the renal tissues of SNx rats.The protein expression of LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ(A)and beclin-1(B)in the kidneys of SNx rats treated with Nec-1，3-MA or vehicle was determined by Western blotting.The productions of ROS(C)in the kidneys of SNx rats treated with Nec-1，3-MA or vehicle were measured by DCFH-DA analysis.Mean±SD.n=6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs SNx+vehicle group圖2 Nec-1和3-MA對SNx大鼠腎組織LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、beclin-1蛋白表達和ROS生成的影響

Figure 3.The effect of Nec-1 and 3-MA on the renal tubular epithelial cell death in the SNx rats.A:necroptotic cells with typical necrotic morphological features were observed in SNx+vehicle group by TEM;B:TUNEL(green)and DAPI(blue)staining in the renal tubular epithelial cells of SNx rats treated with Nec-1，3-MA or vehicle;C:the quantitative analysis of TUNEL-positive cells in the SNx rats treated with Nec-1，3-MA or vehicle.Mean±SD.n=6.##P＜0.01 vs control group;＊＊P＜0.01 vs SNx+vehicle group.圖3 Nec-1和3-MA對SNx大鼠腎小管上皮細胞死亡的影響

Figure 4.The effect of Nec-1 and 3-MA on the renal morphology and function of SNx rats.A:the representative photomicrographs of HE-stained sections from SNx rats treated with Nec-1，3-MA or vehicle;B:the quantitative analysis of glomerulosclerosis index and tubulointerstitial injury score in SNx rats treated with Nec-1，3-MA or vehicle;C:Nec-1 and 3-MA significantly attenuated renal dysfunction of SNx rats.Mean±SD.n=6.##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs SNx+ vehicle group.圖4 Nec-1和3-MA對SNx大鼠腎損傷的影響

凋亡、自噬和程序性壞死是程序性細胞死亡的3種主要形式。我們前期研究發(fā)現(xiàn)凋亡和程序性壞死可能是導致SNx大鼠慢性腎損傷進展中腎小管上皮細胞死亡的重要途徑，它們特異的抑制劑可有效減少腎小管上皮細胞的過度死亡，防止腎損傷進展［3］。但自噬在SNx大鼠腎小管細胞過度死亡中的作用尚不明確。自噬能通過降解細胞內(nèi)多余蛋白質(zhì)和受損細胞器來維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，但是自噬活性過強，超過了生理界限，就會發(fā)生自噬性細胞死亡。在本研究中，我們選用SNx大鼠為實驗模型，發(fā)現(xiàn)自噬的標志性分子LC3和beclin-1的mRNA和蛋白水平在SNx術后8周達到高峰，并且LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1蛋白主要表達于腎小管上皮細胞。另外，Western blot實驗結(jié)果顯示3-MA干預SNx大鼠可抑制腎組織LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1蛋白的高表達，這些數(shù)據(jù)表明自噬是SNx大鼠腎小管上皮細胞死亡的一種方式。目前，自噬性細胞死亡在腎臟病中的作用存在爭議，Liu等［9］發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞的自噬活性對缺血/再灌注腎損傷具有保護作用，但是He等［10］認為自噬加重了急性腎損傷。這說明自噬在不同腎臟病理條件下扮演的角色不同。本實驗發(fā)現(xiàn)3-MA干預SNx大鼠后，發(fā)生死亡的腎小管上皮細胞數(shù)量減少，大鼠腎功能及腎組織病理變化也有所改善。這一發(fā)現(xiàn)證實在SNx大鼠慢性腎損害過程中自噬活性增強，加劇了腎小管細胞損傷。

我們還發(fā)現(xiàn)LC3和beclin-1的mRNA水平在不同時期SNx大鼠腎組織中的變化趨勢與程序性壞死標志性分子RIP1、RIP3的mRNA的變化趨勢相一致，這提示SNx大鼠腎小管上皮細胞發(fā)生的自噬可能與程序性壞死存在某些聯(lián)系。關于自噬與程序性壞死的關系，文獻報道并不一致，研究報道自噬可以促進［11］或阻斷程序性壞死的發(fā)生［12］，也有研究認為二者不相關［13］。我們發(fā)現(xiàn)Nec-1干預SNx大鼠，不僅腎組織中高表達的RIP1和RIP3蛋白水平降低，而且LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1蛋白也被抑制，這些結(jié)果表明SNx大鼠腎小管上皮細胞發(fā)生的自噬可能是作為程序性壞死信號通路的一個下游分子事件被細胞死亡信號所激活的，這與Klionsky等［14］的發(fā)現(xiàn)一致。

前期已證實ROS作為RIP1和RIP3的下游分子可能是 SNx大鼠腎細胞發(fā)生程序性壞死的執(zhí)行者［3］。有研究報道細胞內(nèi)過多的ROS與自噬的發(fā)生密切相關［15］。本實驗SNx+vehicle組大鼠腎組織ROS含量增高，但3-MA干預并未降低ROS含量。由此推測ROS不是SNx大鼠腎小管上皮細胞自噬的執(zhí)行者，反而可能是促發(fā)著。但這一假設尚需深入驗證。

綜上所述，在SNx大鼠模型中自噬可能是作為程序性壞死信號通路的一個下游分子事件促進腎小管上皮細胞的死亡。但具體機制尚需進一步深入探討。

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(責任編輯:林白霜，羅 森)

Effect of autophagy on necroptosis of renal tubular epithelial cells in subtotal nephrectomy rats

ZHU Yong-jun1，2，XIA Yun-feng2，ZHONG Liang-bao1，LIANG Hai-qin1，WANG Shanzhi1，LIN Xin-ran1，GAN Hua2

(1Department of Nephrology，The Affiliated Hospital of Hainan Medical College，Haikou 570102，China;2Department of Nephrology，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China.E-mail:cqchw2013 @sina.com)

AIM:To explore whether autophagy is involved in the excessive death of renal tubular epithelial cells in subtotal nephrectomy(SNx)rats and the relationship between autophagy and necroptosis in the kidney of SNx rats.METHODS:Male Sprague-Dawley rats were randomly assigned to control group(n=6)and SNx group(n=42).The rats in SNx group were subjected to SNx.Sham surgery was performed in the rats in control group.The rats in SNx group were divided into subgroups at 0，4，8 and 12 weeks(n=6)and the other rats in SNx group were divided into SNx+vehicle group，SNx+necrostatin-1(Nec-1)group and SNx+3-methyladenine(3-MA)group.The expression of RIP1，RIP3，LC3 and beclin-1 at mRNA and protein levels was measured at 0，4，8 and 12 weeks by qPCR and immunohistochemistry.The effects of Nec-1 or 3-MA on the protein expression of LC3-I，LC3-II and beclin-1，and production of reactive oxygen species(ROS)in the rat kidney were determined by Western blot and DCFH-DA staining.The death of renal tubular epithelial cells in the SNx rats was observed by TUNEL staining and electron microscopy.Finally，the effects of Nec-1 and 3-MA on blood urea nitrogen(BUN)，serum creatinine(SCr)and the pathological changes of the renal tissues were analyzed.RESULTS:The highest mRNA and protein levels of RIP1，RIP3，LC3 and beclin-1 appeared at the 8th week after SNx(P＜0.01).Compared with the rats in SNx+vehicle group，the protein over-expression of LC3-II/I and beclin-1，renal tubular epithelial cells with typical morphological features of necroptotic cell death and TUNEL-positive renal tubularcells were decreased in the SNx rats treated with Nec-1 and 3-MA(P＜0.01)，but 3-MA did not reduce the increased concentration of ROS.In addition，treatment with Nec-1 and 3-MA obviously reduced BUN，SCr(P＜0.05)，glomerulosclerosis index and tubulointerstitial injury score(P＜0.01).CONCLUSION:Autophagy participates in the excessive death of renal tubular epithelial cells in SNx rats.Inhibition of autograph prevents necroptotic cell death of renal tubular cells，and alleviates chronic renal injury in SNx rats.

Subtotal nephrectomy;Necroptosis;Autophagy;Necrostatin-1;3-Methyladenine

R692.5;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.018

1000-4718(2016)07-1266-07

2016-04-14

2016-05-31

國家科技支撐計劃(No.2011BAI10B01);海南自然科學基金資助項目(No.20168301)

△Tel:023-89012687;E-mail:cqchw2013@sina.com