李樂(lè)樂(lè) ，郭云龍 ，劉文龍 ，李　卓 ，王　洋 ，劉淑瑩,3*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)　吉林省人參科學(xué)研究院，吉林　長(zhǎng)春　130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)　附屬醫(yī)院，吉林　長(zhǎng)春　130021；3.中國(guó)科學(xué)院　長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林　長(zhǎng)春　130022)

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DART-Orbitrap質(zhì)譜法對(duì)黃芩藥材的快速分析

李樂(lè)樂(lè)1，郭云龍1，劉文龍1，李卓2，王洋1，劉淑瑩1,3*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130021；3.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林長(zhǎng)春130022)

將實(shí)時(shí)直接分析(DART)離子源與高分辨率質(zhì)譜Orbitrap聯(lián)用，建立了一種對(duì)黃芩藥材進(jìn)行快速定性定量分析的方法。定性分析時(shí)，對(duì)其中的化學(xué)成分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)和二級(jí)質(zhì)譜確證，同時(shí)參考相應(yīng)文獻(xiàn)進(jìn)行確認(rèn)。定量分析時(shí)，采用Full MS-SIM及Targeted-MS2掃描方式采集信號(hào)，Targeted-MS2掃描方式下分別對(duì)黃芩素和漢黃芩素的母離子和子離子的提取離子流圖積分，通過(guò)峰面積計(jì)算含量。在黃芩藥材中檢出黃芩素、漢黃芩素、韌黃芩素Ⅱ、二羥基-二甲氧基黃酮、5，7，2′，5′-四羥基-8，6′-二甲氧基黃酮和SkullcapflavonⅡ的[M+H]+峰。定量分析結(jié)果顯示，黃芩素(m/z271.06→ 123.01)的線性范圍為49.7～447.3 ng，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.995，平均加標(biāo)回收率為87.0%；漢黃芩素(m/z285.07→270.05)的線性范圍為50.0～350 ng，r2為0.995，平均加標(biāo)回收率為66.0%。該方法可用于黃芩藥材的快速定性檢測(cè)和定量分析。

實(shí)時(shí)直接分析(DART)；Orbitrap質(zhì)譜；黃芩；快速分析

黃芩是一種應(yīng)用廣泛的常用中藥,中國(guó)藥典規(guī)定的正品為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明黃芩具有清熱解毒、抗炎、降壓、減輕組織的缺血損傷、清除氧自由基、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用。藥理研究表明,黃酮類化合物是黃芩的主要有效成分,在黃芩中已發(fā)現(xiàn)的41 種黃酮類化合物中,含量較高并具有明顯藥理作用的是黃芩苷(Baicalin)、黃芩素(Baicalein)、漢黃芩苷(Wogonoside)和漢黃芩素(Wogonin) 4種[1-2]。

2010版中國(guó)藥典利用薄層色譜法以黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素為對(duì)照品對(duì)黃芩藥材進(jìn)行定性鑒別，利用高效液相色譜法測(cè)得黃芩苷含量作為定量依據(jù)。但薄層色譜法的操作較繁瑣，有機(jī)溶劑消耗量大，高效液相色譜法則對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高，且色譜分離過(guò)程需花費(fèi)大量時(shí)間。在傳統(tǒng)中藥材的質(zhì)量控制中常選用一種或多種特定的化學(xué)成分作為定性定量分析標(biāo)記物，篩選標(biāo)記物的原則是選取含量較高且具有特定生物活性的成分[3-5]。然而，中藥材化學(xué)成分高度復(fù)雜的特性增加了色譜分離時(shí)間并使得前處理更復(fù)雜，因此需要更加高通量的方法對(duì)中藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。

實(shí)時(shí)直接分析[6](Direct analysis in real time,DART)離子源是一種新型的敞開(kāi)式大氣壓電離技術(shù)，在2005年由Cody等[7]首次提出，同年由JOEL和IonSense公司將其商業(yè)化。這種電離技術(shù)不需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，能在數(shù)秒內(nèi)分析存在于氣體、液體、固體或材料表面的化合物，對(duì)樣品消耗量較低，分析過(guò)程中無(wú)需大量的有機(jī)溶劑。DART可與多種質(zhì)譜儀聯(lián)用，如飛行時(shí)間質(zhì)譜、四極桿質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜等，應(yīng)用于食品安全、爆炸物的檢測(cè)、藥品非法添加等方面[7-8]。朱洪斌等[9]利用DART-MS建立了快速檢測(cè)烏頭炮制品有效成分的方法，但該方法在中藥材快速定性和定量方面的應(yīng)用特別是同時(shí)定性定量多種成分的研究相對(duì)較少[10]。本研究以黃芩為例，運(yùn)用DART-Orbitrap質(zhì)譜技術(shù)嘗試建立了一種對(duì)含黃酮類成分中藥材快速檢測(cè)的方法。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器、材料與試劑

DART離子源(自動(dòng)滑軌，十孔載樣器，載樣篩網(wǎng))購(gòu)于美國(guó)Ion Sense公司；Q-Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀(Xcaliber工作站)購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾公司。

甲醇(分析純，北京化工廠)；高純氮?dú)?、氦?純度>99.999%，長(zhǎng)春巨洋氧氣廠)；黃芩素(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)：130115)，漢黃芩素(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)：130203)；黃芩藥材由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2檢測(cè)條件

DART條件：參考本實(shí)驗(yàn)室前期工作[10-11]，選擇離子化氣體為氦氣，待機(jī)氣體為氮?dú)?，氣體壓力為0.5 MPa，氣體溫度為300 ℃，其他參數(shù)采用儀器默認(rèn)設(shè)置。定性鑒別采用玻璃管蘸取樣品進(jìn)行檢測(cè)，定量分析采用篩網(wǎng)方式進(jìn)行檢測(cè)，載樣器滑動(dòng)速度為0.2 mm/s，正離子模式采集。

Orbitrap質(zhì)譜條件：掃描范圍m/z50～750，分辨率為35 000，AGC Target 1×10-6(Automatic gain control)，正離子模式掃描，碎裂電壓黃芩素為NCE 80、漢黃芩素為NCE 50。DART離子源與質(zhì)譜入口之間的距離為1 cm。

1.3樣品制備

分別配制0.994 mg/mL黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品溶液與1 mg/mL漢黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為儲(chǔ)備液。稱取黃芩粉末0.5 g，置于5 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲提取40 min，用甲醇補(bǔ)足至刻度，取上清液作為供試品。定性檢測(cè)時(shí)用熔點(diǎn)管蘸取樣品進(jìn)樣，每次檢測(cè)時(shí)間為6 s；定量檢測(cè)時(shí)用移液槍吸取樣品點(diǎn)在載樣篩網(wǎng)上進(jìn)行檢測(cè)，滑動(dòng)速度為0.2 mm/s，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

圖1　黃芩素和漢黃芩素的離子強(qiáng)度隨溫度的變化曲線Fig.1　Signal intensities of baicalein and wogonin ion on different helium gas temperatures

2　結(jié)果與討論

2.1載氣溫度的選擇

以熔點(diǎn)管進(jìn)樣方式分別測(cè)試了100～450 ℃范圍內(nèi)(50 ℃為梯度)黃芩素與漢黃芩素的響應(yīng)值與載氣溫度變化的關(guān)系(如圖1)，測(cè)得最佳離子化溫度為300 ℃[13]。在較低載氣溫度下兩種待測(cè)組分的信號(hào)強(qiáng)度均很弱，黃芩素在200 ℃以下，漢黃芩素在100 ℃時(shí)幾乎無(wú)響應(yīng)信號(hào)，另?yè)?jù)多篇文獻(xiàn)報(bào)道，不同類別化學(xué)物亦出現(xiàn)此情況[5,13-14]。由于高溫有利于待測(cè)物質(zhì)去溶劑化并轉(zhuǎn)移到氣相中[7]，故在達(dá)到最大響應(yīng)值前(黃芩素為400 ℃，漢黃芩素為300 ℃)信號(hào)強(qiáng)度隨溫度的增高而增強(qiáng)。然而過(guò)高的溫度會(huì)使樣品分解與碳化，因此出現(xiàn)信號(hào)強(qiáng)度值隨溫度升高而下降的區(qū)段?？紤]到溫度對(duì)各檢測(cè)指標(biāo)的影響，實(shí)驗(yàn)選定300 ℃為離子化溫度。

2.2碎裂電壓的選擇

以熔點(diǎn)管進(jìn)樣方式分別優(yōu)化黃芩素與漢黃芩素的碎裂電壓(NCE，30～80 eV)，測(cè)得黃芩素和漢黃芩素的最佳碎裂電壓分別為 80 eV和50 eV。在給定NCE電壓(80 eV)條件下可觀察到相對(duì)豐度較大的黃芩素(圖2A)的[M+H]+m/z271.06 和子離子峰m/z123.01，而對(duì)于漢黃芩素(圖2B)，高NCE電壓下難以觀察到其[M+H]+峰，故選用低于黃芩素的碎裂電壓50 eV。

圖2　黃芩素(A)和漢黃芩素(B)的串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.2　DART tandem mass spectra of baicalein(A) and wogonin(B)

2.3定性檢測(cè)

用熔點(diǎn)管蘸取黃芩提取液置于氦氣流中，用Orbitrap 質(zhì)譜采集信號(hào)(如圖3A)。在質(zhì)譜圖中可以看到黃芩素的[M+H]+峰(m/z271.06)以及漢黃芩素的[M+H]+峰(m/z285.07)，此外還可觀察到m/z301.07，315.08，347.07，375.10等特征峰。黃芩中主要含有黃酮類化合物[14]，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，質(zhì)子化的韌黃芩素Ⅱ、二羥基-二甲氧基黃酮、5，7，2′，5′-四羥基-8，6′-二甲氧基黃酮和黃芩新素Ⅱ的精確分子量與上述特征峰一致。 對(duì)黃芩素的[M+H]+離子(m/z271.06)和漢黃芩素的[M+H]+離子(m/z285.07)進(jìn)行碎裂，結(jié)果如圖2所示，利用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)一步對(duì)目標(biāo)峰進(jìn)行確定，增強(qiáng)了黃芩藥材鑒別的準(zhǔn)確性，因此可用上述6個(gè)特征峰結(jié)合黃芩素與漢黃芩素的串聯(lián)質(zhì)譜圖對(duì)黃芩藥材進(jìn)行定性鑒別。另外，對(duì)黃芩藥材進(jìn)行直接檢測(cè)，將黃芩飲片切開(kāi)，切面置于離子化區(qū)域，按“1.2”條件進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)(圖3B) 。對(duì)比黃芩提取液的質(zhì)譜圖(圖3A)可以看出，上述6種特征峰均存在，在用黃芩藥材直接檢測(cè)時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度降低，但對(duì)于藥材的定性鑒別影響不大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DART-MS技術(shù)可對(duì)黃芩進(jìn)行定性檢測(cè)，與傳統(tǒng)的薄層色譜方法相比，具有速度快、節(jié)省有機(jī)溶劑、無(wú)需樣品前處理等優(yōu)點(diǎn)。

圖3　黃芩提取液(A)和黃芩藥材(B)的DART-MS譜圖Fig.3　DART mass spectra of extracted solution(A) and Scutellaria Radix medicinal material(B) of Scutellaria Radix

2.4定量檢測(cè)

依據(jù)2010版《中國(guó)藥典》對(duì)黃芩藥材的規(guī)定，選取黃芩苷作為定量檢測(cè)的指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中難以檢測(cè)到黃芩苷離子峰，可能是由于糖苷類化合物的揮發(fā)性較弱，在檢測(cè)溫度下無(wú)法使其轉(zhuǎn)移到氣相進(jìn)入質(zhì)譜被檢測(cè)，這與前期研究結(jié)果相符[9]，所以選取黃芩素和漢黃芩素作為定量指標(biāo)。采用Targeted-MS2掃描模式，分別對(duì)黃芩素(m/z271.06→123.01)和漢黃芩素(m/z285.07→270.05)的母離子與子離子的提取離子流圖積分，通過(guò)峰面積計(jì)算含量。該方法對(duì)黃芩素和漢黃芩素的檢出限(S/N=3)分別為0.497 ng和0.500 ng。

2.4.1線性關(guān)系精密吸取黃芩素對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配成質(zhì)量濃度為49.7 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別吸取上述對(duì)照品1，2，3，4，5，6，7，8，9 μL，點(diǎn)樣在篩網(wǎng)上，以載樣器滑動(dòng)速度為0.2 mm/s進(jìn)行檢測(cè)。以峰面積(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量(X,ng)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，黃芩素在49.7～447.3 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=2.89×106X-1.43×108，r2=0.995。

精密吸取漢黃芩素對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的對(duì)照品溶液，同法測(cè)定并進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，漢黃芩素在50.0～350 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=5.76×106X-1.20×107，r2=0.995。

2.4.2回收率取已測(cè)定含量的黃芩藥材，按照“1.3”方法制備供試品溶液，分別吸取3 μL供試品溶液5份點(diǎn)樣于載樣篩網(wǎng)上，待溶劑揮干后再分別吸取3 μL濃度為49.7 μg/mL的黃芩素對(duì)照品溶液點(diǎn)樣于載樣篩網(wǎng)上，將篩網(wǎng)置于滑軌上按黃芩素檢測(cè)條件進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定黃芩素的含量，計(jì)算得其加標(biāo)回收率為82%～95%，平均加標(biāo)回收率為87.0%，加標(biāo)回收率結(jié)果良好。

另分別吸取3 μL供試品溶液5份點(diǎn)樣于載樣篩網(wǎng)上，待溶劑揮干后再分別吸取3 μL濃度為50 μg/mL的漢黃芩素對(duì)照品溶液點(diǎn)樣于載樣篩網(wǎng)上，將篩網(wǎng)置于滑軌上按漢黃芩素檢測(cè)條件進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定漢黃芩素的含量，計(jì)算得其回收率為59%～72%，平均加標(biāo)回收率為66.0%，加標(biāo)回收率結(jié)果良好。

2.4.3精密度取黃芩素對(duì)照品溶液5 μL，點(diǎn)樣至篩網(wǎng)上，按“1.2”條件進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)檢測(cè)6次，以黃芩素母離子m/z271.06和子離子m/z123.01提取離子流圖的峰面積計(jì)算[15]，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為9.0%。以漢黃芩素母離子m/z285.07和子離子m/z270.05提取離子流圖的峰面積計(jì)算，漢黃芩素的RSD為8.9%。表明儀器的精密度良好。

2.4.4重復(fù)性分別取5份供試品溶液各5 μL，點(diǎn)樣至篩網(wǎng)上，按“1.2”條件進(jìn)行檢測(cè)。以黃芩素提取離子流圖的峰面積計(jì)算RSD為12.3%，漢黃芩素提取離子流圖的峰面積計(jì)算RSD為9.8%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3　結(jié)　論

本實(shí)驗(yàn)采用DART離子源結(jié)合Orbitrap高分辨質(zhì)譜對(duì)黃芩進(jìn)行檢測(cè)，建立了一種快速定性定量分析黃芩的方法。在定性鑒別時(shí)無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，直接將藥材置于離子化區(qū)域，通過(guò)質(zhì)譜信號(hào)的精確分子量進(jìn)行定性鑒別。與傳統(tǒng)的性狀鑒別和顯微鑒別等快速鑒別手段相比，DART-Orbitrap質(zhì)譜法更加準(zhǔn)確可靠，減少了人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，多種成分同時(shí)檢測(cè)提高了定性分析的準(zhǔn)確性；定量分析結(jié)果表明，本方法具有良好的精密度，但準(zhǔn)確度與HPLC法相比有一定差距。該方法適用于復(fù)雜基質(zhì)條件下對(duì)中藥的指標(biāo)性成分進(jìn)行快速分析，方法準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、綠色，可為中藥材、飲片以及中成藥的分析和質(zhì)量控制提供方法參考。

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Rapid Analysis of Scutellaria Radix by Using DART Coupled with Orbitrap Mass Spectrometry

LI Le-le1，GUO Yun-long1，LIU Wen-long1，LI Zhuo2，WANG Yang1，LIU Shu-ying1,3*

(1.Jilin Ginseng Academy,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun130117，China；2.The Affiliation Hospital to Changchun University of Chinese Medicine,Changchun130021，China；3.Changchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Changchun130022，China)

A DART coupled with Orbitrap mass spectrometric method was developed for the qualitative and quantitative analyses ofscutellariaradix.The component was identified by comparing with standard component and the report of relative researches as well as the full scan spectra and secondary spectra.In quantitative analysis,the Full MS-SIM and Targeted-MS2mode was applied to obtain the mass spectrum,extract ion chromatography based on the parents ion and the product ion of baicalein(m/z271.06→123.01) and wogonin(m/z285.07→270.05) were used for quantitative analysis in the Targeted-MS2mode.The signals of baicalein,wogonin,SkullcapflavonⅡ and other components were observed in the mass spectra ofscutellariaradix.The linear ranges of baicalein and wogonin were 49.7-447.3 ng(r2=0.995) and 50.0-350 ng(r2=0.995),respectively.Their average recoveries were 87.0% and 66.0%,respectively.This method is suitable for the rapid analysis ofscutellariaradixand other traditional Chinese herbal medicines.

direct analysis in real time(DART); Orbitrap mass spectrometry;ScutellariaRadix; rapid analysis

2015-11-03；

2016-01-11

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)基金(201303111)

劉淑瑩，博士，研究員，研究方向：有機(jī)質(zhì)譜學(xué)，Tel:0431-86045155，E-mail:syliu@ciac.ac.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.014

O657.63; TQ460.72

A

1004-4957(2016)07-0859-05