趙曉娟，張其美，陳海光，白衛(wèi)東

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院　輕工食品學(xué)院，廣東　廣州　510225)

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氯霉素在過氧化聚多巴胺修飾電極上的電化學(xué)行為及測定

趙曉娟，張其美，陳海光，白衛(wèi)東*

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225)

利用多巴胺(DA)的自聚反應(yīng)在玻碳電極(GCE)表面形成聚多巴胺(PDA)膜，將聚多巴胺修飾電極浸入堿溶液中進(jìn)行電化學(xué)處理，制得過氧化聚多巴胺修飾電極(OPDA/GCE)。通過方波伏安法直接測定氯霉素在OPDA/GCE上的電化學(xué)響應(yīng)信號，得到待測溶液中氯霉素的濃度。對多巴胺的自聚時間、氯霉素在修飾電極上的電化學(xué)性質(zhì)、測試條件、溶解氧的影響及去除方法等進(jìn)行考察。結(jié)果表明，氯霉素在OPDA/GCE上的還原峰電流與其濃度在3.0×10-6～1.1×10-3mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限(S/N=3)為7.8×10-7mol/L，牛奶和蜂蜜樣品的加標(biāo)回收率分別為83.4%～94.1%和91.5%～108.6%。該修飾電極制備方法簡便易行、成本低、便于批量制備，用其檢測氯霉素操作簡單、選擇性好。

聚多巴胺；過氧化；自聚反應(yīng)；修飾電極；氯霉素

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)類抗生素被廣泛用于動物各種細(xì)菌性傳染疾病的治療。研究表明，食品中的氯霉素類藥物殘留對人體有嚴(yán)重的副作用。我國農(nóng)業(yè)部2002年發(fā)布《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》，禁止給所有食品動物使用氯霉素。但因其價格低、抑菌效果好，目前仍有違規(guī)使用現(xiàn)象。因此，對動物源性食品中的氯霉素殘留進(jìn)行測定具有重要意義。

目前，氯霉素殘留的檢測方法主要有色譜及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[1-5]、光譜法[6-8]、免疫分析[9-11]和電化學(xué)傳感分析法[12-14]等。電化學(xué)傳感分析法快速靈敏、操作簡便、易于微型化和實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場分析，在氯霉素殘留快速檢測方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。近年來，氯霉素的生物電化學(xué)傳感器和分子印跡傳感器研究取得了一定的突破[15-19]，但生物分子價格昂貴、環(huán)境耐受性差。雖然分子印跡聚合物克服了生物分子的上述缺陷，但尋找合適的功能單體和洗脫劑的過程費(fèi)時費(fèi)力。

本文通過多巴胺(DA)在玻碳電極(GCE)表面的自聚反應(yīng)，得到聚多巴胺(PDA)膜修飾電極(PDA/GCE)，進(jìn)一步將PDA/GCE浸入堿溶液中進(jìn)行電化學(xué)處理，制得過氧化聚多巴胺修飾電極(OPDA/GCE)。通過測定氯霉素在OPDA/GCE上的還原峰電流得到待測溶液中氯霉素的濃度，對市售牛奶和蜂蜜樣品中的氯霉素殘留進(jìn)行檢測，并進(jìn)行加標(biāo)回收率測定。該修飾電極制備及使用方法簡單、成本低、便于批量制備、選擇性好。

1　實(shí)驗部分

1.1儀器與試劑

DY 2100B電化學(xué)分析儀(美國Digi-Ivy公司)，三電極系統(tǒng)：工作電極為GCE、PDA/GCE或OPDA/GCE，參比電極為Ag/AgCl(飽和KCl溶液)電極，輔助電極為鉑絲電極。

多巴胺(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)，氯霉素(阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司)，三(羥甲基)氨基甲烷(阿拉丁試劑有限公司)，甲砜霉素(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，硫酸慶大霉素和鹽酸金霉素(生工生物工程(上海)股份有限公司)，新霉素硫酸鹽、青霉素鉀、鹽酸強(qiáng)力霉素(廣州市齊云生物技術(shù)有限公司)；0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.0)由NaH2PO4·2H2O和 Na2HPO4·12H2O貯備液混合配制；0.01 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.5)由Tris和HCl儲備液混合配制；所用試劑均為分析純。實(shí)驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2PDA/GCE的制備

將GCE依次用1.0，0.3，0.05 μm的α-Al2O3粉在拋光絨毛墊上拋光，每一步均用水洗凈，然后依次在1∶1 HNO3溶液、無水乙醇和水中超聲清洗，處理后的電極室溫下晾干備用。將GCE浸入2 mg/mL DA的Tris-HCl緩沖溶液(0.01 mol/L，pH 8.5)中避光自聚反應(yīng)2.5 h，取出電極后用水充分淋洗。

1.3OPDA/GCE的制備

將0.5 mol/L NaOH溶液置于電解杯中，通氮除氧15 min后，以PDA/GCE為工作電極，將三電極系統(tǒng)置于該堿溶液中，在-1.5～1.0 V電壓范圍內(nèi)，以50 mV/s的掃速循環(huán)伏安掃描6圈，將處理后的電極用水充分淋洗，即得OPDA/GCE。

1.4檢測方法

用0.1 mol/L PBS(pH 7.0)配制不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液或稀釋待測樣品溶液。以O(shè)PDA/GCE為工作電極，將三電極系統(tǒng)置于經(jīng)通氮處理15 min的氯霉素溶液中，采用方波伏安法(SWV)直接測定氯霉素在-0.65 V的還原峰電流。該還原峰電流與溶液中氯霉素的濃度成正比。根據(jù)電流與氯霉素濃度的對應(yīng)關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于待測樣品中氯霉素含量的測定。

SWV測定條件：起始電位為-0.2 V，終止電位為-1.0 V，電位增量為2 mV，方波振幅為100 mV，方波頻率為20 Hz。

2　結(jié)果與討論

2.1氯霉素在OPDA/GCE上的電化學(xué)行為

利用方波伏安法比較了GCE和OPDA/GCE在PBS和0.1 mmol/L氯霉素溶液中的電化學(xué)響應(yīng)。在所考察的電位窗口內(nèi)，GCE和OPDA/GCE在PBS中均未出現(xiàn)還原峰(圖1a～b)，而在氯霉素溶液中，GCE和OPDA/GCE分別于-0.55 V和-0.65 V處出現(xiàn)1個明顯的還原峰(圖1c～d)。與GCE相比，氯霉素在OPDA/GCE上的還原峰電流值顯著增大，表明OPDA/GCE對氯霉素的電化學(xué)還原具有良好的催化作用。

2.2電極修飾與測試條件的選擇

2.2.1PDA/GCE的過氧化處理為考察對PDA/GCE進(jìn)行過氧化處理的作用，使用PDA/GCE和OPDA/GCE對0.1 mmol/L氯霉素溶液進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。與PDA/GCE相比，氯霉素在OPDA/GCE上的響應(yīng)電流明顯增強(qiáng)。這主要是由于過氧化處理使電極表面的聚多巴胺膜所帶負(fù)電荷增加，與溶液中帶正電荷的氯霉素分子之間的靜電吸引作用力增強(qiáng)，氯霉素分子更易到達(dá)電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)。

圖2　PDA/GCE(a)和OPDA/GCE(b)在0.1 mmol/L CAP溶液中的方波伏安圖Fig.2　Square wave voltammograms for PDA/GCE(a) and OPDA/GCE(b) in 0.1 mmol/L CAP solution

圖1　GCE(a,c)和OPDA/GCE(b,d) 的方波伏安圖Fig.1　Square wave voltammograms for GCE(a,c) and OPDA/GCE(b,d) a,b:0.1 mol/L PBS(pH 7.0);c,d:0.1 mmol/L CAP solution

2.2.2DA自聚時間的選擇將GCE浸入2 mg/mL DA的Tris-HCl緩沖溶液中，分別避光自聚反應(yīng)1，2，2.5，3，4，5，10，20 h，研究自聚不同時間下制備的OPDA/GCE對0.1 mmol/L氯霉素溶液的響應(yīng)情況。結(jié)果表明，GCE在DA溶液中自聚反應(yīng)2.5 h時制備的OPDA/GCE對氯霉素的響應(yīng)電流值最大，因此選擇2.5 h作為DA的自聚時間。

2.2.3溶解氧的影響及去除方法的選擇取PBS和0.1 mmol/L氯霉素溶液各2份，對其中1份PBS和氯霉素溶液進(jìn)行通氮除氧處理，然后用OPDA/GCE對上述4份溶液分別進(jìn)行測定，考察溶解氧對OPDA/GCE測定效果的影響。結(jié)果顯示，溶解氧的存在會使OPDA/GCE在PBS中于-0.55 V出現(xiàn)寬峰，同時在氯霉素還原峰的附近出現(xiàn)干擾峰，影響氯霉素在-0.65 V處還原峰電流的取值；而通氮除氧后的PBS檢測基線平滑，氯霉素的響應(yīng)峰形好，峰電流值大。因此，測定前需對溶液中的溶解氧進(jìn)行去除。

分別在中性(pH 7.0)PBS和氯霉素溶液中加入0.1 mmol/L Na2SO3或抗壞血酸、在堿性(pH 12.0)溶液中加入0.1 mmol/L Na2SO3、在酸性(pH 2.0)溶液中加入0.1 mmol/L Na2CO3，超聲混勻10 min后進(jìn)行測定，將上述4種化學(xué)除氧方法的測定效果與通氮除氧的測定效果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，Na2CO3在本溶液體系中無去除溶解氧的作用；在中性溶液中加入Na2SO3雖有一定的除氧效果，但氯霉素的出峰位置負(fù)移較大；在堿性溶液中加入Na2SO3和在中性溶液中加入抗壞血酸均具有明顯的除氧效果，但與通氮除氧相比，通過化學(xué)試劑去除溶解氧時響應(yīng)曲線的基線不平穩(wěn)，而且氯霉素的還原峰峰形較寬。因此，選擇通氮?dú)夥ㄈコ郎y試溶液中的溶解氧。

2.2.4底液pH值的選擇氯霉素是弱堿性化合物，其pKa值為9.61[20]。配制氯霉素溶液時底液的pH值影響氯霉素在溶液中的穩(wěn)定性和存在狀態(tài)，從而影響氯霉素與過氧化聚多巴胺膜的作用能力。分別用pH值為2.0，7.0，12.0的0.1 mol/L PBS配制0.1 mmol/L氯霉素溶液，考察OPDA/GCE在不同pH值的氯霉素溶液中的電化學(xué)響應(yīng)。結(jié)果表明，pH 7.0的氯霉素溶液在OPDA/GCE上的還原峰電流值最大，主要是由于pH 7.0時，溶液中約99%以上的氯霉素以陽離子狀態(tài)存在，與帶負(fù)電荷的過氧化聚多巴胺膜之間的靜電吸引力強(qiáng)，從而使氯霉素的響應(yīng)靈敏度提高；pH 12.0時，溶液中的氯霉素主要以中性分子狀態(tài)存在，不易到達(dá)電極表面發(fā)生反應(yīng)，同時氯霉素在強(qiáng)堿性溶液中的穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致氯霉素在OPDA/GCE上的峰電流較?。籶H 2.0時，氯霉素的穩(wěn)定性較差，響應(yīng)電流降低。由于氯霉素在中性和弱酸性條件下較穩(wěn)定，且當(dāng)溶液的pH值小于氯霉素的pKa值約2個單位時，氯霉素主要以陽離子狀態(tài)存在，與過氧化聚多巴胺膜的作用能力強(qiáng)，因此，實(shí)驗選擇氯霉素測試底液的最佳pH值為7.0。

圖3　OPDA/GCE測定不同濃度氯霉素溶液的方波伏安圖Fig.3　Square wave voltammograms of CAP solutions with different concentrations on OPDA/GCE cCAP(a-q):0.003,0.005,0.007,0.009,0.011,0.021, 0.039,0.056,0.075,0.092,0.11,0.28,0.45,0.61, 0.77,0.92,1.1 mmol/L；insert:calibration curve of reductive peak currents vs.CAP concentration

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在優(yōu)化實(shí)驗條件下，使用方波伏安法考察不同濃度的氯霉素溶液在OPDA/GCE上的電流響應(yīng)(如圖3)。由圖3可見，隨著氯霉素濃度的增加，其在-0.65 V處的還原電流逐漸增大，且還原峰電流值(I，μA)與氯霉素濃度(c，mmol/L)在3.0×10-6～1.1×10-3mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為I=25.27c+1.648(r=0.993，n=17)?；?倍信噪比(S/N=3)計算得到該修飾電極對氯霉素的檢出限為7.8×10-7mol/L。

2.4干擾實(shí)驗

以0.1 mmol/L氯霉素溶液為對照，考察相同濃度、10倍濃度的硫酸慶大霉素、青霉素鉀、新霉素硫酸鹽、鹽酸金霉素、鹽酸強(qiáng)力霉素、甲砜霉素對氯霉素測定的干擾情況。結(jié)果顯示，加入上述干擾物質(zhì)后氯霉素的響應(yīng)電流無明顯變化，表明本實(shí)驗制備的OPDA/GCE對氯霉素測定具有良好的選擇性。

2.5重復(fù)性

取5支GCE，按相同方法進(jìn)行修飾得到OPDA/GCE，并測定其對相同濃度氯霉素溶液的電流響應(yīng)，測得還原峰電流值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%，表明該修飾電極的制備重復(fù)性好。

用同一支OPDA/GCE對相同濃度的氯霉素溶液測定8次，測得還原峰電流值的RSD為2.7%，表明該修飾電極對氯霉素的測試重復(fù)性好。

2.6實(shí)際樣品的測定

選取市售牛奶和蜂蜜樣品各2種，牛奶樣品按照文獻(xiàn)[21]方法前處理后，將上清液用磷酸鹽配成pH 7.0的待測樣品溶液；蜂蜜樣品直接用0.1 mol/L PBS(pH 7.0)溶解后作為待測樣品溶液。使用OPDA/GCE進(jìn)行方波伏安法測試，未出現(xiàn)氯霉素的特征還原峰，表明所測牛奶和蜂蜜樣品中不含氯霉素。為驗證方法的準(zhǔn)確性，取上述空白牛奶和蜂蜜樣品各1種，分別添加0.039，0.92 mmol/L的氯霉素溶液，按照優(yōu)化條件分別平行測定3次，其加標(biāo)回收率分別為83.4%～94.1%和91.5%～108.6%，RSD分別為3.5%～5.7%和2.8%～7.4%，表明本方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

3　結(jié)　論

本文利用多巴胺自聚反應(yīng)和過氧化處理方法制得一種過氧化聚多巴胺修飾電極，通過測定氯霉素在修飾電極上的還原峰電流得到待測溶液中氯霉素的濃度，對修飾電極的制備方法和測試條件、氯霉素在修飾電極上的電化學(xué)行為等進(jìn)行了考察和優(yōu)化，并對市售牛奶和蜂蜜樣品中的氯霉素殘留進(jìn)行了檢測。實(shí)驗結(jié)果表明，該修飾電極制備及使用方法簡單、成本低、便于批量制備、選擇性好；經(jīng)過氧化處理的聚多巴胺膜修飾電極對氯霉素的響應(yīng)靈敏度顯著增強(qiáng)，相關(guān)研究可為今后修飾電極的制備與開發(fā)提供思路和參考。

[1]Vosough M,Esfahani H M.Talanta,2013,113:68-75.

[2]Liu T S,Xie J,Zhao J F,Song G X,Hu Y M.FoodAnal.Methods,2014,7(4):814-819.

[3]Sniegocki T,Posyniak A,Gbylik-Sikorska M,Zmudzki J.Anal.Lett.,2014,47(4):568-578.

[4]Lu Y,Yao H,Li C,Han J,Tan Z J,Yan Y S.FoodChem.,2016,192:163-170.

[5]Liu Y D，Zhang Q，Chen W S，Hong L.J.Instrum.Anal.(劉彥東，張權(quán),陳文生,洪亮.分析測試學(xué)報),2015,34(3):362-366.

[6]Ji W,Yao W R.Spectrochim.ActaPartA,2015,144:125-130.

[7]Hegazy M A,Lotfy H M,Rezk M R,Omran Y R.Spectrochim.ActaPartA,2015,140:600-613.

[8]Wang C Y,Xiang B R,Zhang W,Wang Z W,Chen C Y.FoodSci.(王彩云,相秉仁,張偉,王正武,陳昌云.食品科學(xué)),2009,30(6):184-187.

[9]Yu X X,He Y,Jiang J,Cui H.Anal.Chim.Acta,2014,812:236-242.

[10]Xia X H,Xu Y,Ke R Q,Zhang H,Zou M Q,Yang W,Li Q G.Anal.Bioanal.Chem.,2013,405(23):7541-7544.[11]Tao X Q,Jiang H Y,Zhu J H,Wang X,Wang Z H,Niu L L,Wu X P,Shi W M,Shen J Z.FoodAgric.Immunol.,2013,25(1):137-148.[12]Yadav S K,Agrawal B,Chandra P,Goyal R N.Biosens.Bioelectron.,2014,55:337-342.

[13]Kor K,Zarei K.J.Electroanal.Chem.,2014,733:39-46.

[14]Zhai H Y,Liang Z X,Chen Z G,Wang H H,Liu Z P,Su Z H,Zhou Q.Electrochim.Acta,2015,171:105-113.[15]Pilehvar S,Mehta J,Dardenne F,Robbens J,Blust R,De Wael K.Anal.Chem.,2012,84(15):6753-6758.

[16]Pilehvar S,Dierckx T,Blust R,Breugelmans T,De Wael K.Sensors,2014,14(7):12059-12069.

[17]Shao Y J,Mo F L,Wei X P,Li J P.J.GuilinUniv.Technol.(邵義娟,莫方樓,魏小平,李建平.桂林理工大學(xué)學(xué)報),2013,33(4):737-742.

[18]Zhang J H,Zhang W,Li M X,Chen R R,Zhao X J,Liu J,Bai W D,Chen H G.GuangdongAgric.Sci.(章錦涵,張威,李美欣,陳蓉蓉,趙曉娟,劉佳,白衛(wèi)東,陳海光.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)),2015,42(19):95-100.

[19]Yang G M,Zhao F Q.Biosens.Bioelectron.,2015,64:416-422.

[20]Qian M R,Wu L Q,Zhang H,Liu F,Li R,Chen Z M,Li T,Fang L Z.J.Instrum.Anal.(錢鳴蓉,吳俐勤,章虎,劉飛,李銳,陳志民,李婷,方麗珍.分析測試學(xué)報),2011,30(9):1018-1022.

[21]Jeon M,Kim J,Paeng K J,Park S W,Paeng I R.Microchem.J.,2008,88:26-31.

Electrochemical Behavior and Determination of Chloramphenicol on Overoxidized Polydopamine Film Modified Electrode

ZHAO Xiao-juan,ZHANG Qi-mei,CHEN Hai-guang,BAI Wei-dong*

(College of Light Industry and Food Science,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou510225,China)

Polydopamine(PDA) film was modified on the surface of glassy carbon electrode(GCE) by the self-polymerization of dopamine(DA).Then the overoxidized polydopamine film modified electrode(OPDA/GCE) was obtained by electrochemical treatment of PDA film in alkaline solution.Furthermore,the chloramphenicol(CAP) concentration was obtained by using square wave voltammetry to detect directly the reduction current of CAP on OPDA/GCE.Self-polymerization time of DA,electrochemical response of CAP on OPDA/GCE,electrochemical test condition,and influence and removal methods of dissolved oxygen,etc. were investigated and optimized.The results indicated that the reduction peak current of CAP on OPDA/GCE showed a good linear relationship in the contentraiton range of 3.0×10-6-1.1×10-3mol/L,and the detection limit was 7.8×10-7mol/L based on the signal to noise ratio of 3.The recoveries for milk and honey samples were in the ranges of 83.4%-94.1% and 91.5%-108.6%,respectively.The preparation method of the modified electrode is simple,inexpensive and convenient for batch preparation.The detection method of CAP is also simple and high-selective.

polydopamine;overoxidized;self-polymerization;modified electrode;chloramphenicol

2016-02-16；

2016-04-02

國家自然科學(xué)基金項目(21005091)；廣東省科技計劃項目(2016A040403116)；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃資助項目(Yq2013097)

白衛(wèi)東，碩士，教授，研究方向：食品化學(xué)與食品安全，Tel：020-89003179，E-mail：whitebai2001@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.012

O657.1；O629.5

A

1004-4957(2016)07-0849-05