侯西坦，廖梅杰，李 彬，王印庚，張 正，陳貴平，榮小軍，孫金生，范瑞用

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3.青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司，山東 青島 266408）

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刺參4個(gè)不同選育品系幼參對(duì)低鹽脅迫的耐受及生理生化響應(yīng)

侯西坦1，2，廖梅杰2，李 彬2，王印庚2，張 正2，陳貴平2，榮小軍2，孫金生1，范瑞用3

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3.青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司，山東 青島 266408）

由于黃河口區(qū)域鹽度偏低且不穩(wěn)定，刺參（Apostichopus japonicus）的生長和存活受到嚴(yán)重威脅。為評(píng)估4個(gè)不同品系（日本刺參F2代RC-F2、抗病刺參F3代KC-F3、多刺刺參F2代DC-F2、青青刺參F1代QQ-F1）的低鹽耐受力及其生理生化響應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)以青島野生群體（QW）為對(duì)照，通過測定低鹽脅迫下幼參的生長、存活以及非特異性免疫酶活力變化，評(píng)價(jià)了4個(gè)刺參不同選育品系對(duì)低鹽的耐受狀況。結(jié)果表明，在鹽度17以下，除了QQ-F1表現(xiàn)為正生長，其他群體均為負(fù)生長。RC-F2、KC-F3、DC-F2、QQ-F1和QW的30天半致死鹽度（LS50-30d）分別為15.02、15.19、16.48、14.26和15.13，QQ-F1顯著低于其他4個(gè)群體；鹽度14時(shí)，5個(gè)群體的半致死時(shí)間（ST50）分別為19.84 d、18.43 d、10.11 d、23.54 d 和19.01 d，QQ-F1的ST50顯著長于其他4個(gè)群體。在低鹽脅迫時(shí)QQ-F1的ACP、AKP、SOD、LZM酶指標(biāo)的下降幅度顯著低于其他4個(gè)群體。不同選育群體的低鹽耐受力排序?yàn)镼Q-F1＞RC-F2＞QW＞KC-F3＞DC-F2，QQ-F1群體表現(xiàn)出良好的低鹽耐受能力，在低鹽度海域或鹽度不穩(wěn)定的海域具有良好的推廣應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可為刺參健康養(yǎng)殖、良種性狀評(píng)價(jià)、選育與推廣等方面提供參考依據(jù)。

刺參（Apostichopus japonicus）；低鹽脅迫；特定生長率；半致死鹽度；半致死時(shí)間；非特異性免疫酶

doi：10.11759/hykx 20151030001

刺參，又名仿刺參（Apostichopus japonicus），隸屬 于 棘 皮 動(dòng) 物 門 （Echinodermata）、 海 參 綱（Holothuroidea）、楯手目（Aspidochirota）、刺參科（Stichopodidae）、仿刺參屬（Apostichopus）［1］，因其具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值而位列“海產(chǎn)八珍”之首。自20世紀(jì)80年代刺參苗種繁育技術(shù)突破以后，刺參增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，形成了一個(gè)以山東、遼寧、河北沿海為主產(chǎn)區(qū)、并以“北參南養(yǎng)”、“東參西養(yǎng)”等模式延伸到閩、浙沿海和黃河口地區(qū)的刺參增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)群［2］，已形成年產(chǎn)量19.37萬t、養(yǎng)殖面積達(dá)21萬ha，產(chǎn)值愈200億元的刺參增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)［3］。然而，隨著產(chǎn)業(yè)規(guī)模的急劇擴(kuò)大，養(yǎng)殖刺參出現(xiàn)了生長緩慢、抗逆能力下降等種質(zhì)退化現(xiàn)象，亟需開展具有生長、抗病、耐低鹽等優(yōu)良性狀良種的選育工作。

鹽度不僅是海水最重要的理化特性，也是影響刺參生長發(fā)育的重要因素之一，許多海洋生物的呼吸排泄、能量收支都與海水鹽度有著密切的聯(lián)系［4-6］。一般情況下，刺參對(duì)鹽度的耐受范圍是22～36［7］；其最適鹽度為28～34［8］。由于缺少滲透壓調(diào)節(jié)器官， 棘皮動(dòng)物被認(rèn)為是狹鹽性動(dòng)物［1，9-10］。然而，最近的研究表明，許多動(dòng)物可以通過調(diào)節(jié)體腔液的體積以及細(xì)胞內(nèi)的滲透壓平衡能夠適應(yīng)很寬的鹽度范圍［11-13］。趙斌等［14］對(duì)比低鹽脅迫下3種不同規(guī)格刺參生長的差異，發(fā)現(xiàn)鹽度20時(shí)，3種規(guī)格刺參特定生長率均為負(fù)值，刺參表現(xiàn)為負(fù)增長。胡煒等［15］發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽度降至22時(shí)體質(zhì)量增長變緩，趨于停滯，但仍能維持正常的生理活動(dòng)，個(gè)體死亡率為15%～20%。呂偉志等［16］認(rèn)為刺參能夠在鹽度16的海水下生存30 d；雨季來臨時(shí)，只要海水鹽度不低于16，時(shí)間不超過一個(gè)月的池塘均可養(yǎng)殖海參。肖培華等［17］采用鹽度驟降的模式，研究發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量在5 g以上的刺參，96 h內(nèi)所能夠承受的最低鹽度為18。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)選取鹽度18作為刺參低鹽脅迫的起始鹽度。鹽度的變化模式一般分為鹽度緩降和鹽度驟降兩種。胡煒等［15］采用逐步降低鹽度（Salinity decreased gradually，DG）和鹽度驟降（Salinity decreased sharply，DS）兩種模式進(jìn)行鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽度22和鹽度18的DG和DS實(shí)驗(yàn)組刺參在成活率方面均出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），鹽度18時(shí)DS組刺參成活率最低，僅為45.67%。Hu等［18］通過對(duì)比鹽度驟降和鹽度緩降兩種模式，發(fā)現(xiàn)采用鹽度驟降模式，導(dǎo)致刺參僅能適應(yīng)很窄的鹽度范圍，然而采用鹽度緩降的模式，刺參可以適應(yīng)更廣的鹽度范圍。鑒于鹽度驟降會(huì)導(dǎo)致刺參產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)致使我們無法區(qū)分刺參苗種死亡是鹽度本身還是降低鹽度的過程引發(fā)的，因此本實(shí)驗(yàn)采用梯度降鹽（鹽度緩降）這一模式進(jìn)行低鹽脅迫實(shí)驗(yàn)，以期更客觀地反映不同選育群體的刺參低鹽耐受極限。

自2005年起，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所圍繞刺參開展良種選育相關(guān)研究，引入日本及中國沿海10余個(gè)不同地理種群優(yōu)質(zhì)刺參資源，構(gòu)建了刺參親本庫，以刺型、耐高溫、抗?fàn)N爛弧菌等為目標(biāo)開展優(yōu)良苗種培育，目前已培育出日本刺參F2代、抗病刺參F3代、多刺刺參F2代和青青刺參F1 代4個(gè)不同刺參群體。其中抗病刺參是以抗?fàn)N爛弧菌為選育目標(biāo)選育而來，而燦爛弧菌是刺參“腐皮綜合征”的主要致病菌，可以導(dǎo)致刺參大批量化皮死亡，使刺參養(yǎng)殖業(yè)蒙受重大損失［19-21］。多刺刺參主要特征為刺列數(shù)為6排，刺總數(shù)≥45個(gè)。青青刺參主要特征為表皮呈青綠色，棘刺粗大且呈桔黃色。隨著刺參育種工作的不斷推進(jìn)，對(duì)選育進(jìn)程中不同世代的性狀進(jìn)行評(píng)定是良種選育的重要研究內(nèi)容。隨著海參產(chǎn)業(yè)規(guī)模的擴(kuò)大，黃河口也形成了較大規(guī)模的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶；然而，這一地區(qū)海域存在河口排洪強(qiáng)度大、鹽度低等特點(diǎn)，低鹽度給海參健康養(yǎng)殖造成了巨大威脅和經(jīng)濟(jì)損失。因此，耐低鹽刺參的培育對(duì)保障這些海域進(jìn)行刺參健康養(yǎng)殖具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文以未經(jīng)選育的野生刺參苗種為對(duì)照，測定低鹽脅迫條件下不同刺參品系生長、存活和非特異性免疫酶活力的差異，對(duì)不同選育品系對(duì)低鹽耐受力進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為刺參健康養(yǎng)殖、良種性狀評(píng)價(jià)、選育與推廣等方面提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)選用4個(gè)刺參不同選育品系，選育背景分別為：日本刺參F2代（RC-F2）是從日本引入的野生刺參群體自交獲得的F2代群體；抗病刺參F3代（KC-F3）是以抗?fàn)N爛弧菌侵染為選育目標(biāo)，以日本青刺參、煙臺(tái)野生刺參和青島野生刺參3個(gè)基礎(chǔ)群體，經(jīng)抗逆馴化后存活的個(gè)體為親本培育的F3代；多刺刺參F2代（DC-F2）是以棘刺數(shù)量為選育目標(biāo)，從青島野生刺參中選取棘刺總數(shù)≥45的個(gè)體為親本所培育的F2代苗種；青青刺參F1代（QQ-F1）是以青島野生刺參中選取表皮青綠色、棘刺桔黃色的個(gè)體為親本所培育的F1代；以未經(jīng)選育的青島野生刺參（QW）苗種為對(duì)照組，詳見表1。實(shí)驗(yàn)所用刺參均取自青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司，5個(gè)群體平均體質(zhì)量分別為5.08 g±0.74g（RC-F2）、5.22 g±0.58g（KC-F3）、5.07 g± 0.53g（DC-F2）、5.14 g±0.65g（QQ-F1）和4.93 g±0.51g（QW），參齡均為6個(gè)月。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用刺參不同品系的親本來源和性狀Tab.1 Source and characteristics of the parents of the 5 different A.japonicus populations used in this study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 刺參苗種的暫養(yǎng)

取4個(gè)刺參不同選育品系和野生刺參苗種各700頭在水族實(shí)驗(yàn)車間暫養(yǎng)7d，暫養(yǎng)條件為水溫18.05℃± 0.13℃，鹽度31.43±0.1，溶氧7.08 mg/L±0.04 mg/L，pH 8.08±0.05。暫養(yǎng)所用容器為400 L的白色塑料水槽（100 cm×60 cm×60 cm）。暫養(yǎng)期間每天按時(shí)投喂、換水和吸底清污。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

低鹽脅迫共分6個(gè)鹽度組，鹽度設(shè)置分別為：13、14、15、16、17、18，以自然海水鹽度組（31.00±0.53）作為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行水槽中放養(yǎng)30頭刺參，低鹽脅迫所用養(yǎng)殖水槽為容積為40 L的白色塑料水槽（45 cm×30 cm×30 cm）。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)操作與管理

實(shí)驗(yàn)期間水源為砂濾的自然海水，海水鹽度為31.00±0.53，實(shí)驗(yàn)所用不同鹽度海水為砂濾后的海水中添加自來水調(diào)配，鹽度用YSI 550水質(zhì)測量儀測定。

實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2014年9月8日至2014年11月1日，實(shí)驗(yàn)周期為54 d。實(shí)驗(yàn)期間水溫16.53℃±1.41℃，溶氧7.01 mg/L±0.18 mg/L，pH 8.14±0.11。本實(shí)驗(yàn)采用梯度降低鹽度的方法：鹽度為31～21，每天降低1個(gè)鹽度；鹽度為20～13，每2 d降低1個(gè)鹽度，兩個(gè)過程共24 d，整個(gè)馴化期間均無刺參死亡。以鹽度降至相應(yīng)低鹽脅迫鹽度時(shí)為相應(yīng)脅迫試驗(yàn)起始點(diǎn)，對(duì)試驗(yàn)用刺參分組并稱重記為試驗(yàn)初始體質(zhì)量，低鹽脅迫試驗(yàn)周期為30 d。

實(shí)驗(yàn)期間正常投喂，每日投喂1次，每天采用虹吸的方法吸底清污并且換水，日換水量為總水量的1/3左右。每天觀察刺參吐腸、化皮頭數(shù)和刺參苗種的生理狀態(tài)，并記錄養(yǎng)殖用水的鹽度、溫度、溶氧和pH等水質(zhì)指標(biāo)。

1.3 低鹽脅迫下各品系刺參特定生長率的測定

脅迫期間每15 d稱一次體質(zhì)量，刺參體質(zhì)量測量方法參考王印庚等［22］。鑒于鹽度13組5個(gè)群體刺參在30 d內(nèi)出現(xiàn)大規(guī)模死亡，僅QQ-F1有少量存活，本實(shí)驗(yàn)采用15 d時(shí)刺參苗種的平均體質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。利用特定生長率 RSG（Specific Growth Rate）衡量刺參生長情況，特定生長率的計(jì)算公式為：

式中，Wt為最終體質(zhì)量，W0為初始體質(zhì)量，t為養(yǎng)殖天數(shù)。

1.4 低鹽脅迫下各品系刺參存活率的測定

鑒于刺參死亡標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，且死亡個(gè)體在養(yǎng)殖水體中對(duì)養(yǎng)殖水體污染過重，本實(shí)驗(yàn)以吐腸率和化皮率為判定依據(jù)，對(duì)刺參死亡的定義為：在實(shí)驗(yàn)條件下，出現(xiàn)吐腸或化皮，且失去正常吸附能力的個(gè)體，視為刺參死亡個(gè)體。在飼養(yǎng)期間每天觀察和記錄刺參吐腸和化皮頭數(shù)，并及時(shí)將其撈出。各刺參群體存活率從進(jìn)入相應(yīng)低鹽脅迫第1天開始統(tǒng)計(jì)。為衡量刺參對(duì)低鹽的耐受限度，本實(shí)驗(yàn)選取3個(gè)耐鹽評(píng)價(jià)指標(biāo)，即 30 d半致死鹽度（Median lethal salinity-30d，LS50-30d）、低鹽度下的開始死亡時(shí)間（Time of beginning death，TBD）和半致死時(shí)間（Median survival time，ST50）［23-25］。本實(shí)驗(yàn)采用線性回歸法求得LS50-30d、TBD和ST50［26］，公式為：Y=+b（X-），公式中因變量Y為鹽度或時(shí)間，變量X為死亡率，為實(shí)驗(yàn)組鹽度或時(shí)間的平均值，為實(shí)驗(yàn)組死亡率的平均值，b為系數(shù)，

1.5 低鹽脅迫下各品系刺參非特異性免疫酶活的測定

為判斷低鹽脅迫下刺參免疫活力的變化，實(shí)驗(yàn)選取刺參體腔液堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）、酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和溶菌酶（Lysozyme，LZM）為刺參非特異性免疫酶指標(biāo)。樣品采集時(shí)間為上述低鹽脅迫試驗(yàn)中進(jìn)入低鹽脅迫第2天抽取刺參苗種的體腔液。同時(shí)為了更客觀地反映鹽度下降過程中免疫酶指標(biāo)的變化，增加了鹽度為31、27、24、21時(shí)各群體樣本，樣品采集時(shí)間為馴化階段進(jìn)入相應(yīng)鹽度第2天降低鹽度之前。體腔液抽取方法為：沿刺參腹部剪開，抽取體腔液，然后4℃，4 000 r/min離心10 min，取上清液用于非特異性免疫酶活測定。各酶活力的測定均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒，測定方法及酶活計(jì)算公式參照試劑盒說明書。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行繪圖分析，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因子方差分析，設(shè)顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系存活的影響

低鹽脅迫下對(duì)刺參不同選育品系存活的影響如圖1所示。按照試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各群體的存活率作為衡量指標(biāo)，在低鹽脅迫時(shí)，鹽度越低各群體的存活率也逐步下降，但不同選育品系在各鹽度低鹽脅迫時(shí)存活率的變化趨勢存在較顯著的差異。在鹽度17以上時(shí)，不同群體的存活率無顯著差異（P＞0.05），鹽度降至16時(shí)，DC-F2出現(xiàn)急性死亡，存活率大幅下降至32.22%，顯著低于其他4個(gè)群體；在鹽度降至15時(shí)，除QQ-F1外，其他3個(gè)群體也開始出現(xiàn)大批死亡，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，QQ-F1的存活率為64.45%，顯著高于其他4個(gè)群體（P＜0.01）；在鹽度降低至13時(shí)，除QQ-F1仍有少量存活外（存活率為5.56%），其他4個(gè)群體均全部死亡，死亡率達(dá)到100%。

圖1 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系存活的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3）Fig.1 Effects of low salinity on the survival rate of the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=3）圖中不同字母代表此鹽度下不同品系之間有顯著性差異（P＜0.05），下同Different letters at the figure represent a significant difference between the strains at that salinity（P＜0.05），the same as follows

根據(jù)不同低鹽濃度脅迫下各群體刺參苗種死亡情況，采用線性回歸法計(jì)算出各鹽度梯度下不同群體開始死亡時(shí)間（TBD）和ST50見表2。在鹽度16時(shí)DC-F2第5.71天開始出現(xiàn)死亡，在17.48 d死亡達(dá)到半數(shù)，而其他4個(gè)群體始終超過半數(shù)存活；鹽度15時(shí)，僅有QQ-F1始終超過半數(shù)存活，RC-F2、KC-F3和QW分別在9.15 d、7.43 d和8.86 d開始死亡，ST50分別為26.74 d、23.41 d和25.58 d，并且顯著長于DC-F2（P＜0.01）；在鹽度14時(shí)，QQ-F1在第10.36 d開始出現(xiàn)死亡，第23.54天時(shí)死亡達(dá)到半數(shù)，顯著長于其他4個(gè)群體（P＜0.05）。鹽度13時(shí)，5個(gè)群體刺參開始死亡時(shí)間均小于10 d。

表2 刺參不同選育品系在各低鹽脅迫下的開始死亡時(shí)間及半致死時(shí)間（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3）Tab.2 The TBD and ST50of the five populations of A.japonicus at different salinity conditions(Mean±SD,n=3)

采用線性回歸法計(jì)算出各群體刺參LS50-30d如圖2所示，DC-F2的LS50-30d為16.48，顯著高于其他4個(gè)群體（P＜0.01）；QQ-F1的LS50-30d為14.26，顯著低于其他4個(gè)群體（P＜0.05）。RC-F2、KC-F3和QW 的LS50-30d分別為15.02、15.19和15.13，相互之間差異不顯著（P＞0.05）。由此可見，所選育的4個(gè)群體中QQ-F1具有最高的低鹽耐受性。

圖2 刺參不同選育品系30天半性致死鹽度（LS50-30d）（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3）Fig.2 The median lethal salinity-30d（LS50-30d）for the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=3）

2.2 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系特定生長率的影響

低鹽脅迫對(duì)5個(gè)不同刺參群體特定生長率的影響如圖3所示。在鹽度31時(shí)，各刺參群體特定生長率均維持在較高水平，并且無顯著性差異（P＞0.05）。在受到低鹽脅迫時(shí)，5個(gè)刺參群體的特定生長率隨著鹽度的下降而顯著下降。當(dāng)鹽度降低到18時(shí)各群體的特定生長率均顯著降低，僅有QQ-F1和QW表現(xiàn)為正生長（RSG＞0），其他3個(gè)刺參群體均出現(xiàn)負(fù)生長（RSG＜0）；而當(dāng)鹽度降至17時(shí)，僅有QQ-F1依然保持正生長狀態(tài)（RSG＞0），當(dāng)鹽度低于16時(shí)，所有刺參群體均表現(xiàn)出負(fù)生長。從各群體在不同低鹽脅迫時(shí)RSG顯著性變化的鹽度節(jié)點(diǎn)可以看出，RC-F2、KC-F3、DC-F2、QQ-F1和QW苗種分別在鹽度14、15、16、13、14時(shí)較相鄰上一鹽度出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。

圖3 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系特定生長率的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3）Fig.3 Effects of low salinity on the specific growth rate of the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=3）

2.3 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系非特異性免疫酶活的影響

2.3.1 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系堿性磷酸酶(AKP)的影響

低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系A(chǔ)KP的影響如圖4所示。隨著鹽度的降低5個(gè)群體AKP活性均出現(xiàn)先升高后降低的過程。在鹽度由31降至21的過程中，5個(gè)群體均表現(xiàn)出AKP活性升高的現(xiàn)象，RC-F2和DC-F2在鹽度為21時(shí)達(dá)到峰值，活力分別為5.06金氏單位/100mL和7.63金氏單位/100mL；KC-F3、QQ-F1和QW在鹽度為24時(shí)達(dá)到峰值，活力分別為5.89金氏單位/100 mL、7.07金氏單位/100 mL和6.53金氏單位/100 mL。鹽度降至18時(shí)，各群體AKP的活性較之前的高鹽時(shí)顯著下降（P＜0.01）。不同群體在低鹽脅迫時(shí)AKP的變化各不相同：RC-F2在鹽度15～18時(shí)，AKP活力變化不顯著（P＞0.05），在鹽度14時(shí)AKP活力顯著下降（P＜0.01）并達(dá)到最低點(diǎn)，活力為0.50金氏單位/100 mL；KC-F3 的AKP活力隨著鹽度的下降而下降，但在鹽度為16～18時(shí)活力下降不顯著（P＞0.05），在鹽度降為15時(shí)AKP活力顯著下降（P＜0.01）；DC-F2在鹽度為16時(shí)AKP活性下降幅度較其他4個(gè)群體差異極顯著（P＜0.01）；與其他4個(gè)群體不同的是，QQ-F1的AKP活力在鹽度降至13時(shí)才出現(xiàn)顯著下降（P＜0.01）；QW的AKP活力變化顯著下降點(diǎn)出現(xiàn)在鹽度為14時(shí)（P＜0.05）。

圖4 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系堿性磷酸酶（AKP）的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=9）Fig.4 Effects of low salinity on AKP of the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=9）

2.3.2 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系酸性磷酸酶(ACP)的影響

低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系A(chǔ)CP的影響如圖5所示。低鹽脅迫下不同群體ACP活力變化與AKP活性變化相似，也是出現(xiàn)ACP活性先升高后降低的過程，除RC-F2在鹽度為21時(shí)達(dá)到峰值外，其他4個(gè)群體均在鹽度為24時(shí)達(dá)到峰值。在進(jìn)入低鹽脅迫后（鹽度低于18以后），ACP活性較鹽度21時(shí)顯著下降（P＜0.01）。同一低鹽濃度脅迫下各群體AKP下降幅度存在較大差異，DC-F2在鹽度16時(shí)的下降幅度最大，與其他4個(gè)群體差異顯著（P＜0.01），而QQ-F1在鹽度14時(shí)仍然保持在較高的水平，活力為1.37金氏單位/100 mL。

圖5 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系酸性磷酸酶（ACP）的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=9）Fig.5 Effects of low salinity on ACP of the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=9）

2.3.3 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系超氧化物歧化酶(SOD)的影響

低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系SOD的影響如圖6所示。隨著鹽度的降低5個(gè)群體SOD活性相對(duì)于AKP活性和ACP活性波動(dòng)比較平穩(wěn)。在鹽度高于21時(shí)，不同群體不同鹽度SOD活力差別不顯著（P＞0.05），表達(dá)較平穩(wěn)。進(jìn)入低鹽脅迫后（鹽度低于18以下），各群體SOD表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，且均在鹽度17時(shí)SOD活力達(dá)到峰值，隨后隨著鹽度的降低其SOD活性逐步降低。同一低鹽濃度脅迫下各群體SOD下降幅度存在較大差異，其中DC-F2在鹽度16和14時(shí)SOD活力均顯著低于與其他4個(gè)群體（P＜0.01）；QQ-F1的SOD活力在14時(shí)仍然保持在較高的水平，活力為25.76U/mL，在鹽度13時(shí)才出現(xiàn)顯著下降（P＜0.01）；而RC-F2和KC-F3在鹽度14 時(shí)SOD活力出現(xiàn)顯著下降（P＜0.01）。

2.3.4 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系溶菌酶(LZM)的影響

圖6 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系超氧化物歧化酶（SOD）的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=9）Fig.6 Effects of low salinity on SOD of the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=9）

圖7 低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系溶菌酶（LZM）的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=9）Fig.7 Effects of low salinity on LZM of the five strains ofA.japonicus（Mean±SD，n=9）

低鹽脅迫對(duì)刺參不同選育品系LZM的影響如圖7所示。隨著鹽度的降低5個(gè)群體LZM活性均出現(xiàn)先升高后降低的過程，且均在鹽度18時(shí)達(dá)到峰值，在鹽度12時(shí)活力達(dá)到最低。但在低鹽脅迫過程中，對(duì)于不同選育品系其LZM活力下降幅度存在較大差異，DC-F2的LZM活力下降最快，在鹽度16時(shí)LZM活力下降幅度顯著大于其他4個(gè)群體（P＜0.05）。相對(duì)于其他群體，QQ-F1的LZM活力下降較為緩慢，在鹽度14時(shí)仍保持較高的LZM活力，顯著高于其他4個(gè)群體（P＜0.01）

3 討論

3.1 低鹽脅迫對(duì)刺參生長和存活的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刺參不同品系在低鹽耐受時(shí)的存活率存在較大差異，由刺參5個(gè)不同群體30d的半致死鹽度（LS50-30d）可知，QQ-F1的LS50-30d最低，為14.26，而DC-F2的LS50-30d最高，為16.48，兩者鹽度差值為2.22，說明QQ-F1對(duì)低鹽脅迫的耐受性更好。刺參不同群體各鹽度下的開始死亡時(shí)間（TBD）和半致死時(shí)間（ST50）也印證了這一結(jié)論，即在相同低鹽脅迫下，QQ-F1出現(xiàn)死亡和死亡達(dá)到半數(shù)的時(shí)間顯著滯后于其他4個(gè)群體。Join［27］研究發(fā)現(xiàn)海參可以通過改變其結(jié)締組織的機(jī)械強(qiáng)度，收縮自身體積來積極調(diào)節(jié)滲透壓平衡。根據(jù)刺參不同群體的選育目標(biāo)和結(jié)果發(fā)現(xiàn)DC-F2的顯著特點(diǎn)為棘刺列數(shù)和棘刺總數(shù)高，表面積大，而QQ-F1的顯著特點(diǎn)為體壁厚且棘刺粗壯，體壁機(jī)械強(qiáng)度較大。由此初步推測相應(yīng)低鹽脅迫時(shí)DC-F2需要消耗更多的能量用于維持滲透壓的平衡，而導(dǎo)致其低鹽耐受力比較弱，這可能也是DC-F2在鹽度16時(shí)就出現(xiàn)大批死亡的原因之一。不同刺參品系在低鹽耐受時(shí)的特定生長率同樣存在較大差異，當(dāng)鹽度達(dá)到18時(shí)，除QQ-F1外，其他4個(gè)群體均開始出現(xiàn)負(fù)增長，QQ-F1在鹽度高于17時(shí)均可表現(xiàn)為正增長。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)束時(shí)不同群體低鹽耐受存活率，鑒于不同群體在鹽度13和14時(shí)的存活率均較低，在低于15鹽度以下時(shí)進(jìn)行RSG比較意義不大，因此選擇鹽度16以上時(shí)的RSG判定不同群體的耐低鹽特性更為客觀。根據(jù)不同群體在鹽度為16、17和18時(shí)的RSG可以看出QQ-F1在低鹽度下的特定生長率顯著高于其他4個(gè)群體，表現(xiàn)出良好的耐低鹽特性。綜合不同群體苗種特點(diǎn)和對(duì)低鹽脅迫的耐受性可以看出，棘刺的數(shù)目和體壁的厚度與低鹽脅迫的耐受性顯著相關(guān)。通過5個(gè)不同群體對(duì)低鹽脅迫的耐受能力可以看出，QQ-F1在低鹽海域或鹽度變化較大海域的養(yǎng)殖具有較廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 刺參不同選育品系非特異性免疫酶活對(duì)低鹽脅迫的響應(yīng)

刺參屬于低等生物，不像高等生物一樣有著發(fā)達(dá)的特異性免疫［28］，因此刺參免疫防御體系主要由非特異性免疫系統(tǒng)來承擔(dān)。刺參體腔細(xì)胞既是細(xì)胞免疫的承擔(dān)者，又是體液免疫因子的提供者［29］。激活后的體腔細(xì)胞可以產(chǎn)生多種免疫因子以及各種具有免疫活性的酶類（如超氧化物歧化酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶等），提高刺參機(jī)體的免疫力［30］。因此可以通過刺參非特異免疫酶活變化，來反應(yīng)其在脅迫狀態(tài)下的免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)研究了刺參不同選育品系在不同低鹽脅迫下AKP、ACP、SOD和LZM的變化過程，從變化趨勢可以看出，在鹽度21～31時(shí)，ACP、AKP、LZM活性隨著鹽度的降低酶活呈上升趨勢，SOD活力變化不顯著，說明在刺參適宜的鹽度范圍內(nèi)，刺參可通過提高ACP、AKP、LZM等各種免疫酶活力來減少鹽度下降對(duì)機(jī)體造成的影響，以維持機(jī)體處于正常的生理狀態(tài)。而當(dāng)鹽度降低突破其適宜鹽度后即機(jī)體處于低鹽脅迫時(shí)，ACP和AKP活力迅速下降，其解毒和抗異物能力明顯減弱；SOD 和LZM卻在鹽度17和18時(shí)酶活力顯著上升并達(dá)到峰值，而在鹽度降至16以下時(shí)SOD和LZM活性迅速下降，說明刺參在一定低鹽范圍內(nèi)可通過提高SOD和LZM活性即提高抗氧化酶等活力來抵抗低鹽脅迫，然而，在突破一定鹽度閾值后，機(jī)體無法承受高強(qiáng)度低鹽脅迫，SOD和LZM表達(dá)能力也隨之下降，這與董曉亮等［31］研究結(jié)果一致。結(jié)合低鹽脅迫死亡情況也可以看出，在鹽度低于16時(shí)，各刺參群體陸續(xù)出現(xiàn)急性死亡。在低鹽度下，其刺參的死亡原因相當(dāng)復(fù)雜，但其中非特異性免疫酶活力大大下降現(xiàn)象也可能與死亡有一定關(guān)系。對(duì)比5個(gè)不同群體的4種非特異性免疫酶活力變化幅度可以看出，DC-F2苗種的4種酶活力均在鹽度16時(shí)下降幅度最高，顯著低于其他4個(gè)群體（P＜0.05），說明低鹽耐受力較差；而QQ-F1在鹽度低于16以后4種酶活力雖然也有顯著下降，但其酶活下降幅度較小，在鹽度14時(shí)，仍維持在較高水平，顯著高于其他4個(gè)群體（P＜0.01），說明其具有較強(qiáng)的低鹽耐受能力。

綜合以上結(jié)果可以看出，以耐低鹽為評(píng)判指標(biāo)時(shí)，5個(gè)群體的低鹽耐受力排序?yàn)镼Q-F1＞RC-F2＞QW＞KC-F3＞DC-F2，QQ-F1的LS50-30d為14.26，表現(xiàn)出良好的低鹽耐受能力和較高非特異性免疫酶活力。這是目前刺參低鹽耐受能力強(qiáng)的品系之一，在入?？凇⒏蹫硡^(qū)域等低鹽度或鹽度不穩(wěn)定的海域具有良好的推廣應(yīng)用前景。本次實(shí)驗(yàn)探究了QQ-F1、RC-F2、QW、KC-F3、DC-F2 5個(gè)刺參群體的低鹽耐受能力，然而隨著育種的不斷開展，不同世代之間對(duì)低鹽的耐受能力還有待于進(jìn)一步探究，以便選擇低鹽耐受能力更強(qiáng)的品系，應(yīng)用于刺參的育、繁、推工作。其中，重點(diǎn)研究青青刺參品系的耐低鹽機(jī)理以及在低鹽區(qū)開展養(yǎng)殖測試，為耐低鹽刺參品系的養(yǎng)殖推廣提供技術(shù)參數(shù)。

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（本文編輯：梁德海）

Response to low salinity of four strains of sea cucumber Apostichopus japonicus larvae

HOU Xi-tan1,2,LIAO Mei-jie2,LI Bin2,WANG Yin-geng2,ZHANG Zheng2,CHEN Gui-ping2,RONG Xiao-jun2,SUN Jin-sheng1,FAN Rui-yong3

（1.College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；2.Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences；Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology，Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes，Qingdao 266071，China；3.Qingdao Ruizi Rare Marine Animal Culture&Development Co.Ltd，Qingdao 266408，China）

Nov.11，2015

Apostichopus japonicus；low salinity stress；specific growth rate；median lethal salinity；median survival time；non-specific immune enzyme activity

The salinity of the sea in estuarine areas is low and unstable，which threatens the survival and growth of sea cucumbers.To evaluate the low salinity tolerance of four sea cucumber（Apostichopus japonicus）strains（RC-F2，KC-F3，DC-F2，and QQ-F1），the growth，survival，and non-specific immune enzyme activities were monitored at seven salinity levels（13，14，15，16，17，18，and 31）；wild sea cucumber specimens from the Qingdao coast（QW）were used as controls.The RSGs（Specific Growth Rate）of all the strains，including the control，QW，decreased significantly under the stress of low salinity conditions.Only the QQ-F1 strain showed positive RSGat salinity 17.The LS50-30d of QQ-F1 was significantly lower than that of the other strains（RC-F2，KC-F3，DC-F2，QQ-F1，and QW were 15.02，15.19，16.48，14.26，and 15.13，respectively）.At salinity 14，the ST50of QQ-F1 was significantly longer than that of the other strains（RC-F2，KC-F3，DC-F2，QQ-F1，and QW were 19.84d，18.43d，10.11d，23.54d，and 19.01d，respectively）.Although the enzyme activities of AKP，ACP，SOD，and LZM were decreased in all 5 species under low salinity conditions（salinity＜18），the QQ-F1 strain maintained a comparatively higher enzyme activity level and showed higher overall tolerance to the stress of low salinity.Based on the growth，survival，and non-specific immune enzyme activities，the tolerance to low salinity of the 5 populations was ordered as follows：QQ-F1＞RC-F2＞QW＞KC-F3＞DC-F2.The high tolerance of QQ-F1 for low salinity suggest that it would be a good candidate for popularization of low salinity sea areas or unstable salinity coastal areas.These results could be helpful for healthy farming and breeding of sea cucumbers，as well as for evaluations of their character.

A

1000-3096（2016）05-0019-10

2015-12-12；

2016-01-11

國家十二五“863”項(xiàng)目 （2012AA10A412-4）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31202016）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大項(xiàng)目“速生抗病耐高溫刺參良種選育”；國家948項(xiàng)目（2014-Z13）；山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)（2013ZHZX2A0801）

［Foundation：NationalHigh Technology Research andDevelopment Program，China，No.2012AA10A412-4；National Natural Science Foundation of China，No.31202016；Agriculture Seed Improvement ProjectofShandongProvince；Program forinternationaladvanced agricultural science and technology introduction，No.2014-Z13；Special Research Funds for Independent Innovation and Scientific &Technology Achievements Transformation Of Shandong Province，No.2013ZHZX2A0801］

侯西坦（1990-），男，山東鄒城人，碩士研究生，研究方向：海參良種選育，電話：0532-85817991，E-mail：houxitan@126.com；王印庚，通信作者，研究員，電話：0532-85841732，E-mail：wangyg@ysfri.ac.cn