高晨盈， 王俊逸， 羅云梅， 羅 超， 高 楊△

(遵義醫(yī)學院1基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，2藥學院，貴州遵義563000)

人參皂苷Re對球囊損傷所致大鼠血管內膜增生及NF-κB p65信號通路的影響*

高晨盈1， 王俊逸1， 羅云梅1， 羅 超2， 高 楊1△

(遵義醫(yī)學院1基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，2藥學院，貴州遵義563000)

目的:研究人參皂苷Re對大鼠頸動脈球囊損傷所致血管內膜增生的作用及其對NF-κB p65炎癥信號通路的影響。方法:40只SD大鼠隨機分組為5組:假手術組，模型組，人參皂苷Re低、中、高劑量組。除假手術組外，其余組大鼠均用2F球囊導管建立頸動脈球囊損傷模型，制模后次日灌胃給藥，假手術組和模型組給予等體積蒸餾水，人參皂苷低、中、高劑量組大鼠分別給予12.5、25、50 mg/kg人參皂苷Re。連續(xù)給藥14 d后取損傷段頸動脈，HE染色觀察血管形態(tài)學改變，并測定血管管腔面積(lumen area，LA)、內膜面積(intima area，IA)、中膜面積(media area，MA)，計算內膜/中膜面積比(IA/MA);real-time PCR法檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的mRNA水平;免疫組織化學法檢測血管壁增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)p65蛋白的表達。結果:與假手術組相比，模型組大鼠血管腔明顯變窄(P＜0.01)，血管壁TNF-α、IL-1β的mRNA水平及PCNA、NF-κB p65蛋白的表達均明顯增高(P＜0.05);與模型組比較，人參皂苷Re中、高劑量組血管內膜增生明顯減輕(P＜0.05)，血管壁TNF-α和IL-1β的mRNA水平及PCNA和NF-κB p65的蛋白表達則明顯下調(P＜0.05)。結論:人參皂苷Re能減輕球囊損傷所致大鼠頸動脈內膜增生，其機制可能與抑制NF-κB p65炎癥信號通路有關。

人參皂苷Re;內膜增生;核因子κB p65;增殖細胞核抗原

冠狀動脈性心臟病簡稱冠心病，其主要病因為動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。AS是脂蛋白、單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞與血管壁內皮細胞相互作用而導致慢性炎癥反應，也是多種心血管疾病的重要基礎病變［1］。AS導致病變動脈管腔逐漸狹窄而出現(xiàn)心肌缺血甚至心肌梗死，嚴重威脅人類生命健康。目前經(jīng)皮冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)技術廣泛應用于臨床治療冠心病，但術后均會發(fā)生不同程度的再狹窄(restenosis，RS)，嚴重影響其遠期療效［2］。現(xiàn)已明確，血管內膜增生是AS及PCI術后RS的主要病變基礎［3］。有研究表明，免疫炎癥反應是PCI術后導致血管內膜增生的主要途徑之一［4］，內膜增生引起大量促炎癥因子的表達，如 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和STAT3［5］。受IL-1激活的NF-κB是啟動炎癥相關增生的關鍵分子，上調TNF-α等細胞炎癥或趨化因子導致增生［6］。而NF-κB是一種廣泛存在于細胞中具有多向性調節(jié)作用的轉錄因子，它能與多種細胞因子、黏附分子基因啟動子部位的位點發(fā)生結合，增強這些基因的轉錄和表達，導致 TNF-α、IL-1、IL-8、ICAM-1和P-selectin等基因過度表達，是炎癥反應的核心;抑制NF-κB的活性可減少IL-6、TNF-α的產生，在整體水平上減少促炎基因的表達，把處于高平衡狀態(tài)的炎性因子水平下降到低水平狀態(tài)或正常的平衡狀態(tài)［7-8］。本課題組前期研究已證實人參皂苷Re(ginsenoside Re，Re)對大鼠頸動脈球囊損傷所致的血管內膜增生具有抑制作用，然而其作用是否通過抑制NF-κB p65通路，目前尚無報道。本研究采用大鼠頸動脈球囊損傷模型，探討NF-κB p65通路在人參皂苷Re抑制血管內膜增生過程中的作用。

材料和方法

1 藥品、試劑與儀器

人參皂苷Re，純度95%(北京奧明興業(yè)科技有限責任公司);RNA逆轉錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司);NF-κB p65 I抗(北京博奧森生物技術有限公司);增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(Abcam);SP法試劑盒(北京中杉金橋公司)。Fogarty導管(Edwards lifescience); Leica光學顯微鏡及照相系統(tǒng)(Leica);Real-time PCR擴增儀和通用酶標儀(Bio-Rad)。TNF-α、IL-1β的mRNA引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。

2 實驗動物分組及取材

40 只清潔級雄性SD大鼠由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供［許可證號為SCXK(渝) 2012-0005］。動物隨機分為5組，即假手術組、球囊損傷模型組、Re低劑量組、中劑量組和高劑量組，體重(300±10)g。假手術組大鼠只進行頸總動脈的分離，不行球囊損傷術，其它組大鼠行球囊損傷術，其余操作相同。次日Re低、中、高劑量組大鼠分別按Re 12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg灌胃給藥，假手術組和球囊損傷模型組灌同體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)14 d。末次灌胃24 h后腹腔注射7%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠，然后迅速取出左頸總動脈，用生理鹽水洗凈后平均分成3段，中間部分用4%甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋，其余血管－80℃冰凍保存。

3 方法

3.1 大鼠頸總動脈球囊損傷模型的建立 參照文獻建立大鼠頸總動脈球囊損傷模型［9］。術前禁食12 h，腹腔注射7%水合氯醛麻醉動物。行頸部正中切口，氣管左側分離出左頸總動脈，左胸鎖乳突肌乳突端找到左頸外、頸內動脈分叉處，靠近分叉處分離頸外動脈，平結結扎頸外動脈遠心端。夾閉頸總動脈近心端和頸內動脈，用顯微外科剪在頸外動脈遠心端1/3處45度剪開一小口，松開頸總動脈近心端動脈夾，自此逆行將Fogarty導管從切口插入頸總動脈約3～4 cm，生理鹽水0.05～0.10 mL充盈球囊后緩慢往回抽拉，臨近剪口處抽出生理鹽水再將其插入，來回3次剝脫內膜，將Fogarty導管取出，用細線結扎頸外動脈近心端，松開動脈夾，恢復血流，縫合切口。并皮下注射4×104U注射用青霉素鈉預防感染。

3.2 HE染色結果測定 將石蠟包埋的標本進行HE染色，在Leica光學顯微鏡下進行形態(tài)學觀察并拍照。利用cellSens Standard專業(yè)分析軟件測量管腔面積(lumen area，LA)、內彈力板圍繞面積(internal elastic lamina area，IELA)、外彈力板圍繞面積(external elastic lamina area，EELA)，計算內膜面積(intima area，IA)和中膜面積(media area，MA)，其中IA=IELA－LA，MA=EELA－ELA，每個樣本切片3張，分別測量后取平均值，并計算IA/MA。

3.3 免疫組織化學法檢測PCNA和NF-κB p65蛋白的表達 將石蠟切片脫蠟至水，0.3%Triton X-100破膜20 min，用0.01%檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)進行熱抗原修復6 min 2次，PBS沖洗(5 min 3 次)，3%H2O2避光室溫孵育15 min，滅活內源性過氧化物酶，PBS沖洗(5 min 3次)，參照SP法免疫組化檢測試劑盒說明書操作，滴加試劑A常溫孵育15 min后棄去，滴加I抗(PCNA、NF-κB p65)，陰性對照以PBS緩沖液代替，PBS沖洗(5 min 3次)，滴加試劑B 37℃孵育15 min，PBS沖洗(5 min 3次)，滴加試劑C 37℃孵育15 min，PBS沖洗(5 min 3次)，DAB顯色、蘇木精復染、分化、脫水、封片，每張切片選擇5個高倍視野(×400)，分別計數(shù)血管內膜和中膜的正常細胞和PCNA、NF-κB p65陽性細胞(細胞核內含棕黃和/或褐色顆粒的細胞)，計算一只大鼠PCNA、NF-κB p65的陽性細胞率(PCNA、NF-κB p65陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%)，每組為5只大鼠，最終取其平均值。

3.4 Real-time PCR檢測TNF-α、IL-1β的mRNA表達 TRIzol法提取頸總動脈RNA，按照逆轉錄試劑盒的說明書進行逆轉錄反應。將iQ SYBR Green Supermix 7.5 μL、DEPC水4 μL、正向和反向引物共0.5 μL混勻后，取8 μL與2 μL逆轉錄產物cDNA構成10 μL反應體系;real-time PCR反應條件為95 ℃ 3 min;95℃10 s，60℃45 s，循環(huán)40次。以β-actin為內參照，按2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。相關基因的引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

4 統(tǒng)計學處理

計數(shù)資料以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，全部數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，方差齊用SNK法，不齊則用Dunnett’s T3檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 人參皂苷Re對大鼠頸動脈球囊損傷后內膜形態(tài)學的影響

HE染色結果可見假手術組內膜光滑，無增厚現(xiàn)象;與假手術組比較，模型組血管內膜明顯增厚，管腔狹窄，IA及IA/MA分別增加22.24倍和14.95倍(P＜0.01);與模型組比較，人參皂苷Re中、高劑量組均可明顯減輕血管內膜增厚的程度，使管腔面積明顯增大，IA及IA/MA均有所下降(P＜0.05)。人參皂苷Re高劑量組IA及IA/MA分別下降61.19% 和46.54%(P＜0.05)，見圖1～3。

Figure 1.The effects of ginsenoside Re on lumen area，intima area and media area of carotid artery.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs sham group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group.圖1 人參皂苷Re對大鼠頸總動脈管腔面積、內膜面積和中膜面積的影響

Figure 2.The effects of ginsenoside Re on IA/MA of carotid artery.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs sham group;△P＜0.05 vs model group.圖2 人參皂苷Re對大鼠頸總動脈內膜面積與中膜面積比值的影響

2 人參皂苷Re對大鼠頸動脈球囊損傷后PCNA表達的影響

免疫組化結果顯示PCNA主要表達于細胞核，有棕黃和(或)褐色顆粒的細胞為PCNA陽性表達細胞，假手術組中血管內膜PCNA陽性細胞少，球囊損傷模型組血管內膜及中膜則有大量PCNA陽性表達細胞，而且主要集中在新生內膜，人參皂苷Re中、高劑量組可見陽性細胞表達明顯減少，見圖4。

Figure 3.The effects of ginsenoside Re on the carotid artery by morphological observation(HE staining，×100).圖3 人參皂苷Re對球囊損傷大鼠頸動脈形態(tài)學的影響

Figure 4.The effects of ginsenoside Re on the expression of PCNA in the carotid artery(×400).Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs sham group;△△P＜0.01 vs model group.圖4 人參皂苷Re對大鼠頸動脈球囊損傷后PCNA表達的影響

3 頸總動脈IL-1β和TNF-α的mRNA表達

與假手術組比較，球囊損傷模型組IL-1β和TNF-α 的mRNA表達分別升高3.02倍和5.91倍(P＜0.01)。與模型組比較，人參皂苷Re中、高劑量組IL-1β和TNF-α的mRNA表達均有下調(P＜0.01)，見圖5。

Figure 5.The effects of ginsenoside Re on the mRNA expression of IL-1β and TNF-α in the carotid artery.Mean± SEM.n=8.＊＊P＜0.01 vs sham group;△△P＜0.01 vs model group.圖5 人參皂苷Re對大鼠球囊損傷后血管IL-1β、TNF-α mRNA的影響

4 人參皂苷Re對大鼠頸動脈球囊損傷后NF-κB p65表達的影響

與假手術組相比，球囊損傷模型組NF-κB p65表達的量較多;與球囊損傷模型組相比，Re中高劑量組NF-κB p65表達的量明顯減少(P＜0.05)，見圖6。

討論

Figure 6.The effects of ginsenoside Re on the protein expression of NF-κB p65 in the carotid artery(×400).Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs sham group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group.圖6 人參皂苷Re對大鼠頸總動脈球囊損傷后NF-κB p65蛋白表達的影響

PCI是目前臨床主要的治療AS的手段之一，但術后仍會發(fā)生不同程度的再狹窄，炎癥反應是再狹窄的主要因素之一。球囊損傷后導致的血管腔狹窄是由于損傷早期新生內膜增生和后期血管的縮窄性重構所致，PCNA是一種與細胞增殖有關的參與DNA合成的核蛋白，是僅能在增殖細胞中合成與表達的細胞多肽鏈［10］。因此，PCNA的合成及表達與細胞的增殖狀態(tài)、分化活躍程度有關，能較可靠地反映細胞群體增殖活性，是一個敏感的反映細胞增殖的指標，被廣泛用于細胞增殖功能的檢測［11］。本研究表明，大鼠頸動脈球囊損傷后14 d血管內膜明顯增生，PCNA表達量也明顯增多，與模型組相比，人參皂苷Re高、中劑量組內膜增生程度及PCNA的表達均顯著減少，表明人參皂苷Re對血管內膜細胞的增殖活性有抑制作用。

NF-κB是一種多向性、具有獨特生物學特性的轉錄因子［12］。大量研究證實，球囊擴張導致血管壁損傷，內皮細胞釋放TNF-α、IL-1β等多種細胞因子，激活NF-κB，NF-κB進而移位至胞核，與 DNA鏈上的啟動子區(qū)域相應靶基因位點結合，啟動一系列免疫和炎癥反應相關基因的轉錄程序，并相繼激活下游相關的炎癥因子，如 IL-l、IL-6、IL-8、TNF-α等的表達［13］。本研究免疫組織化學染色中顯示，模型組NF-κB p65陽性細胞百分率明顯多于各實驗組，表明NF-κB p65活化后表達明顯增加。有研究表明，NF-κB下游炎癥因子TNF-α、IL-1β等基因的轉錄可正反饋誘導NF-κB進一步活化，從而形成瀑布效應，在其作用下，位于血管中膜的VSMCs由收縮表型轉變?yōu)楹铣杀硇?，穿過內彈力板遷移入內皮下，形成新生內膜［14-15］。本研究結果顯示，模型組大鼠NF-κB p65下游炎癥因子TNF-α、IL-1β mRNA的表達也明顯增多，與NF-κB p65呈現(xiàn)一致性。而以上指標在Re高、中劑量組的表達明顯減少，這表明人參皂苷Re參與抑制了炎癥反應，其機制可能與抑制NF-κB p65通路的活化有關，但其具體機制及關鍵靶標還有待進一步研究。

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(責任編輯:陳妙玲，余小慧)

Influence of ginsenoside Re on vascular intima hyperplasia and NF-κB p65 signaling pathway in balloon-injured rats

GAO Chen-ying1，WANG Jun-yi1，LUO Yun-mei1，LUO Chao2，GAO Yang1

(1Key Laboratory of Basic Pharmacology，Ministry of Education，2School of Pharmacy，Zunyi Medical College，Zunyi 563000，China.E-mail:46523533@qq.com)

AIM:To investigate the inhibitory effect of ginsenoside Re on intimal hyperplasia induced by balloon-injury and to explore the role of NF-κB p65 signaling pathway in the process.METHODS:SD rats(n=40)were divided into 5 groups randomly:sham operation group，model group，low-dose ginsenoside Re group，middle-dose ginsenoside Re group and high-dose ginsenoside Re group.The carotid artery intima injury model was established by 2F balloon catheters in all groups except the sham operation group.The day after modeling，the animals in model group and sham operation group were administered intragastrically with distilled water，and the rats in low-dose，middle-dose and high-dose ginsenoside Re groups were given ginsenoside Re at doses of 12.5 mg/kg，25mg/kg and 50 mg/kg，respectively.After 14 continuous days，the morphological changes of the injured arteries were observed by HE staining and the lumen area，intima area and media area as well as the ratio of intimal area/media area were determined.The expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-1β(IL-1β)were detected by real-time PCR.The proliferating cell nuclear antigen(PCNA)and nuclear factor-kappa B(NF-κB)p65 were examined by immunohistochemistry.RESULTS:Compared with sham operation group，the vessel cavity was narrowed(P＜0.01)，the mRNA levels of TNF-α and IL-1β，and the protein expression of PCNA and NF-κB p65 were increased in model group(P＜0.05).Compared with model group，the vascular intimal hyperplasia was alleviated obviously(P＜0.05)，and the mRNA levels of TNF-α and IL-1β，and protein expres-sion of PCNA and NF-κB p65 were decreased in medium and high-dose ginsenoside Re groups(P＜0.05).CONCLUSION:Ginsenoside Re inhibits the vascular neointimal hyperplasia induced by balloon-injury in rats，and the molecular mechanism may be related to the inhibition of NF-κB p65 signaling pathway.

Ginsenoside Re;Intimal hyperplasia;Nuclear factor-κB p65;Proliferating cell nuclear antigen

R285.5;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.015

1000-4718(2016)07-1246-06

2016-02-03

2016-04-18

國家自然科學基金資助項目(No.81360494);貴州省科學技術基金資助項目 (黔科合J字LKZ ［2010］31號);貴州省教育廳自然科學研究項目(黔教合KY［2012］080號)

△Tel:0851-28609493;E-mail:46523533@qq.com