劉 岸， 黃成鋼， 徐 佳

(岳陽市第一人民醫(yī)院胃腸外科，湖南岳陽414000)

慢病毒介導的GHSR1a shRNA對結直腸癌細胞生長的影響*

劉 岸△， 黃成鋼， 徐 佳

(岳陽市第一人民醫(yī)院胃腸外科，湖南岳陽414000)

目的:構建生長激素促泌素受體1a(growth hormone secretagogue receptor 1a，GHSR1a)基因短發(fā)夾干擾RNA(short hairpin RNA，shRNA)慢病毒載體，感染人結直腸癌細胞系SW480，觀察沉默GHSR1a基因對SW480細胞生長的影響，并探討其作用機制。方法:構建特異性靶向GHSR1a基因的shRNA慢病毒表達載體和陰性對照序列慢病毒載體;建立穩(wěn)定表達GHSR1a shRNA的SW480細胞、陰性對照細胞(NC)及空白對照細胞(BC)，RTPCR檢測GHSR1a的mRNA在細胞中的表達;通過Western blot技術檢測細胞中GHSR1a、ghrelin、PTEN、p-AKT及p53蛋白的水平;CCK-8法測定GHSR1a shRNA對SW480細胞活力的影響;建立裸鼠結直腸癌皮下移植瘤模型，實驗結束后處死裸鼠并測量各組裸鼠腫瘤重量;免疫組織化學法檢測腫瘤組織中Ki-67和PTEN的陽性表達。結果:在體外實驗中，GHSR1a在人結直腸癌細胞株Caco-2及SW480中的表達明顯高于人正常結腸上皮細胞株NCM460的表達;成功建立了穩(wěn)定表達GHSR1a shRNA的SW480細胞;GHSR1a shRNA能明顯抑制SW480細胞GHSR1a mRNA及蛋白的表達;沉默GHSR1a基因后SW480細胞活力明顯減弱;與NC組相比較，GHSR1a shRNA組細胞中PTEN mRNA及蛋白水平上調，AKT磷酸化被抑制，p53的表達明顯增加;在體內實驗中，與NC組相比較，GHSR1a shRNA組裸鼠結直腸癌皮下移植瘤重量明顯減輕，同時Ki-67表達下調，PTEN表達上調。結論:慢病毒介導的GHSR1a shRNA對體內、外人結腸癌細胞的生長有明顯抑制作用，該作用可能通過上調PTEN及其下游PI3K/AKT通路實現(xiàn)。

結直腸癌;Ghrelin;生長激素促泌素受體1a;PTEN

Ghrelin作為一種主要由胃腸道黏膜細胞分泌的生長激素促泌劑受體的內源性配體，其在控制胃酸分泌、進食和新陳代謝等生理和病理生理活動中發(fā)揮重要調控作用［1-2］。研究表明，ghrelin基于生長激素促泌素受體(growth hormone secretagogue receptors，GHSRs)而發(fā)揮調控作用，目前已知的GHSRs有GHSR1a和GHSR1b兩個亞型，GHSR1a主要分布在血管內皮細胞、心肌細胞和單核細胞中［3-4］。近年來報道稱ghrelin/GHSRs生物學軸不僅調控正常細胞生長和分化，同時與食管癌［5］、胃癌［6］和肺癌［7］等多種惡性腫瘤細胞生長和轉移等惡性生物學行為關系密切。Waseem等［8］報道使用GHSR1a拮抗劑可明顯抑制結腸癌細胞侵襲，但GHSR1a在結直腸癌中的作用機制仍待進一步研究。為此，本研究應用RNA干擾技術，構建靶向GHSR1a基因的shRNA慢病毒表達載體，感染至人結直腸癌SW480細胞中，觀察沉默GHSR1a基因對體內外結腸癌細胞生長的作用，并進一步探討其作用機制。

材料和方法

1 試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、含EDTA胰酶和高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco;TRIzol試劑、Lipofectamine 2000、Opti-MEM培養(yǎng)基和抗生素殺稻瘟菌素S購自Invitrogen;逆轉錄試劑盒和細胞蛋白提取試劑盒購自Fermentas;RT-PCR試劑盒購自TaKa-Ra;慢病毒載體系統(tǒng)pLenR-GPH vector由上海吉凱基因技術有限公司提供;限制性內切酶、T4DNA連接酶購自NEB;質粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自Qiagen;GHSR1a、PTEN和GAPDH的上、下游引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成;聚凝胺購自Sigma;CCK-8試劑盒購自Dojindo;細胞周期檢測試劑盒、Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒、HRP標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG及ABC免疫組化檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;化學發(fā)光試劑和Ki-67鼠抗人單克隆抗體購自碧云天生物技術研究所;GHSR1a兔抗人多克隆抗體、ghrelin小鼠抗人單克隆抗體、PTEN兔抗人多克隆抗體、p-AKT兔抗人多克隆抗體、p53兔抗人單克隆抗體和β-actin小鼠抗人單克隆抗體購自Epitomics。

2 細胞培養(yǎng)和實驗動物

人胚腎細胞株HEK-293T、人直腸癌高分化腺癌細胞株Caco-2、低分化腺癌細胞株SW480和人正常結腸上皮細胞株NCM460均購自ATCC，所有細胞均培育于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液含1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和1%谷氨酸鹽，置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)，當細胞融合成80%～90%時以胰蛋白酶消化并傳代，取對數(shù)生長期細胞為實驗對象。24只4～5周齡雌性BALB/c-nu/nu品系裸鼠購自北京維通利華公司，體重(18.4±0.7)g，生產許可證編號為SCXK(京) 2012-0001，飼養(yǎng)于湘雅醫(yī)學院動物實驗中心無特定病原體級實驗室。

3 實驗方法

3.1 設計干擾序列及陰性對照序列 針對已經(jīng)公布的GHSR1a基因序列(NM-198407)，設計針對人GHSR1a基因的干擾 RNA序列(GHSR1a shRNA)，正義鏈序列為 5'-TGAGAAAGCTCTCCACTCTGTTCAAGAGACAGAGTGGAGAGCTTTCTCTTTTTTC-3'，反義鏈序列為5'-ACTCTTTCGAGAGGTGAGACAAGTTCTCTGTCTCACCTCTCGAAAGAGAAAAAAGAGCT-3'。同時設計1條陰性對照(negative control，NC)序列(NC shRNA)，正義鏈序列為5'-TAACTAGTAACGGCTGCTCCTTCAAGAGAGGAGCAGCCGTTACTAGTTTTTTTTC-3'，反義鏈序列為 5'-ATTGATCATTGCCGACGAGGAAGTTCTCTCCTCGTCGGCAATGATCAAAAAAAAGAGCT-3'，并通過BLAST檢索驗證該序列不對任何基因起干擾效應。所有shRNA由上海英駿生物技術有限公司合成。

3.2 構建和鑒定慢病毒表達載體 在干擾RNA序列正義鏈及反義鏈的5'端分別加上AgeⅠ和EcoRⅠ的酶切位點，應用限制性內切酶AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切空載體PLLU2G與稀釋和退火(退火反應條件為95℃10 min，75℃10 min，55℃10 min，35℃10 min，15℃ 10 min)后的 GHSR1a shRNA及 NC shRNA在T4 DNA連接酶作用下進行連接反應，轉染新鮮大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α并挑選陽性重組克隆，經(jīng)北京華大基因研究中心測序檢測證實與GHSR1a cDNA序列一致。

3.3 HEK-293T細胞感染 取對數(shù)生長期的HEK-293T細胞，將5×106個細胞接種于培養(yǎng)皿中，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)液，加入5 mL Opti-MEM培養(yǎng)液。在一支離心管中加入20 μg重組干擾質粒pLenR-GPH(表達綠色熒光蛋白)或20 μg陰性對照質粒，分別加入Opti-MEM培養(yǎng)液中并混勻，調整溶液體積為2.5 mL。在另一支離心管中加入100μL Lipofectamine 2000，加入2.4 mL Opti-MEM培養(yǎng)液混勻，將上述質粒溶液和Lipofectamine 2000稀釋液混合并制備成質粒脂質體復合物，置室溫20 min。將3 mL質粒脂質體復合物轉移至HEK-293T細胞的培養(yǎng)皿培養(yǎng)8 h，更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，離心并過濾后分裝，使用逐孔稀釋滴度測定法測定病毒滴度后保存于－80℃。

3.4 慢病毒感染SW480細胞 將SW480細胞接種于6孔板內，每孔5×104個細胞，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后將細胞分為空白對照(blank control，BC)組、陰性對照(negative control，NC)組和GHSR1a shRNA感染組，NC組和GHSR1a shRNA感染組細胞中分別加入含8 mg/L聚凝胺的2種稀釋后病毒液1 mL，病毒液感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為5，將病毒液感染細胞12 h后棄去培養(yǎng)基，并加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白熒光的慢病毒感染細胞，流式細胞儀檢測感染效率。將感染后SW480細胞加入含殺稻瘟菌素(8 μg/L)的選擇性培養(yǎng)基進行篩選，2周后可見抗性克隆長出，取單細胞克隆轉入6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，1個月后可獲得穩(wěn)定抑制GHSR1a表達的SW480細胞。

3.5 CCK-8法檢測細胞活力 將感染后培養(yǎng)24 h 的SW480細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制備單細胞懸液，以每孔5×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中。細胞貼壁添加或不添加ghrelin(1 000 nmol/L)后放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，每組設5個復孔，同時設置空白調零組(不加細胞，加入等量的PBS)。培養(yǎng)結束前1 h，各孔加入CCK-8溶液0.01 mL后繼續(xù)培養(yǎng)1 h，選擇酶標儀波長為490 nm，測量吸光度值(A490)。細胞存活率 (%)=(實驗組A490值－空白調零組A490值)/(空白對照組A490值－空白調零組A490值)×100%。

3.6 Western blot檢測細胞中GHSR1a蛋白的表達依照細胞蛋白提取試劑盒的操作說明書提取對數(shù)生長期Caco-2、SW480和NCM460細胞蛋白質。經(jīng)Bradford法測量蛋白濃度后取30 μg樣品，加入上樣緩沖液混勻后置于100℃水浴中孵育8 min。以8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用半干電轉移法將分離的蛋白轉移到PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉于4℃下孵育過夜，洗膜后加入相應I抗，于4℃下孵育過夜，取出洗膜后，再分別加入用封閉液稀釋為1∶2 000的 II抗(HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG)室溫孵育1 h，加入化學發(fā)光試劑后經(jīng)X線膠片曝光、顯影和定影。使用Quantity One 4.6.2(Bio-Rad)軟件掃描膠片，分析各蛋白條帶灰度值，以GHSR1a蛋白條帶灰度值與內參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示GHSR1a蛋白的相對表達水平。

3.7 RT-PCR檢測SW480細胞中GHSR1a和PTEN 的mRNA表達 用TRIzol試劑提取總RNA，按說明書操作。總RNA經(jīng)紫外分光光度計測定260 nm與280 nm處光密度比值(A260/A280)為1.9～2.1。每份樣品中取3 μg RNA進行逆轉錄合成cDNA，然后取1 μL cDNA進行PCR擴增。用引物設計軟件primer3設計特異性引物。GHSR1a的上游引物為5'-GGAGTTCATTCAGATGGGAAGAC-3'，下游引物為5'-TTCACCGCATCGAAGACCGA-3'(產物為287 bp); PTEN的上游引物為5'-CGCCCGAATTCAGATGGGAGCAA-3'，下 游 引 物 為 5'-TCGACCGCATC GAAAGACCA-3'(產物為235 bp);GAPDH的上游引物為5'-GTGGC ATCCACGAAACTAC-3'，下游引物為5'-GGACTCGTCATACTCCTGCT-3'(產物為123 bp)。反應在25 μL體系中進行，反應條件為50℃ 30 min;94℃ 1 min;57℃ 1 min，72℃ 7 min。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用Bio-Rad Gel凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析，以GAPDH作為內參照，分析目的基因mRNA的相對表達水平。

3.8 制備裸鼠結直腸癌皮下移植瘤模型及分組

取對數(shù)生長期的空白對照組、陰性對照組和感染組SW480細胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基調整密度為5×109/L，裸鼠皮膚消毒后，將100 μL上述細胞懸液注射至裸鼠左腋窩皮下，每組8只，接種腫瘤后裸鼠置于SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。實驗第40天時處死裸鼠，剝離裸鼠皮下腫瘤標本后稱重。

3.9 免疫組織化學法(immunohistochemistry，IHC)檢測Ki-67和PTEN的表達 所有標本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、5 μm切片后采用SP染色法，陰性對照以PBS代替I抗，表達陰性。Ki-67表達結果判定參考Kunnumakkara等［9］的方法，在低倍鏡(×100)下隨機選擇20個視野，計數(shù)染色陽性細胞所占比例。同時在低倍鏡下隨機選擇20個視野，用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件進行分析PTEN的表達強度。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，總體及總體中兩樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 GHSR1a在正常結腸上皮細胞及結直腸癌細胞系中的表達

如圖1所示，ghrelin和GHSR1a在人正常結腸上皮細胞系NCM460中的表達量極低，而在人結直腸癌細胞系Caco-2和SW480中表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學顯著性(P＜0.05);另外，SW480細胞中的ghrelin和GHSR1a的表達量顯著高于Caco-2細胞(P＜0.05)，于是選擇ghrelin和GHSR1a表達量較高的SW480細胞進行后續(xù)實驗。

Figure 1.The levels of ghrelin and GHSR1a were significantly higher in malignant Caco-2 and SW480 cells than those in normal human colonocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NCM460 group;#P＜0.05 vs Caco-2 group.圖1 Western blot檢測ghrelin和GHSR1a在人正常結腸上皮NCM460細胞和人結直腸癌Caco-2和SW480細胞中的表達

2 建立穩(wěn)定表達GHSR1a shRNA的SW480細胞株

沉默GHSR1a基因的SW480細胞GHSR1a蛋白及mRNA表達較BC組和NC組明顯下調，差異均有統(tǒng)計學顯著性(P＜0.05)，其中GHSR1a mRNA的抑制率達71.5%，蛋白抑制率達83.2%，見圖2。

Figure 2.The production of stable GHSR1a knockdown cells.A:GHSR1a protein was assayed by Western blot analysis;B:GHSR1a mRNA level in SW480 cells was detected by RT-PCR.BC:blank control;NC:negative control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs GHSR1a shRNA group.圖2 用Western blot和RT-PCR分別檢測SW480細胞中GHSR1a的蛋白和mRNA的表達水平

3 沉默GHSR1a基因對SW480細胞增殖的影響

如圖3所示，細胞經(jīng)培養(yǎng)72 h后，GHSR1a shRNA組細胞增殖率為(161.6±20.8)%，與BC組或NC組比較，差異均有統(tǒng)計學顯著性(P＜0.05);各組細胞經(jīng)外源性ghrelin(1 μmol/L)作用72 h后，BC組和NC組的細胞存活率分別為(128.6±17.2)%和(133.5±15.4)%，與GHSR1a shRNA組相比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P＜0.05)。

Figure 3.The effect of GHSR1a shRNA on the viability of SW480 cells.A:SW480 cells were treated with culture medium(BC group)，negative control(NC group)and GHSR1a shRNA were monitored for 72 h，and the cell viability was measured by CCK-8 assay;B:the effect of exogenous ghrelin on SW480 cell viability.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs GHSR1a shRNA group;#P＜0.05 vs the same group without ghrelin.圖3 CCK-8法檢測GHSR1a shRNA對SW480細胞活力的影響

4 GHSR1a shRNA上調 PTEN蛋白同時抑制PI3K/AKT通路

Western blot檢測結果表明，感染GHSR1a shRNA對SW480細胞中ghrelin蛋白的表達無明顯影響，但PTEN和p53蛋白的表達明顯上調，同時AKT的磷酸化水平顯著下調，與BC組或NC組相比較，差異均有統(tǒng)計學顯著性(P＜0.05);另外，應用RTPCR檢測PTEN的mRNA水平結果顯示，與NC組相比較，GHSR1a shRNA組中PTEN的mRNA水平上調約1.8倍，差異有統(tǒng)計學顯著性(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.GHSR1a shRNA up-regulated PTEN and inhibited the PI3K/AKT pathway in the SW480 cells.A:the protein levels of PTEN，p-AKT and p53 were detected by Western blot analysis in the SW480 cells after treated with culture medium(BC group)，negative control(NC group)and GHSR1a shRNA;B:the PTEN mRNA was detected by RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group.圖4 GHSR1a shRNA后對SW480細胞中PTEN、p-AKT和p53蛋白水平和PTEN mRNA表達的影響

5 GHSR1a shRNA抑制結直腸癌皮下移植瘤生長

腫瘤細胞接種裸鼠皮下15 d后即可在皮下觸及腫瘤，成瘤率為100%，飼養(yǎng)至第40天實驗結束時，實驗動物均未出現(xiàn)死亡。實驗結束后剝離裸鼠皮下移植瘤組織后稱重，BC組、NC組和GHSR1a shRNA組腫瘤平均重量分別為(1.22±0.34)g、(1.09± 0.28)g和(0.63±0.17)g，GHSR1a shRNA組裸鼠腫瘤重量明顯低于BC組或NC組，差異有統(tǒng)計學顯著性(P＜0.05)，而BC組與NC組相比較差異無統(tǒng)計學顯著性(P＞0.05)，見圖5。

Figure 5.The effect of GHSR1a knockdown on in vivo growth of tumor xenograft.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs GHSR1a shRNA group.圖5 沉默GHSR1a基因在SW480細胞中的表達對裸鼠皮下移植瘤生長的影響

6 感染GHSR1a shRNA對裸鼠皮下移植瘤組織中Ki-67和PTEN表達的影響

如圖6所示，免疫組化染色結果表明，Ki-67染色陽性細胞表現(xiàn)為僅胞核染成棕褐色，PTEN陽性細胞表現(xiàn)為胞漿為棕褐色。BC組和NC組中Ki-67陽性表達強度較高，但PTEN陽性表達強度較低;而GHSR1a shRNA組腫瘤細胞中Ki-67陽性表達強度均明顯低于BC組和NC組，另外PTEN的陽性表達強度顯著增加，差異有統(tǒng)計學顯著性(P＜0.05)。

Figure 6.Ki-67 and PTEN in tumor tissue sections determined by immunohistochemistry(×400).圖6 免疫組化檢測感染GHSR1a shRNA后對裸鼠結直腸癌皮下移植瘤細胞中Ki-67和PTEN表達的影響

討論

結直腸癌作為我國最常見的消化道腫瘤之一，近年來發(fā)病率和病死率呈明顯上升趨勢，位居我國惡性腫瘤病死率的第3位。目前結直腸癌的治療方法主要是手術治療，而外科手術對早期實體瘤的患者較為有效，對復發(fā)和晚期的患者往往達不到根治的目的，因此，目前臨床上需要一種新的結直腸癌早期診斷和治療的分子標志物，以期改善患者預后［10］。目前已有多項研究報道表明ghrelin在包括結直腸癌在內多種惡性腫瘤細胞的惡性生物學行為中發(fā)揮了巨大作用［5-8］，同時GHSR的亞型之一GHSR1a在調控HEK-293細胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮了一定作用［11］，表明GHSR1a可能與惡性腫瘤細胞增殖相關，但GHSR1a在人結直腸癌中的表達及作用機制尚未見報道。為此，本研究首先比較了 ghrelin及 GHSR1a在人正常結腸上皮細胞和結腸癌細胞中的表達差異，結果表明ghrelin和GHSR1a在結腸癌細胞中的表達明顯升高，同時ghrelin及GHSR1a在結直腸高分化腺癌細胞系Caco-2中的表達顯著低于結直腸低分化腺癌細胞系SW480。既往研究表明非惡性細胞表達極少量內源性ghrelin，在缺乏胎牛血清的培養(yǎng)基中無法增殖，而惡性腫瘤細胞表達大量內源性ghrelin，并且可以在不含胎牛血清的培養(yǎng)基中增殖［9］，這種ghrelin及其受體GHSR1a在良惡性細胞中的表達差異表明ghrelin/GHSR1a生物學軸與結直腸癌細胞的惡性生物學行為有一定聯(lián)系，與文獻報道相仿，為此，本研究將進一步探討ghrelin/GHSR1a生物學軸與體內外結腸癌生長的關系及其可能作用機制。

RNA干擾技術已成為當前研究基因功能的重要工具，小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)存在感染效率低、半衰期短、維持時間較短等缺點，近年來發(fā)展的慢病毒介導的shRNA技術可高效抑制靶基因表達，成為基因沉默的最常用選擇［12］。在本研究中，我們通過RNA干擾技術設計了特異性靶向GHSR1a基因的shRNA，并通過慢病毒的介導感染至人結直腸癌SW480細胞，從而首次獲得穩(wěn)定沉默GHSR1a基因表達的結直腸癌細胞株，結果表明，感染GHSR1a shRNA慢病毒表達載體后可明顯下調GHSR1a蛋白及mRNA在SW480細胞中的表達。在體外實驗中，感染GHSR1a shRNA的結直腸癌細胞增殖能力明顯被抑制，從而進一步表明GHSR1a與腫瘤細胞增殖關系密切;既往研究表明外源性ghrelin可明顯促進腫瘤細胞增殖并抑制細胞凋亡［13］，在本實驗中，一定濃度外源性ghrelin(1 μmol/L)可促進空白對照組和陰性對照組SW480細胞增殖，而對沉默GHSR1a基因表達的SW480細胞增殖無明顯影響，從而表明外源性ghrelin需通過其受體GHSR1a才能發(fā)揮促細胞增殖作用。但抑制 GHSR1a在SW480細胞中的表達可抑制細胞增殖，這種作用是因為GHSR1a shRNA可抑制內源性ghrelin在SW480細胞中的表達還是GHSR1a本身具有一定促進腫瘤細胞增殖的活性?為進一步明確疑問，在隨后的實驗中，本研究驗證了感染GHSR1a shRNA對SW480細胞中內源性ghrelin表達無明顯影響，從而表明GHSR1a在促進體外結直腸癌細胞增殖作用中具有一定活性，抑制GHSR1a的表達，可抑制體外腫瘤細胞增殖。

為進一步驗證沉默GHSR1a基因在結直腸癌細胞中的表達對體內腫瘤細胞是否同樣具有增殖抑制作用。為此，本研究通過建立裸鼠結直腸癌皮下移植瘤模型。體內實驗結果首次表明GHSR1a shRNA可抑制增殖因子Ki-67在皮下移植瘤組織中的表達，從而抑制皮下移植瘤生長，表明沉默GHSR1a基因的表達可在體內抑制人結直腸癌細胞生長，體內實驗結果與體外實驗結果相仿，從而表明抑制GHSR1a在結直腸癌細胞中的表達可有效抑制體內外腫瘤細胞生長，進而表明GHSR1a有望成為新的結直腸癌治療的作用靶點。當前，已有GHSR拮抗劑和反向激動劑安全地用于人體實驗和嚙齒動物中，并取得了良好的療效［14-15］。

PTEN作為一種易變異的抑癌基因，其在人體正常組織中呈高表達，在維持機體內環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著關鍵的調控作用，但PTEN基因的突變或缺失可促進細胞增殖和阻斷細胞凋亡，從而在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移等多種惡性生物學行為中有著密不可分的關系［16］。在結直腸癌中，PTEN的低表達與結直腸癌的病理分級呈負相關，同時PTEN的缺失和低表達與結直腸癌淋巴結轉移關系密切［17］。在體外實驗中，Western blot和RT-PCR結果表明，GHSR1a shRNA不僅可促進體外結直腸癌SW480細胞中PTEN蛋白和mRNA的表達;另外在體內實驗中，沉默GHSR1a在SW480細胞中的表達可上調PTEN蛋白在裸鼠結直腸癌皮下移植瘤中的表達，從而表明抑制GHSR1a在結直腸癌細胞中的表達可在轉錄和翻譯水平調控PTEN基因的表達。既往研究表明腫瘤細胞中抑癌基因PTEN的缺失或表達下調可引起PIP3催化亞基的表達放大，并激活PI3K/AKT通路的磷酸化，而活化的 AKT可以磷酸化下游的mTOR，從而在細胞生長、增殖、蛋白合成和轉移等多種生物學行為中發(fā)揮中樞作用［18］，而通過 PTEN/ PI3K/AKT通路即可有效抑制結直腸癌細胞增殖和轉移［11］。在本研究中，GHSR1a shRNA可分別上調和下調p53和p-AKT在SW480細胞中的蛋白水平，從而表明PTEN/PI3K/AKT通路可能在GHSR1a促進結直腸癌細胞生長中發(fā)揮著一定作用。

綜上所述，本研究提示感染GHSR1a shRNA至結直腸癌SW480細胞后可抑制體內外結直腸細胞的生長，PTEN及其下游調控因子在GHSR1a調控體內外結直腸癌細胞生長過程中起到重要的調控作用。從而為臨床結直腸癌基因治療提供一個新的作用靶點，但仍需進一步深入研究GHSR1a是否影響結直腸癌的其它惡性生物學行為。

致謝:感謝南方醫(yī)科大學動物實驗中心對本研究順利實施給予的幫助!

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(責任編輯:陳妙玲，羅 森)

Lentivirus-mediated shRNA interferenceofghrelin receptorblocks growth of colorectal cancer cells

LIU An，HUANG Cheng-gang，XU Jia

(Department of Gastrointestinal Surgery，The First People’s Hospital of Yueyang，Yueyang 414000，China.E-mail: 325905634@qq.com)

AIM:To investigate the therapeutic effects of lentivirus-mediated shRNA targeting growth hormone secretagogue receptor 1a(GHSR1a)on colorectal cancer cell line SW480 both in vitro and in vivo.METHODS:Human GHSR1a sequence was used for the design of shRNA targeting GHSR1a，which was introduced to lentivirus，followed by transfection into SW480 cells.CCK-8 assay was performed to detect cell viability.The mRNA expression of GHSR1a and PTEN in colorectal cancer cells was detected by RT-PCR.The protein levels of GHSR1a，ghrelin，PTEN，p-AKT and p53 were determined by Western blot.Stable GHSR1a silencing in SW480 xenografts in nude mice was established.After the mice were sacrificed and weighted，immunohistochemistry was used to detect the positive expression of Ki-67 and PTEN in the tumors.RESULTS:GHSR1a was over-expressed in the malignant cells in comparison with the normal cells in vitro.The tumor specific lentivirus-mediated shRNA targeting GHSR1a gene and GHSR1a knockdown SW480 cells were successfully constructed.After transfection with GHSR1a shRNA，the expression of GHSR1a at mRNA and protein levels was markedly inhibited in the SW480 cells.Furthermore，GHSR1a silencing by specific shRNA showed increased PTEN，inhibition of AKT phosphorylation and promotion of p53 release in the SW480 cells.In vivo results demonstrated that down-regulation of GHSR1a in the SW480 cells significantly decreased the expression of Ki-67 and increased the expression of PTEN in the tumor tissues，leading to a marked reduction in tumor weight in comparison to blank control or negative controltumors.CONCLUSION:Down-regulation of GHSR1a by shRNA technique inhibits the growth of colorectal cancer cell line and xenograft tumor through activation of the PTEN/PI3K/AKT signaling pathways.

Colorectal cancer;Ghrelin;Growth hormone secretagogue receptor 1a;PTEN

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.012

1000-4718(2016)07-1227-08

2016-01-06

2016-04-21

岳陽市2014年第三批科技資助項目

△Tel:0730-8256328;E-mail:325905634@qq.com