張曉暉，蘇思思，王文雅，袁其朋，李　強

（1北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029；2清華大學化學工程系，北京 100084）

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性激素三孢酸在類胡蘿卜素生產菌三孢布拉氏霉中的合成代謝研究進展

張曉暉1，蘇思思1，王文雅1，袁其朋1，李強2

（1北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029；2清華大學化學工程系，北京 100084）

類胡蘿卜素是重要的精細化學品，三孢布拉氏霉是發(fā)酵法生產類胡蘿卜素的常用菌種。近年來研究者對影響三孢布拉氏霉類胡蘿卜素產量的影響因素做了大量的研究，結果顯示三孢酸是最重要的影響因子之一。本文根據(jù)國內外研究進展，從發(fā)酵法生產類胡蘿卜素的研究現(xiàn)狀、三孢酸類化合物的結構及其生理功能、三孢酸合成途徑研究及三孢酸合成途徑中的分子機制等幾個方面做了綜述報告。

三孢酸；三孢布拉氏霉；類胡蘿卜素；毛霉目真菌；β-胡蘿卜素

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151591

三孢酸是1，1，3-三甲基-2-（3-甲基辛基）環(huán)己烷的不飽和氧化衍生物，是二萜類或類胡蘿卜素降解時產生的倍半萜類物質，為三孢布拉氏霉、布拉克須霉（Phycomyces blakesleanus）和高大毛霉（Mucor mucedo）等毛霉目真菌的性激素［4］，具有誘導菌體分化、刺激孢子形成及調控類胡蘿卜素合成等生理功能［5］。三孢布拉氏霉產三孢酸的能力遠大于其他毛霉目真菌，因此成為研究三孢酸代謝的模式菌株。在發(fā)酵開始或中途加入純化或未純化的外源性三孢酸，可以顯著提高類胡蘿卜素產量［6］，作為一種發(fā)酵促進劑，三孢酸分離提取和生物合成的研究引起了廣泛關注［7］。三孢酸的生物合成是一個十分復雜的過程，涉及到多種代謝產物并且伴隨有菌體生理和形態(tài)上的變化，其代謝途徑的探明對提高類胡蘿卜素產量有重要意義。目前三孢酸代謝途徑的研究主要集中在國外，國內對這一領域的研究報道相對較少，本文總結分析了近幾年的相關研究，著重報道了三孢酸代謝途徑的最新研究進展。

1　三孢布拉氏霉發(fā)酵產類胡蘿卜素的研究概況

1.1產類胡蘿卜素的微生物種類

微生物發(fā)酵法是生產天然類胡蘿卜素的發(fā)展方向，目前在這方面研究最多的色素有β-胡蘿卜素（β-carotene）、番茄紅素（lycopene）和蝦青素（astaxanthin）等?？衫玫奈⑸锓N類包括細菌、藻類、真菌和酵母菌，其中真菌的生產代表菌種是三孢布拉氏霉［8］和布拉克須霉［9］，細菌有紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）［10］，酵母有深紅酵母（Rhodotorula glutinis）［11］，微藻類有杜氏藻類（Dunaliella）［12］。近年來，隨著生物技術的發(fā)展，一些本身不產色素的微生物，如大腸桿菌（Escherichia coli）［13］和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）［14］等，通過基因工程改造后也可用于生產類胡蘿卜素。關于產類胡蘿卜素的微生物種類及相關色素產量的研究，Chandi等［8］和Barredo［15］的綜述中已做了較為詳細的歸納和總結，本文不再詳述。

用于生產類胡蘿卜素的4類微生物（細菌、藻類、真菌和酵母菌）在生產中各有利弊，如在工業(yè)生產中的提取色素階段，酵母菌破壁難度要大于其他3種微生物［16］；而杜氏藻類的發(fā)酵時間偏長（10 d以上）且在發(fā)酵過程中需要嚴格控制鹽度和光照兩個條件［12］；利用細菌生產類胡蘿卜素需要解決遺傳穩(wěn)定性的問題；而三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵過程相對復雜，需要（+）/（-）菌分別培養(yǎng)然后再混合色素才可以大量積累，但是三孢布拉氏霉具有生長迅速、生物量大、類胡蘿卜素產量高（4～5 g·L-1）等明顯優(yōu)勢［8］，因而可以作為工業(yè)菌種且已應用于類胡蘿卜素的規(guī)?；I(yè)生產中。

1.2影響三孢布拉氏霉類胡蘿卜素產量的因素

圖1　三孢酸對類胡蘿卜素和麥角固醇合成的調控Fig.1　Scheme of regulation of carotenoid and ergosterol synthesis

三孢布拉氏霉是工業(yè)上生產類胡蘿卜素的主要菌種，自1960年以來，研究者陸續(xù)對影響三孢布拉氏霉類胡蘿卜素產量的因素開展了廣泛研究，在Lampila等［17］和Bhosale［18］的綜述中已對這些因素做了較為詳細的總結。雖然影響三孢布拉氏霉類胡蘿卜素產量的因素眾多，但最終可歸納為兩大類：環(huán)境因素（包括光照、氧氣、pH、溫度等）和添加物（包括金屬鹽、三羧酸循環(huán)中間產物、抗氧化劑、氧載體、表面活性劑和性激素三孢酸等）［18-23］。研究和實踐表明，在優(yōu)化好的培養(yǎng)基中添加一些化合物對于促進發(fā)酵和提高目標產物產量具有事半功倍的效果。迄今研究者還在不斷探索和合成新的化合添加物，且發(fā)現(xiàn)在眾多化合物中，三孢酸對類胡蘿卜素產量影響最大（可使類胡蘿卜產量增加349%）［19］。目前對三孢酸能大幅刺激類胡蘿卜素合成的詳細機制尚不十分清楚，Thomas等［24］的研究表明三孢酸可能是通過影響類胡蘿卜素代謝途徑中的一個或幾個酶的合成來發(fā)揮作用。Sun等［25-27］利用代謝組、蛋白組和實時定量PCR等技術，綜合分析了三孢酸對三孢布拉氏霉菌轉錄、翻譯和代謝網絡的影響，發(fā)現(xiàn)三孢酸對于霉菌的影響是全面的（對糖酵解、三羧酸循環(huán)支路、脂肪酸合成等多種代謝途徑均有影響），而非只影響類胡蘿卜素合成代謝；在類胡蘿卜素合成途徑中，三孢酸對hmgR的轉錄基本沒有影響，卻增強了ipi、carG、carRA和carB的轉錄（增強9～33 倍），而isoA和erg9轉錄水平的變化依賴于三孢酸的添加量（圖1），這些結果表明三孢酸可能是通過刺激相關酶基因的轉錄來調控三孢布拉氏霉類胡蘿卜素的合成。

2　三孢酸類化合物（trisporoid）的結構及其功能

β-胡蘿卜素裂解產生3個片段化合物：C18、C15和C7化合物［參見圖4（a）］，其中三孢酸類化合物（trisporoid）屬于C18家族，含有18～19個碳原子，包括一個14個碳原子的主碳鏈［28］。三孢酸及其代謝途徑中的所有中間產物總稱為三孢酸類化合物，從分子結構來看，三孢酸類化合物中包含有醇類、酮類、酸類及酯類等物質，目前能夠分離得到的主要有三孢酮（trisporin）、三孢醇（trisporol）、三孢醇甲酯（methyltrisporate）、三孢酸（trisporic acid）、4-二氫三孢醇甲酯（4-dihydromethyltrisporate）和4-二氫三孢酸（4-dihydrotrisporic acid）等，其中4-二氫三孢酸是一個新分離到的物質，該物質的來源、代謝流向及生理作用均未有研究。這些物質結構相似，遵循圖2中的結構通式，當C1、C4位置上的取代基（分別為X1和X4）不同時，物質的種類不同，具體見表1［29］。后來發(fā)現(xiàn)，每種物質又有多種衍生物，基于目前分離得到的三孢酸類化合物的分子結構，研究者認為衍生物可分為A、B、C、D、E 5種，目前分離得到的三孢酮的衍生物有B、C兩種，三孢醇的有B、C兩種，4-二氫三孢醇甲酯的也有B、C兩種，三孢醇甲酯的有B、C、E 3種，三孢酸的有A、B、C、D、E 5種，而4-二氫三孢酸只分離到B型衍生物［30-32］。衍生物屬于哪種類型由C2、C3和C13位置上的官能團（Y1、Y2和Y3）決定，具體見表2。

表1　R三孢酸類化合物的結構Table 1 Trisporoid structure

圖2　三孢酸類化合物的結構通式Fig.2　General structure of trisporoid

表2　R三孢酸類化合物的衍生物的結構Table 2　Structure of trisporoid derivatives

雖然三孢酸類化合物的結構相似，但功能卻不盡相同，生理活性也大小不一。Schachtschabel等［30］研究發(fā)現(xiàn)，三孢酸B、C能夠誘導高大毛霉（+）/（-）菌產生孢子，三孢醇甲酯和4-二氫三孢醇甲酯只對（-）菌有活性，而三孢酮B、C只對高大毛霉（+）菌起作用。Yamuna等［31］研究了三孢酸類化合物對β-胡蘿卜素合成的影響，結果顯示影響的大小隨著真菌種屬、生長階段的不同而不同，且（-）菌對于三孢酸類化合物的刺激比（+）菌敏感；同時在其研究中還發(fā)現(xiàn)，三孢酸B是高大毛霉類胡蘿卜素合成的最佳刺激劑，而對三孢布拉氏霉來說最佳刺激劑為4-二氫三孢酮C；三孢酮B、三孢酮C和D'orenone對高大毛霉及三孢布拉氏霉β-胡蘿卜素的合成的影響都很??；4-二氫三孢酮C和4-二氫三孢醇甲酯C只對三孢布拉氏霉（-）菌類胡蘿卜素的合成有刺激效果，而三孢酸C、三孢醇甲酯B對高大毛霉（-）菌的刺激效果比較大。細胞中三孢酸類化合物的各種衍生物的含量會隨著生理狀態(tài)、環(huán)境條件的改變而發(fā)生變化，但有一個大致的變化范圍，例如在三孢布拉氏霉中C、B、A 3種類型的衍生物含量變化范圍分別為55%～87%、12%～39%和16%左右，在真菌中D、E型衍生物的含量通常很少［32］。此外各種衍生物的生理活性大小也不同，一般認為B類衍生物的活性要大于C類衍生物的活性，C類的活性又比A類的大，D、E的活性相對來說最小，這可能與它們在體內的含量多少有一定關系。

3　三孢酸的合成代謝途徑

三孢酸首次引起關注是作為一個代謝中間產物，可以極大刺激類胡蘿卜素的合成，隨后Gooday等［5］發(fā)現(xiàn)三孢酸還可以作為性激素誘導孢子形成。由于三孢酸的重要生理作用，研究者對三孢酸的代謝途徑進行了長時間的研究，其研究進程大致可以分成兩個階段，第1個階段（1964～2000年）主要探究了三孢酸的合成機制［（+）/（-）菌協(xié)作合成機制］及提出了一個代謝途徑框架（圖3）；第2個階段（2000年至今）主要是對前一時期提出的代謝框架做了修正和補充（圖4），增補了一些新的三孢酸代謝中間產物，如β-apo-12′-carotenal和D'orenone等。

3.1三孢酸的發(fā)現(xiàn)及其代謝途徑的初步研究

1964年，Prieto等［33］在三孢布拉氏霉的混合培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了一系列能夠刺激β-胡蘿卜素合成的酸性化合物，稱作β-因子，后來命名為三孢酸。在隨后的1～2年相繼在其他真菌如布拉克須霉、高大毛霉等的混合培養(yǎng)基中也分離得到該物質［34］。三孢酸只有在（+）/（-）菌混合培養(yǎng)時才可以大量合成，單獨培養(yǎng)的（+）/（-）菌幾乎不合成三孢酸，因為三孢酸的合成需要（+）/（-）菌協(xié)作完成。之所以存在這種機制，是因為三孢酸合成途徑中的一些酶是（+）菌或者（-）菌所特有的，因而（+）/（-）菌會各自合成一些特有的前體物質，然后通過物質擴散作用，使得這些特異性前體物在（+）/（-）菌之間得以交換，最終完成三孢酸的合成。

圖3　早期的三孢酸合成途徑Fig.3　TSA cooperative biosynthetic pathway at early stage

此外，這一時期另一個較大的研究成果就是三孢酸初始前體物質的確定。研究表明三孢酸合成的初始前體物質是β-胡蘿卜素，主要有以下3方面證據(jù)：第一，放射性同位素（14C）標記實驗顯示，三孢酸主要來源于β-胡蘿卜素；第二，β-胡蘿卜素合成的營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成三孢酸；第三，混合培養(yǎng)基中添加二苯胺（可以阻斷β-胡蘿卜素的合成）后，三孢布拉氏霉菌中的三孢酸合成受阻［34］。在證實β-胡蘿卜素為三孢酸合成的初始前體物質后，關于β-胡蘿卜素的裂解方式也進行了大量研究。這一時期一直認為β-胡蘿卜素是在C15-C15′處對稱裂解，生成視黃醛（C20-retinal），視黃醛進一步反應生成β-C18-ketone（圖3），而后證實這一推測有誤［35］。

圖4　改進后的三孢酸合成代謝途徑Fig.4　Modified cooperative biosynthetic pathway of TSANote： Cooperative biosynthetic pathway illustrates the production of trisporoids. Metabolic pathway in Fig.4（a） could occur in both （+） and （-） mating types while pathway in Fig.4（b） could reflect cooperative biosynthesis which need （+）/（-） mating types exchange intermediate metabolite. Dashed arrows in Fig.4 represent reactions that have not been studied clearly； ①②③④⑤⑥ represent reactions of enzymatic catalysis.

由于只有在（+）/（-）菌混合培養(yǎng)時才可以合成大量的三孢酸，而單獨培養(yǎng)的（+）菌或者（-）菌是否也可以合成三孢酸最初研究者不是很清楚。直到1973年，Sutter等［36］證實在無任何（-）菌因素的刺激下，單獨培養(yǎng)的（+）菌也可以合成0.1%（指占三孢布拉氏霉（+）/（-）菌混合培養(yǎng)5 d后產生的三孢酸的百分比）的三孢酸，而單獨培養(yǎng)的（-）菌幾乎不合成三孢酸（＜ 0.0001%）。但是相對（+）菌，（-）菌對三孢酸的刺激更加敏感，添加三孢酸后（-）菌類胡蘿卜素的產量是（+）菌的6倍；此外還發(fā)現(xiàn)在（+）/（-）菌混合培養(yǎng)時，如果（-）菌的接種量大，相應的類胡蘿卜素產量也高，具體原因尚未研究清楚，可能是因為（-）菌中一些相關的酶的活性更高［3］。

在這一時期，Sutter等［3，34，36］、Austin等［4］對三孢酸代謝途徑及其中間產物做了大量的研究，認為三孢酸按照圖3的路線合成，包含以下要點：① 三孢酸合成代謝途徑的初始物質為β-胡蘿卜素，其在C15-C15'處對稱裂解生成視黃醛；② 在三孢酸代謝途徑中，（+）菌和（-）菌體內都能合成的最后一個物質是4-二氫三孢酮；③ 4-二氫三孢酮下游代謝的進行需要（+）/（-）菌彼此交換特定的中間產物（如三孢酮、4-二氫三孢醇甲酯等），通過（+）/（-）菌協(xié)作完成三孢酸的合成。4-二氫三孢醇甲酯只能在（+）菌體內合成，三孢酮只能在（-）菌體內合成。（+）菌合成的4-二氫三孢醇甲酯需擴散到（-）菌體內進而轉化成三孢醇甲酯，而（+）菌合成三孢醇的前體是來源于（-）菌的三孢酮［37-38］。

3.2三孢酸代謝途徑的完善和發(fā)展

前期的研究給出了三孢酸合成代謝途徑的基本框架（圖3），但是代謝途徑中的一些細節(jié)問題尚未研究清楚，例如β-胡蘿卜素的裂解方式、分離得到的部分化合物在代謝途徑中的具體定位等。2000年后，研究者利用同位素標記法、質譜分析法等對三孢酸合成代謝的細節(jié)進行了深入研究，補充和完善了已有的合成代謝框架，改進后的合成路線見圖4。

2002年，Gessler等［39］通過向β-胡蘿卜素的乳濁液（向溶解有β-胡蘿卜素的己烷液中滴加Tween-20制得）中添加破碎菌體提取物（從混合培養(yǎng)的三孢布拉氏霉菌菌絲中分離得到），32℃下反應4 h后，對該反應液進行色譜和質譜分析，得到兩種β-胡蘿卜素代謝產物，分別是異隱黃素（isocryptoxanthine）和D'orenone（圖4）。當以視黃醛代替β-胡蘿卜素為底物進行該實驗時，不能得到相關產物，這表明視黃醛很可能不是三孢酸代謝途徑的中間產物。將β-胡蘿卜素置于可產生超氧陰離子自由基的黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)中進行反應，經質譜分析發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素更傾向于在分子式的一側斷鍵而非以往認為的對稱裂解，這進一步證明了視黃醛未參與三孢酸代謝。此外，Gessler認為β-胡蘿卜素有兩種裂解途徑（圖4）：（1）β-胡蘿卜素的C4位羥基化形成異隱黃素，異隱黃素進一步不對稱裂解生成三孢酸的前體；（2）另一種裂解途徑為β-胡蘿卜素先裂解生成D'orenone，D'orenone進一步裂解而進入三孢酸代謝途徑，后來發(fā)現(xiàn)在D'orenone之前還存在中間物質β-apo-12′-carotenal。實驗數(shù)據(jù)顯示在菌體內主要進行的是β-胡蘿卜素的氧化裂解反應（生成D'orenone的反應），羥基化反應（形成異隱黃素的反應）速率很?。?9］。在后來的研究中，相繼在（+）/（-）菌混合培養(yǎng)基中分離得到C18、C15和C7片段化合物［圖4（a）］，因此推測β-胡蘿卜素的斷鍵位置可能在C13-C14和C11′-C12′處，其中三孢酸及其合成中間代謝產物全部來源于C18化合物，目前有關C15和C7化合物的生理作用尚不清楚。

2008年，Doreen等［29］用同位素標記法，對三孢酸的合成途徑進行了系統(tǒng)的分析，首次證明D'orenone是三孢酸合成的前體物質。Doreen等使用重氫標記三孢酸的前體并分別加入到單獨和混合培養(yǎng)的三孢布拉氏霉（+）/（-）菌培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)3、6、9、12、24、48 h后，對培養(yǎng)基中的代謝物成分及結構變化進行分析研究。依據(jù)實驗結果，Doreen對原有的三孢酸合成途徑做了以下幾方面的修正（圖4）：（1）β-胡蘿卜素裂解后的第一個產物是D'orenone而非視黃醛，而后Yamuna等［31］證明第一個產物是β-apo-12'-carotenal；（2）（+）/（-）菌都能合成的最后一個三孢酸的前體是三孢醇，而非4-二氫三孢酮；（3）三孢醇氧化成三孢醇甲酯的反應只能在（+）菌體內進行，而三孢醇甲酯皂化生成三孢酸的反應在（+）/（-）菌體內都可進行，只是二者的反應速率不同，（-）菌中的反應速率顯著高于（+）菌；（4）在（+）/（-）菌的混合培養(yǎng)基內沒有發(fā)現(xiàn)被重氫標記的4-二氫三孢醇甲酯，因此推測該物質可能沒有參與三孢酸的合成代謝；（5）三孢醇甲酯生成三孢酸的反應不可逆；（6）對三孢酮生成三孢醇、三孢醇甲酯生成三孢酸的反應動力學的研究表明，（-）菌中這兩步反應的反應速率要明顯高于（+）菌。

Yamuna等［31］在高產β-胡蘿卜素的大腸桿菌中導入類胡蘿卜素氧化酶基因，研究β-胡蘿卜素在氧化酶作用下的裂解機制，通過分析大腸桿菌細胞提取物的成分，他們發(fā)現(xiàn)了新物質β-apo-12′-carotenal（C25）并證明其為β-胡蘿卜素裂解的第一個產物；隨后，β-apo-12′-carotenal在C13-C14位置斷鍵，生成D'orenone和一個C7化合物［圖4（a）］。目前，對D'orenone生成下一物質的反應機制還不了解，推測有兩種可能［圖4（a）反應③］：C11-C12位的雙鍵打開，D'orenone生成另一種酮（ketone）；或者碳環(huán)C4位羥基化形成4-hydroxy-β-C18-ketone，進而轉化成4-二氫三孢酮［29，40］。

盡管，Gessler等［39］、Doreen等［29］、Yamuna等［31］的研究豐富和發(fā)展了三孢酸的合成代謝途徑，但是仍有許多問題沒有解決，如4-二氫三孢醇甲酯的來源問題尚不清楚。開始研究者認為4-二氫三孢醇甲酯是（+）菌的一個特異性產物，來源于4-二氫三孢酮（圖3）［38］。然而在Doreen的研究中發(fā)現(xiàn)，當向培養(yǎng)基中添加重氫標記的三孢酸前體時，代謝產物4-二氫三孢醇甲酯中并不含有放射性標記，此外還發(fā)現(xiàn)4-二氫三孢醇甲酯生成三孢酸的速率非常低，這些現(xiàn)象均表明4-二氫三孢醇甲酯幾乎不參與三孢酸的合成且可能不是β-胡蘿卜素的裂解產物［29］。4-二氫三孢醇甲酯可能由β-胡蘿卜素的氧化衍生物異隱黃素降解而來［圖4（b）］，β-胡蘿卜素的非酶催化氧化裂解結果以及超氧陰離子降低β-胡蘿卜素氧化酶活性的事實均為以上猜想提供了證據(jù)。因此，4-二氫三孢醇甲酯在三孢酸合成中到底起什么作用還需要進一步的探究。

4　三孢酸生物合成途徑中相關基因的克隆及其分子調控機制研究進展

近年來，隨著研究的深入三孢酸合成代謝途徑得到不斷的豐富和完善，但是對該過程的分子調控機制的研究卻相對滯后，只對三孢酸合成途徑中少數(shù)幾個酶的基因進行了克隆和功能探索。毛霉目真菌具有相似的三孢酸合成途徑，除三孢布拉氏霉外，目前對米根霉（Rhizopus oryzae）、高大毛霉和布拉克須霉中三孢酸的合成也有研究，發(fā)現(xiàn)相關酶的功能十分相似。目前，克隆得到的酶基因有β-胡蘿卜素氧化酶（β-carotene oxygenase）基因tsp3/tsp4、4-二氫三孢酮脫氫酶（4-dihydrotrisporin dehydrogenase）基因tsp2、4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶（4-dihydromethyltrisporate dehydrogenase）基因tsp1和AcaA酶基因acaA等，這些酶的基因及功能參見圖4（a）和表3。

β-胡蘿卜素氧化酶是一個保守酶，其功能在物種間的差異很小，催化β-胡蘿卜素在C11'-C12'處斷鍵，生成C25和C15兩個片段化合物，其中C25化合物（β-apo-12′-carotenal）進入三孢酸合成途徑［圖4（a）］。最早發(fā)現(xiàn)的β-胡蘿卜素氧化酶來自三孢布拉氏霉菌，被命名為TSP3，但是發(fā)現(xiàn)存在多種β-胡蘿卜素氧化產物，因此推測應該有多種β-胡蘿卜素氧化酶存在［31］。米根霉中β-胡蘿卜素氧化酶TSP4的發(fā)現(xiàn)，更確認了這種推測［41］。目前對這兩種酶的結構、活性、底物特異性以及催化產物的了解還很少，但是對其編碼基因tsp3和tsp4的轉錄及調控有一些研究。Anke等［41］的研究顯示，三孢布拉氏霉在三孢酸誘導的最初1 h內，tsp3表達量迅速增加，比對照高出500倍，但1 h后，tsp3基因表達量開始逐漸減少，最終只保持一個低水平的表達。這說明三孢酸的合成過程存在反饋調節(jié)機制，初期表現(xiàn)為正向反饋調節(jié)，后期則為負反饋調節(jié)，目前尚無參與這些過程的調控因子的報道。Sun等［26］研究發(fā)現(xiàn)，當向三孢布拉氏霉（+）/（-）菌混合培養(yǎng)基中添加三孢酸時，tsp4的轉錄水平幾乎不發(fā)生改變，而tsp3的轉錄水平明顯上升；因此，推測TSP3的作用主要是催化三孢酸前體物質的形成，觸發(fā)三孢酸合成過程；TSP4主要是在（+）/（-）菌接合的早期發(fā)揮作用，可能參與了（+）/（-）菌菌絲的相互識別。

AcaA也是一個氧化酶，催化三孢酸生物合成的第2步反應，使得C25化合物在C13-C14位置斷鍵，生成D'orenone［圖4（a）］。Humberto等［40］發(fā)現(xiàn)須霉屬真菌的79747、77754、64508、76627和58172等5個基因可能是與類胡蘿卜素氧化裂解相關的基因，并證明在須霉屬真菌中79747號基因編碼β-胡蘿卜素氧化酶，且將其命名為carS；carS是與三孢布拉氏霉tsp3同源的基因，二者基因功能相似（翻譯產物都是β-胡蘿卜素氧化酶），只是在不同真菌種屬中的命名不同而已；77754號基因的編碼產物也是一個氧化酶，在β-胡蘿卜素氧化酶之后發(fā)揮作用，被稱作acaA。將含carS和acaA基因的載體分別導入產β-胡蘿卜素的大腸桿菌中來表達CarS和AcaA，發(fā)現(xiàn)只有CarS有活性，而AcaA完全沒有活性；但將carS和acaA先后放在一個操縱子中且由同一個啟動子調控時，發(fā)現(xiàn)不僅CarS有活性，AcaA也有活性，由此推測AcaA在CarS之后發(fā)揮活性，因此acaA是三孢酸合成代謝途徑中的第2個活性基因。分離純化的酶蛋白AcaA可使類胡蘿卜素裂解產物C25、C27及C30等化合物進一步降解，但不能降解C20和C22兩個片段化合物，說明C25化合物是AcaA最短的環(huán)化底物；同時AcaA不能降解β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素及蝦青素，這進一步證明了AcaA是三孢酸代謝途徑中的第二個酶。運用實時熒光定量PCR研究發(fā)現(xiàn)acaA的轉錄不受（+）/（-）菌混合培養(yǎng)的影響，目前關于AcaA的結構及調控方式均未有太多的研究報道［31］。

表3　R三孢酸代謝途徑中的酶Table 3　Enzymes in pathway of TSA biosynthesis

4-二氫三孢酮脫氫酶由基因tsp2編碼，分子雜交結果顯示，tsp2是一個單拷貝基因。4-二氫三孢酮脫氫酶是一個短鏈酶，含有一個NADP+輔因子，催化4-二氫三孢酮C4位的羥基氧化生成三孢酮，在（-）菌體內具有較高的活性。Northern雜交分析顯示，tsp2在高大毛霉（+）菌的所有生長階段都有轉錄，但是在高大毛霉（-）菌中，在生長后期才開始轉錄。三孢酸的刺激會增加高大毛霉（-）菌4-二氫三孢酮脫氫酶的活性，但是tsp2的轉錄水平沒有發(fā)生變化，由此說明4-二氫三孢酮脫氫酶酶活性的調控方式是翻譯后修飾，而非通過調控相應基因的轉錄來調節(jié)酶活性。研究推測4-二氫三孢酮脫氫酶除了在三孢酸代謝中起催化氧化作用外，還有可能在（+）/（-）菌混合培養(yǎng)初期起識別彼此的作用［42-44］。

依賴NADP+的4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶是一個醛酮類還原酶，可以催化4-二氫三孢醇甲酯生成三孢醇甲酯。4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶的編碼基因為tsp1，目前已經克隆并表征了高大毛霉、灰綠犁頭霉（Absidia glauca）和三孢布拉氏霉（+）/（-）菌的tsp1基因，后來在布拉克須霉和雅致枝霉（Thamnidium elegans）中也相繼發(fā)現(xiàn)了該基因的存在［45］。高大毛霉（-）菌中的tsp1基因的編碼區(qū)長度為2406～3445，內含子的起始位置為2746，堿基數(shù)量為74bp；（+）菌的tsp1基因除了131和639位的胸腺嘧啶變?yōu)榘奏ぁ?46位胞嘧啶變成胸腺嘧啶外，其余部分與（-）菌的tsp1基因序列高度一致，（+）/（-）菌的tsp1基因表達產物的一級結構完全相同。tsp1的轉錄和翻譯均不受三孢酸的影響，但是三孢酸對4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶的活性影響較大，在沒有三孢酸刺激的情況下，高大毛霉（+）/（-）菌中的4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶幾乎沒有活性；其中（-）菌在添加三孢酸初期，4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶仍幾乎無活性，80 min后才開始表現(xiàn)出高的活性，這一現(xiàn)象說明4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶活性受到一些未知機制的調控［42，45］。

4-二氫三孢酮脫氫酶和4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶都是依賴NADP+的脫氫酶，但它們的一級結構和空間構象有很大差異，二者的底物特異性都很低；4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶含有一個TIM-桶裝結構（TIM-barrel），4-二氫三孢酮脫氫酶含有一個羅斯曼折疊結構（Rossman fold）；二者的相同之處是活性中心均含有酪氨酸和賴氨酸殘基［42］。

在毛霉目真菌中，除了三孢酸合成途徑中的基因外，一些與三孢酸合成及調控相關的基因也被分離出來，如性別決定基因（sexM/sexP）［46］、光誘導基因（crgA）［47］及尿嘧啶合成酶基因（pyrG）［48］等，這些基因對進一步了解三孢酸合成代謝的分子機制有重要意義。其中性別決定基因sexM/sexP與三孢酸合成的調控有密切聯(lián)系，sexM/sexP控制著毛霉目真菌的有性生殖，該基因含有一段編碼HMG-轉錄因子的DNA序列，序列右側為一個RNA解旋酶基因，左側為一個磷酸丙糖轉運蛋白基因［46］。該基因在（+）菌中被命名為sexP，在（-）菌中被命名為sexM，二者均為單拷貝基因。當布拉克須霉（+）/（-）菌混合培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)sexM/sexP的轉錄水平均大幅增加，推測可能是因為受到了三孢酸類化合物的刺激，但是具體作用機制還不清楚。對高大毛霉的研究發(fā)現(xiàn)，三孢酸類化合物對sexP的調控作用要比sexM小得多。目前已表征了高大毛霉中sexM/sexP的結構［49］，sexP和sexM的基因產物SexP和SexM的生理作用可能是誘導接合菌的性別分化。研究發(fā)現(xiàn)SexM蛋白一級結構的101～106（QQRRKY）位處是一段細胞核定位序列，這使得SexM蛋白不需要其他轉運系統(tǒng)就可以直接進入到細胞核中，但目前對于SexP在細胞中的定位還不了解。

5　存在問題與展望

發(fā)酵法生產類胡蘿卜素符合營養(yǎng)健康的消費理念，具有廣闊的商業(yè)前景。但目前在擴大生產上仍然面臨著諸多問題，其中最嚴峻的就是生產菌種產量低。近年來，通過培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化、發(fā)酵工程技術的運用，使菌種的產量有了極大的提高，但仍不能滿足工業(yè)化的需求。隨著生物技術的發(fā)展，基因工程越來越多地運用到了育種技術中，使得菌種得到進一步優(yōu)化。三孢布拉氏霉菌具有生長迅速、生物量大、類胡蘿卜素產量高（4～5 g·L-1）等明顯優(yōu)勢，成為進入規(guī)模化工業(yè)生產類胡蘿卜素的主要微生物；但由于三孢布拉氏霉菌類胡蘿卜素合成途徑復雜、遺傳轉化困難，目前對其基因功能、代謝調控、遺傳轉化方法的研究還較少，有待于深入研究。

三孢酸是影響三孢布拉氏霉類胡蘿卜素產量的一個重要影響因素，其生物合成途徑還有許多待完善的地方，如代謝途徑中的許多基因還沒有找到、一些中間代謝物質還沒有被發(fā)現(xiàn)、一些酶的性質和結構還有待深入研究。迄今，三孢酸代謝途徑中僅僅鑒定出了4種酶，這主要是由于絲狀真菌的基因組結構較為復雜，利用傳統(tǒng)技術克隆基因步驟煩瑣、工作強度大、存在一定的技術難度。隨著全基因組測序技術的快速發(fā)展，依據(jù)全基因組的序列信息克隆基因大大降低了基因克隆的難度和工作量。近期，美國JGI（Jointed Genome Institute）公布了布拉克須霉全基因組的序列分析結果［50］，利用布拉克須霉的基因組數(shù)據(jù)可以對比克隆三孢布拉氏霉菌中的同源基因，布拉克須霉的全基因組序列分析信息為三孢布拉氏霉菌中三孢酸合成代謝及其調控機制的研究提供了有利條件。

三孢酸合成代謝的研究有利于更好地調控三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵，從而提高目標產物的產量。此外三孢酸調控類胡蘿卜素合成機制的闡明，對提高微生物發(fā)酵生產類胡蘿卜素及其他萜烯類化合物的產量有重要意義。但是目前關于三孢酸對類胡蘿卜素合成的具體調控機理尚不清楚，Sun等［25-27］認為三孢酸是通過刺激類胡蘿卜素合成途徑中相關酶基因的轉錄來調控類胡蘿卜素的合成；Thomas等［24］認為三孢酸是通過影響類胡蘿卜素代謝途徑中的相關酶的合成來發(fā)揮調控作用，但具體作用位點是哪幾個酶還未研究清楚。

References

［1］ BERNARDO D R， DANIEL W B， MARIA A Z C. Technological aspects of β-carotene production ［J］. Food and Bioprocess Technology， 2011， 4： 693-701.

［2］ KAMLA M， JAYANTI T， SNEH G. Microbial pigments： a review ［J］. International Journal of Microbial Resource Technology， 2012， 1（4）：361-366.

［3］ SUTTER R P， RAFELSON M E. Separation of β-factor synthesis from stimulated β-carotene synthesis in mated cultures of Blakeslea trispora ［J］. Journal of Bacteriology， 1968， 95（2）： 426-432.

［4］ AUSTIN D G， BU'LOCK J D， WINSTANLEY D J. Trisporic acid biosynthesis and carotenogenesis in Blakesleea trispora ［J］. Biochemical Journal， 1969， 113（3）： 34.

［5］ GOODAY G W， CARLILE M J. The discovery of fungal sex hormones（Ⅲ）： Trisporic acid and its precursors ［J］. Mycologist， 1997，11（3）： 126-130.

［6］ 徐軍偉， 徐芳， 袁其朋. 三孢酸結構類似物對發(fā)酵生產番茄紅素的影響 ［J］. 北京化工大學學報， 2007， 34（2）：134-137. XU J W， XU F， YUAN Q P. Effect of abscisic acid related compounds on lycopene production by Blakeslea trispora ［J］. Journal of Beijing University of Chemical Technology， 2007， 34（2）： 134-137.

［7］ 師艷秋， 辛秀蘭， 袁其朋. 發(fā)酵促進劑在三孢布拉霉生產番茄紅素中的應用 ［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2012， 38（1）：133-136. SHI Y Q， XIN X L， YUAN Q P. The fermentation accelerant on lycopene production by Blakeslea trispora ［J］. Food and Fermentation Industries， 2012， 38（1）： 133-136.

［8］ CHANDI G K， GILL B S. Production and characterization of microbial carotenoids as an alternative to synthetic colors： a review［J］. International Journal of Food Properties， 2011， 14（3）： 503-513.

［9］ BINA J M， LUIS M S. New mutants of Phycomyces blakesleeanus for β-carotene production ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1997， 63（9）： 3657-3661.

［10］ WANG G S， HARTMUT G， KHALED A A， et al. High-level production of the industrial product lycopene by the photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2012， 78（20）： 7205-7215.

［11］ HERNáNDEZ-ALMANZA A， MONTA?EZ-SáENZ J， MARTíNEZáVILA C， et al. Carotenoid production by Rhodotorula glutinis YB-252 in solid-state fermentation ［J］. Food Bioscience， 2014， 7：31-36.

［12］ BEN-AMOTZ A. New mode of Dunaliella biotechnology： two-phase growth for β-carotene production ［J］. Journal of Applied Phycology，1995， 7（1）： 65-68.

［13］ SUN T， MIAO L T， LI Q Y， et al. Production of lycopene by metabolically-engineered Escherichia coli ［J］. Biotechnology Letters，2014， 36（7）： 1515-1522.

［14］ XIE W P， YE L D， LV X M， et al. Sequential control of biosynthetic pathways for balanced utilization of metabolic intermediates in Saccharomyces cerevisiae ［J］. Metabolic Engineering， 2015， 28： 8-18.

［15］ BARREDO J L. Microbial carotenoids from bacteria and microalgae［J］. Methods in Molecular Biology， 2012， 892： 133-141.

［16］ 張闖， 張玉蒼， 何連芳. 不同微生物生產類胡蘿卜素的研究現(xiàn)狀［J］. 食品研究與開發(fā)， 2011， 32（2）： 180-183. ZHANG C， ZHANG Y C， HE L F. Comparative study on microbial production of carotenoids ［J］. Food Research and Development， 2011，32（2）： 180-183.

［17］ LAMPILA L E， WALLEN S E， BULLERMAN L B. A review of factors affecting biosynthesis of carotenoids by the order Mucorales［J］. Mycopathologia， 1985， 90： 65-80.

［18］ BHOSALE P. Environmental and cultural stimulants in the production of carotenoids from microorganisms ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2004， 63（4）： 351-361.

［19］ SATYA D， MODI V V， JANI U K. Chemical regulators of carotenogenesis by Blakeslea trispora ［J］. Phytochemistry， 1980，19（5）： 795-798.

［20］ KONSTADINA N， TRIANTAFYLLOS R. Oxidative stress response and morphological change of Blakeslea trispora induced by butylated hydroxytoluene during carotene production ［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2010， 160： 2415-2423.

［21］ XU F， YUAN Q P， ZHU Y. Improved production of lycopene and β-carotene by Blakeslea trispora with oxygen-vectors ［J］. Process Biochemistry， 2007， 42： 289-293.

［22］ SEON-WON K， WEON-TAEK S， YOUNG-HOON P. Enhanced production of β-carotene from Blakeslea trispora with Span 20 ［J］. Biotechnology Letters， 1997， 19（6）： 561-562.

［23］ GOVIND N S， AMIN A R， MODI V V. Stimulation of carotenogenesis in Blakeslea trispora by cupric ions ［J］. Phytochemistry， 1982， 21（5）： 1043-1044.

［24］ THOMAS D M， HARRIS R C， KIRK J T O， et al. Studies on carotenogenesis in Blakeslea trispora （Ⅱ）： The mode of action oftrisporic acid ［J］. Phytochemistry， 1967， 6（3）： 361-366.

［25］ SUN J， LI H， YUAN Q P. Metabolic regulation of trisporic acid on Blakeslea trispora revealed by a GC-MS-based metabolomic approach ［J］. PLoS ONE， 2012， 7（9）： 443-452.

［26］ SUN J， LI H， SUN X X， et al. Trisporic acid stimulates gene transcription of terpenoid biosynthesis in Blakeslea trispora ［J］. Process Biochemistry， 2012， 47（12）： 1889-1893.

［27］ SUN J， SUN X X， TANG P W， et al. Molecular cloning and functional expression of two key carotene synthetic genes derived from Blakeslea trispora into E. coli for increased β-carotene production ［J］. Biotechnology Letters， 2012， 34（11）： 2077-2082.

［28］ BARRERO A F， MAR H M， PILAR A， et al. A minor dihydropyran apocarotenoid from mated cultures of Blakeslea trispora ［J］. Molecules， 2012， 17（11）：12553-12559.

［29］ DOREEN S， ANJA D， KLAUS-DIETER M， et al. Cooperative biosynthesis of trisporoids by the （+） and （-） mating types of the zygomycete Blakeslea trispora ［J］. ChemBioChem， 2008， 9（18）：3004-3012.

［30］ SCHACHTSCHABEL D， SCHIMEK C， W?STEMEYER J， et al. Biological activity of trisporoids and trisporoid analogues in Mucor mucedo （-） ［J］. Phytochemistry， 2005， 66（11）： 1358-1365.

［31］ YAMUNA S， KERSTIN K， WILHELM B， et al. Early and late trisporoids differentially regulate β-carotene production and gene transcript levels in the Mucoralean fungi Blakeslea trispora and Mucor mucedo ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2013，79（23）： 7466-7475.

［32］ VERESHCHAGINA O A， TERESHINA V M. Trisporoids and carotenogenesis in Blakeslea trispora ［J］. Microbiology， 2014， 83（5）：438-449.

［33］ PRIETO A， SPALLA C， BIANCHI M. Biosynthesis of β-carotene by strains of Choanephoraceae ［J］. Chemistry and Industry， 1964， 13：551-551.

［34］ SUTTER R P. Trisponic acid synthesis in Blakeslea trispora ［J］. Science， 1970， 168（3939）： 1590-1592.

［35］ BU'LOCK J D， JONES B E， TAYLOR D， et al. Sex hormones in Mucorales. The incorporation of C20and C18precursors into trisporic acids ［J］. Journal of General Microbiology， 1974， 80（1）： 301-306.

［36］ SUTTER R P， CAPAGE D A， HARRISON T L. Trisporic acid biosynthesis in separate plus and minus cultures of Blakeslea trispora：identification by Mucor assay of two mating-type-specific components ［J］. Journal of Bacteriology， 1973， 114（3）： 1074-1082.

［37］ BU'LOCK J D， JONES B E， WINSKILL N. The apocarotenoid system of sex hormones and prohormones in Mucorales ［J］. Pure and Applied Chemistry， 1976， 47： 191-202.

［38］ SCHACHTSCHABEL D， BOLAND W. Efficient generation of a trisporoid library by combination of synthesis and biotransformation［J］. The Journal of Organic Chemistry， 2007， 72（4）： 1366-1372.

［39］ GESSLER N N， SOKOLOV A V， BELOZERSKAYA T A. Initial stages of trisporic acid synthesis in Blakeslea trispora ［J］. Applied Biochemistry and Microbiology， 2002， 38（6）： 536-543.

［40］ HUMBERTO R M， CERDá-OLMEDO E， AL-BABILI S. Cleavage oxygenases for the biosynthesis of trisporoids and other apocarotenoids in Phycomyces ［J］. Molecular Microbiology， 2011， 82（1）： 199-208.

［41］ ANKE B， MAREIKE R， KORNELIA S， et al.Cleavage of β-carotene as the first step in sexual hormone synthesis in zygomycetes is mediated by a trisporic acid regulated β-carotene oxygenase ［J］. Fungal Genetics and Biology， 2007， 44： 1096-1108.

［42］ ELLENBERGER S， SCHUSTER S， W?STEMEYER J. Correlation between sequence， structure and function for trisporoid processing proteins in the model zygomycete Mucor mucedo ［J］. Journal of Theoretical Biology， 2013， 320： 66-75.

［43］ SCHIMEK C， W?STEMEYER J. Carotene derivatives in sexual communication of zygomycete fungi ［J］. Phytochemistry， 2009， 70：1867-1875.

［44］ JANA W， OLAF S， ANKE B， et al. 4-Dihydrotrisporindehydrogenase， an enzyme of the sex hormone pathway of Mucor mucedo： purification， cloning of the corresponding gene， and developmental expression ［J］. Eukaryotic Cell， 2009， 8（1）： 88-95.

［45］ CHRISTINE S， ANNETT P， KORNELIA S， et al. 4-Dihydromethyltrisporate dehydrogenase， an enzyme of sex hormone pathway in Mucor mucedo， is constitutively transcribed but its activity is differently regulated in （+） and （-） mating types ［J］. Fungal Genetics and Biology， 2005， 42： 804-812.

［46］ JANA W， ANKE B， MELANIE K， et al. The mating-related loci sexM and sexP of the zygomycetous fungus Mucor mucedo and their transcriptional regulation by trisporoid pheromones ［J］. Microbiology，2012， 158： 1016-1023.

［47］ QUILES-ROSILLO M D， RUIZ-VáZQUEZ R M， VICTORIANO G，et al. Light induction of the carotenoid biosynthesis pathway in Blakeslea trispora ［J］. Fungal Genetics and Biology， 2005， 42（2）：141-153.

［48］ QUILES-ROSILLO M D， RUIZ-VáZQUEZ R M， VICTORIANO G，et al. Cloning， characterization and heterologous expression of the Blakeslea trispora gene encoding orotidine-5′-monophosphate decarboxylase ［J］. FEMS Microbiology Letters， 2003， 222（2）： 229-236.

［49］ ALEXANDER I， FELICIA J W， ANNA F， et al. Identification of the sex genes in an early diverged fungus ［J］. Nature， 2008，451：193-196.

［50］ http：//genome.jgi.doe.gov/.

Advances in sexual hormone trisporic acid biosynthesis in carotenoids producing Blakeslea trispora

ZHANG Xiaohui1， SU Sisi1， WANG Wenya1， YUAN Qipeng1， LI Qiang2
（1College of Life Science and Technology， Beijing University of Chemical Technology， Beijing 100029， China；2Department of Chemical Engineering， Tsinghua University， Beijing 100084， China）

Given that carotenoids are important fine chemicals， the Blakeslea trispora is receiving increasing attention since its higher industrial production of carotenoids. Numerous factors could affect the carotenoids production in Blakeslea trispora， among which the trisporic acid is one of the uttermost importance. In the present paper， the advances of biosynthesis of trisporic acid were reviewed， including summary of carotenoids production by fermentation， structure and biological function of trisporoids， biosynthetic pathway of trisporic acid and molecular biology of trisporic acid biosynthesis.

trisporic acid； Blakeslea trispora； carotenoids； Mucorales fungi； β-carotene

引　言

類胡蘿卜素（carotenoids）是一種天然著色劑，具有增強免疫力、清除自由基、抗氧化等功能，被廣泛應用于食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)［1］。生產類胡蘿卜素的方法有化學合成法、分離提取法和微生物發(fā)酵法，隨著消費者對營養(yǎng)、天然產品的需求，微生物源類胡蘿卜素逐漸受到廣大消費者青睞［2］。自然界中，能合成類胡蘿卜素的微生物種類很多，目前國內外生產類胡蘿卜素最常用的菌種是三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）。三孢布拉氏霉屬于毛曲霉目、藻狀菌綱，是一種雌雄異體、具有（+）/（-）菌性別之分的絲狀真菌。單獨培養(yǎng)的三孢布拉氏霉（+）/（-）菌只能合成少量的類胡蘿卜素，混合培養(yǎng)時其類胡蘿卜素產量可提高10～15倍［3］，因為混合培養(yǎng)時可以生成一種促進類胡蘿卜素合成的刺激因子——三孢酸（trisporic acid，TSA）。

date： 2015-10-20.

WANG Wenya， wangwy@mail.buct.edu.cn；YUAN Qipeng， Yuanqp@mail.buct.edu.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China （21176018， 21576153） and the National High Technology Research and Development Program of China （2012AA02A701， 2015AA021001）.

Q 81

A

0438—1157（2016）05—1654—11

2015-10-20收到初稿，2015-12-13收到修改稿。

聯(lián)系人：王文雅，袁其朋。第一作者：張曉暉（1989—），女，碩士研究生。

國家自然科學基金項目（21176018，21576153）；國家高技術研究發(fā)展計劃項目（2012AA02A701，2015AA021001）。