王 浩， 孫利利， 于 楊， 楊艷茹， 馬 健， 陳 偉， 張繼國(guó)△， 秦樹存

(1泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016;2山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東泰安271000)

MG132對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞Aβ水平的影響*

王 浩1， 孫利利1， 于 楊2， 楊艷茹1， 馬 健1， 陳 偉1， 張繼國(guó)1△， 秦樹存2

(1泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016;2山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東泰安271000)

目的:觀察蛋白酶體抑制劑MG132誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein，Aβ)生成的作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。方法:培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，MG132對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，濃度分別為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L，24 h后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡; ELISA法檢測(cè)細(xì)胞Aβ1-40和Aβ1-42水平;Western blot檢測(cè)淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)、β-分泌酶(BACE1)、早老蛋白1(presenilins 1，PS1)、早老蛋白2(presenilins 2，PS2)、nicastrin(NCT)和 α-分泌酶(ADAM10)蛋白表達(dá)。結(jié)果:經(jīng)MG132處理后，細(xì)胞活力明顯下降，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，隨劑量增加凋亡率分別為36.97%、46.20%、50.50%;細(xì)胞Aβ1-42和Aβ1-40蛋白水平明顯上升;APP及Aβ代謝相關(guān)蛋白PS1、PS2和BACE1表達(dá)均出現(xiàn)劑量依賴性的增加，而ADAM10表達(dá)呈劑量依賴性降低;NCT水平變化不明顯。結(jié)論:MG132能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，通過影響Aβ生成途徑關(guān)鍵蛋白而促進(jìn)Aβ的產(chǎn)生，說明蛋白酶體活性下降可通過調(diào)節(jié)Aβ途徑參與阿爾茨海默病的發(fā)生。

阿爾茨海默病;泛素-蛋白酶體系統(tǒng);MG132;β-淀粉樣蛋白;細(xì)胞凋亡

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，隨著社會(huì)人口老齡化加劇，發(fā)病率逐年增高，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，也缺乏有效的治療措施［1］。而淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說認(rèn)為，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)是AD發(fā)病的關(guān)鍵分子［2］。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)，具有調(diào)控特定蛋白質(zhì)和去除錯(cuò)誤折疊或其它不正常折疊蛋白質(zhì)的重要功能，近年研究發(fā)現(xiàn)，UPS可能調(diào)節(jié)Aβ代謝，進(jìn)而在AD發(fā)病過程起著重要作用［3-4］，但其確切的作用及機(jī)制還未完全闡明。本課題組采用蛋白酶體抑制劑MG132抑制蛋白酶體活性，處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，觀察UPS受抑后對(duì)細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡，Aβ生成的影響，并初步探討其機(jī)制，以期為闡明UPS在AD中的作用提供依據(jù)。

材料和方法

1 細(xì)胞

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y購(gòu)于上海生命科學(xué)研究所。

2 主要試劑和儀器

蛋白酶體MG132(Sigma);完全1640培養(yǎng)基和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司);胎牛血清(杭州四季青公司);Aβ1-40和Aβ1-42ELISA試劑盒(藍(lán)基生物公司);APP、BACE1、ADAM10、PS1、PS2和NCT抗體(Abcam)。CO2培養(yǎng)箱(SANYO);多功能酶標(biāo)儀(Tecan INFINITE200);垂直電泳儀、電泳槽及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad);流式細(xì)胞儀(BD)。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥 SH-SY5Y細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到80%融合時(shí)給藥，給藥處理24 h。除MTT實(shí)驗(yàn)中MG132濃度為1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和15 μmol/L外，其余實(shí)驗(yàn)均為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L。空白對(duì)照組給予等量的DMEM培養(yǎng)基。

3.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力［5］細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，給藥處理后，去培養(yǎng)基，每孔加入含MTT的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，MTT終濃度為0.5 g/L，4 h后去除培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 100 μL，室溫?fù)u床振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度，波長(zhǎng)為490 nm，每組重復(fù)3孔。

3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，給藥處理后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，PBS清洗2次，離心去上清。500 μL緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108/L，依次加入5 μL PI和5 μL Annexin V，5 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。每組重復(fù)3孔。

3.4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞Aβ1-40和Aβ1-42水平［6］細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，給藥處理后留取上清，用于測(cè)定Aβ1-40和Aβ1-42水平;胰酶消化后收集細(xì)胞，PBS清洗2次，采用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，收集裂解液用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Aβ1-40和Aβ1-42水平，計(jì)算時(shí)將上清液及細(xì)胞裂解液中Aβ1-40和Aβ1-42含量分別相加，作為Aβ1-40和Aβ1-42的總含量。根據(jù)ELISA試劑盒說明書，采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)，樣品與Aβ-HRP親和素在預(yù)先包被抗人Aβ抗體的酶標(biāo)板孔里，37℃反應(yīng)1 h，然后再與HRP酶底物共同孵育，加入終止液后于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度。每組重復(fù)3孔。

3.5 Western blot檢測(cè)蛋白水平［7］細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，給藥處理后，胰酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗2次，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，冰上放置30 min，4℃ 12 000×g離心20 min，收集上清，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，相關(guān)Ⅰ抗室溫孵育2 h，4℃過夜，Ⅱ抗室溫孵育2 h，ECL于顯影儀中曝光顯影，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以β-actin為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量分析，比值表示其相對(duì)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 MG132降低SH-SY5Y細(xì)胞活力

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，加入MG132后的SH-SY5Y細(xì)胞活力明顯下降(P＜0.01)，隨著濃度的增加細(xì)胞活力分別下降了38.00%、47.22%、51.17%、52.00%和52.98%，表明MG132對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞具有明顯損傷作用，見圖1。

Figure 1.MG132 reduced the viability of SH-SY5Y cells.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖1 MG132降低SH-SY5Y細(xì)胞活力

2 MG132誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，MG132各濃度(2.5、5和10 μmo/L)組早期凋亡率和晚期凋亡率都明顯增加，總凋亡率分別為36.97%、46.20%和50.50%，相比空白對(duì)照組的6.31%明顯升高，說明MG 132能明顯誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，見圖2。

3 MG132提高SH-SY5Y細(xì)胞Aβ1-40和Aβ1-42的水平

與空白對(duì)照組比較，MG132各濃度組總的Aβ1-40和Aβ1-42水平都明顯增高，且具有一定的劑量依賴性，說明MG132可提高Aβ水平，見圖3。

Figure 2.MG132 induced the apoptosis of SH-SY5Y cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2 MG132誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡

Figure 3.MG132 increased the level of Aβ in the SH-SY5Y cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖3 MG132提高SH-SY5Y細(xì)胞Aβ1-40和Aβ1-42水平

4 MG132調(diào)節(jié)與Aβ生成相關(guān)蛋白的表達(dá)

Aβ由APP水解產(chǎn)生，其水解酶為BACE1和γ-分泌酶［8］。與空白對(duì)照組相比，給予MG132后，APP 和BACE1蛋白表達(dá)明顯增多。γ分泌酶是由4個(gè)亞基組成的復(fù)合蛋白，其中發(fā)揮重要作用的為PS1、PS2 和NCT［8］。與空白對(duì)照組相比，給予MG132后PS1 和PS2蛋白表達(dá)都明顯增加，NCT雖然表達(dá)也有所增加，但無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ADAM10是使APP經(jīng)非淀粉樣途徑水解的主要酶，經(jīng)此途徑水解不產(chǎn)生Aβ［8］。與空白對(duì)照組相比，給予 MG132后，ADAM10表達(dá)明顯下降，見圖4。

討論

UPS是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)降解途徑，對(duì)于維持各種細(xì)胞功能具有重要意義。UPS系統(tǒng)由泛素、泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme，E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin conjugating enzyme，E2)、泛素連接酶(ubiquitin ligase enzyme，E3)和26S蛋白酶體構(gòu)成，其中酶主要負(fù)責(zé)底物蛋白的泛素化，而26S蛋白酶體負(fù)責(zé)識(shí)別泛素分子標(biāo)記的蛋白底物并將其降解［9］。研究發(fā)現(xiàn)，UPS異常與多種神經(jīng)變性疾病相關(guān)，如帕金森病、AD等［10］。尤其是UPS與AD的相關(guān)性，越來越受到研究者的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)在AD患者腦組織中蛋白酶體活性明顯下降，尤其是與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬區(qū);AD患者2個(gè)重要的病理學(xué)改變［由Aβ形成的老年斑(senile plaque，SP)和由磷酸化Tau蛋白形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)］中泛素積聚［11-12］;也有研究發(fā)現(xiàn)泛素系統(tǒng)的紊亂及蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)的損害是AD發(fā)生的早期事件［13］;說明UPS失調(diào)在AD發(fā)生過程中可能起著重要作用。所以有學(xué)者認(rèn)為AD是蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊性疾病，蛋白質(zhì)質(zhì)量控制失衡是導(dǎo)致AD發(fā)生直接或間接原因［14］。因此本課題組利用蛋白酶體活性抑制劑MG132對(duì)UPS在AD中的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)MG132處理SH-SY5Y細(xì)胞后，細(xì)胞活力隨著MG132濃度的增高明顯下降，細(xì)胞凋亡明顯增加，表明蛋白酶體活性下降能誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，說明正常的蛋白酶體活性是維持神經(jīng)細(xì)胞活力及功能的重要因素。

Figure 4.The effect of MG132 on the expression of the related proteins for Aβ generation in the SH-SY5Y cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖4 MG132影響與SH-SY5Y細(xì)胞Aβ生成相關(guān)蛋白的表達(dá)

基于Aβ建立的淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說認(rèn)為Aβ在腦內(nèi)沉積是AD病理改變的中心環(huán)節(jié)，可引發(fā)一系列病理過程，這些病理過程又進(jìn)一步促進(jìn)Aβ沉積，從而形成一種級(jí)聯(lián)式放大效應(yīng)［15］。而有研究發(fā)現(xiàn)UPS在Aβ的生成和代謝中發(fā)揮重要作用，可調(diào)控Aβ的水平［16］。在本研究中經(jīng)不同濃度的MG132處理SH-SY5Y細(xì)胞后，Aβ1-40及Aβ1-42的水平都明顯升高，也證實(shí)了此觀點(diǎn)。同時(shí)本研究還對(duì)UPS系統(tǒng)調(diào)控Aβ水平的機(jī)制進(jìn)行了初步研究。

Aβ是由APP通過酶降解產(chǎn)生［8，17］。APP的降解包括淀粉樣肽源途徑和非淀粉樣肽源途徑。淀粉樣肽源途徑是指APP在腦內(nèi)經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶的作用生成具神經(jīng)毒性的Aβ片段，非淀粉樣肽源途徑是指APP在α-分泌酶(如ADAM10)和γ-分泌酶的作用下從Aβ序列內(nèi)部進(jìn)行降解，生成sAPPα而避免Aβ的生成。生理狀態(tài)下，APP主要經(jīng)非淀粉樣途徑水解，少量經(jīng)淀粉樣途徑產(chǎn)生 Aβ，而且sAPPα還具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用。而本研究發(fā)現(xiàn)，給予MG132后，BACE1水平明顯升高，ADAM10水平則明顯下降，說明UPS功能下降可改變生理的APP降解途徑，使其更多的經(jīng)淀粉樣肽源途徑降解。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，給予MG132后APP水平明顯升高，說明APP也可通過UPS系統(tǒng)進(jìn)行降解，這與Shen等［5］的研究結(jié)論相符。本研究還對(duì)蛋白酶體活性被抑制后γ-分泌酶蛋白表達(dá)進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)MG132明顯提高γ-分泌酶蛋白復(fù)合物中活性蛋白PS1和PS2的表達(dá)，而對(duì)NCT的影響不明顯。說明蛋白酶體活性降低引起的Aβ水平升高，可能也與UPS系統(tǒng)參與γ-分泌酶的代謝有關(guān)。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制蛋白酶體活性，可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷和Aβ水平上升，其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)與Aβ生成相關(guān)的底物APP及α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶相關(guān)組分有關(guān)，但對(duì)其深入的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅 森)

Effect of MG132 on Aβ generation in SH-SY5Y cells

WANG Hao1，SUN Li-li1，YU Yang2，YANG Yan-ru1，MA Jian1，CHEN Wei1，ZHANG Ji-guo1，QIN Shu-cun2

(1School of Pharmaceutical Science，Taishan Medical University，Taian 271016，China;2Key Laboratory of Atherosclerosis in Universities of Shandong，Institute of Atherosclerosis，Taishan Medical University，Taian 271000，China.E-mail:jgzhang@tsmc.edu.cn;shucunqin@hotmail.com)

AIM:To observe the influences of different concentrations of MG132 on apoptosis and beta-amyloid protein(Aβ)generation in SH-SY5Y cells，and to explore the underlying mechanism.METHODS:SHSY-5Y cells were incubated with MG132 for 24 h.The final concentrations of MG132 were 2.5，5 and 10 μmol/L.The cell viability was determined by MTT assay.The cell apoptosis was assessed by flow cytometry.The levels of Aβ were measured by ELISA.The relative protein levels were detected by Western blot.RESULTS:In the SH-SY5Y cells，MG132 reduced the cell viability，induced the cell apoptosis，increased the level of Aβ，and increased the expression of the related proteins for Aβ generation in a concentration-dependent manner.CONCLUSION:MG132 induces apoptosis and increases the levels of Aβ1-42and Aβ1-40by regulating the proteins related to Aβ generation in the SH-SY5Y cells.

Alzheimer’s disease;Ubiquitin-proteasome system;MG132;Beta-amyloid protein;Apoptosis

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.007

1000-4718(2016)07-1195-05

2015-12-08

2016-02-29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81441111;No.81302202);山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.ZR2011HM044);山東省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(No.2013WS0313);泰安市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2015NS2072)

△張繼國(guó) Tel:0538-6229836;E-mail:jgzhang@tsmc.edu.cn;秦樹存 Tel:0538-6222986;E-mail:shucunqin@hotmail.com