周瑾艷，陳玲，毛沅文，周陽(yáng)，尹強(qiáng)，許俊斌（廣東省計(jì)量科學(xué)研究院，廣州 510405）

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羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制*

周瑾艷，陳玲，毛沅文，周陽(yáng)，尹強(qiáng)，許俊斌
（廣東省計(jì)量科學(xué)研究院，廣州 510405）

以商購(gòu)羅丹明B為原料，進(jìn)行重結(jié)晶提純，制備羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。采用紅外光譜（IR）、高分辨質(zhì)譜和核磁共振譜（NMR）進(jìn)行定性分析。樣品分裝400瓶后，依據(jù)國(guó)家《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范》，采用液相色譜-二極管陣列法對(duì)隨機(jī)抽取的15瓶樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，經(jīng)F檢驗(yàn)表明，在95%的置信區(qū)間范圍內(nèi)，樣品均勻性良好。在室溫下，經(jīng)過(guò)30個(gè)月穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明樣品穩(wěn)定性良好。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)國(guó)內(nèi)8家具有分析資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同定值，定值結(jié)果為99.0%，擴(kuò)展不確定度為1.0%（k=2）。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)達(dá)到了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的技術(shù)要求，可用于有關(guān)羅丹明B的分析方法校正和質(zhì)量控制。

羅丹明B；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；純度；重結(jié)晶；不確定度

目前食品安全問(wèn)題已成為全社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。許多食品安全問(wèn)題與食品添加劑的使用不當(dāng)有關(guān)，如超出范圍、超量使用或非法使用食品添加劑。食用色素是用來(lái)著色的食品添加劑［1-3］。隨著食用色素安全性實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，有的合成色素有致癌作用，能誘發(fā)染色體變異。2003年沸沸揚(yáng)揚(yáng)的“蘇丹紅”風(fēng)暴引起了全世界對(duì)色素安全的關(guān)注，2005年質(zhì)檢總局查出不法分子用羅丹明B替代蘇丹紅制出毒花椒和火鍋底料。

羅丹明B（Rhodamine B）又稱(chēng)玫瑰紅B，是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料。經(jīng)老鼠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羅丹明B會(huì)引致皮下組織生肉瘤，被懷疑是致癌物質(zhì)，國(guó)家已經(jīng)明令禁止在食品中使用。目前行業(yè)內(nèi)大都使用國(guó)外進(jìn)口的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer Gmb H和美國(guó)Accustandard?分別研制了羅丹明B的純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。但這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通常價(jià)格昂貴，且采購(gòu)周期長(zhǎng)。我國(guó)關(guān)于羅丹明B有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制還未見(jiàn)報(bào)道。因此基于食品安全的需求和保障國(guó)家食品安全溯源體系，筆者研制了羅丹明B有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為食品安全檢測(cè)和監(jiān)督管理提供重要技術(shù)支撐。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters 2695-2998型，美國(guó)Waters 公司；

傅里葉紅外光譜儀：Tensor-37 型，德國(guó)布魯克公司；

核磁共振儀：DPX-300 型，美國(guó)Bruker公司；

高分辨質(zhì)譜儀：Agilent 6540 Q-TOF 型，美國(guó)安捷倫科技公司；

羅丹明B原料：純度大于95%，市購(gòu)；

甲醇：色譜級(jí)，德國(guó)Merck公司；

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

采用高純羅丹明B為原料，以甲醇-水（體積比為5∶1）為溶劑，在電熱板上加熱至80℃使其溶解后，再分次加入適量甲醇和水（甲醇和水的用量比為1∶1），保溫20 min，濾過(guò)，4℃條件下重結(jié)晶5 h，過(guò)濾后干燥，經(jīng)研磨過(guò)篩，混勻后得羅丹明B候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。將純化后的羅丹明B純度樣品分裝于棕色玻璃樣品瓶，每瓶200 mg，共分裝約400瓶。封裝好的樣品，放置于4℃冰箱保存。

1.3定性分析

采用紅外光譜、核磁H譜和高分辨質(zhì)譜對(duì)羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主成分進(jìn)行定性分析。

1.4定值分析

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度采用液相色譜法［4-6］進(jìn)行測(cè)定。

1.4.1儀器工作條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：甲醇；波長(zhǎng)：545 nm；流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：35℃。

1.4.2樣品配制

隨機(jī)抽取分裝好的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg，用甲醇稀釋至100 mL容量瓶，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品溶液，用液相色譜法進(jìn)行純度檢測(cè)，每次進(jìn)樣10 μL，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3次。

2　結(jié)果與討論

2.1定性分析

采用紅外光譜、核磁H譜對(duì)研制的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主成分進(jìn)行定性分析。圖1、圖2分別為研制的羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的紅外譜圖和SDBS圖庫(kù)中羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)紅外譜圖。圖3、圖4分別為研制的羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的核磁H譜圖和SDBS圖庫(kù)中羅丹明B的核磁H譜圖。由圖1、圖2可知，純化后羅丹明B的紅外譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖相符，判斷主成分為羅丹明B；由圖3、圖4可知，純化后羅丹明B核磁共振H譜圖與標(biāo)準(zhǔn)H譜圖相符，說(shuō)明該純度物質(zhì)與羅丹明B結(jié)構(gòu)一致。

圖1　研制的羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的紅外譜圖

圖2　SDBS圖庫(kù)中羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)紅外譜圖

圖3　羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的核磁共振H譜圖

圖4　SDBS圖中的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)核磁H譜圖

2.2均勻性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性是衡量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，也是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值準(zhǔn)確傳遞的基礎(chǔ)。采用方差分析法來(lái)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)所研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性。參照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范，分別從已經(jīng)分裝好的400瓶羅丹明B純度樣品中按照頭尾、中間編號(hào)各隨機(jī)抽取15瓶樣品。準(zhǔn)確稱(chēng)量抽取的樣品約10 mg，配制成溶液，采用液相色譜-面積歸一化法測(cè)定純度，每瓶樣品平行進(jìn)樣3次，以每次測(cè)量的平均值作為均勻性評(píng)價(jià)結(jié)果，然后對(duì)其進(jìn)行方差分析，結(jié)果列于表1、表2。

表1　羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果 %

查表得Fα=2.037，經(jīng)計(jì)算F=0.658，F(xiàn)

2.3穩(wěn)定性檢驗(yàn)

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范，按照前緊后疏的原則，對(duì)羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了30個(gè)月的長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察，結(jié)果見(jiàn)表3。另外對(duì)短期穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，短期穩(wěn)定性是指標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在運(yùn)輸過(guò)程中的穩(wěn)定性。為了考察運(yùn)輸條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性的影響，并綜合考慮到南方的高溫天氣，模擬運(yùn)輸條件，隨機(jī)抽取6瓶樣品，置于運(yùn)輸條件下（60℃±5℃，培養(yǎng)箱中）和常規(guī)儲(chǔ)存條件下（4℃±1℃），考察其短期穩(wěn)定性，結(jié)果表4。

表3　羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表4　羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

采用直線模型作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)羅丹明B長(zhǎng)期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［7］，計(jì)算得斜率斜率不顯著，即表明在30個(gè)月內(nèi)羅丹明純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值沒(méi)有發(fā)生明顯的趨勢(shì)性變化。同時(shí)對(duì)兩種條件下的測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行同樣的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存條件和運(yùn)輸條件下羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性均良好。

2.4定值結(jié)果與不確定度

2.4.1定值結(jié)果

（1）羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原料經(jīng)重結(jié)晶提純，按照“國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范”的要求，主成分純度采用8家實(shí)驗(yàn)室合作定值，所采用的定值方法為液相色譜面積歸一化法［7-11］。8家實(shí)驗(yàn)室定值的分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果 %

采用狄克遜準(zhǔn)則和格拉布斯準(zhǔn)則［12-13］對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行可疑值分析，結(jié)果表明未發(fā)現(xiàn)可疑值。因此采用8家實(shí)驗(yàn)室的總平均值作為聯(lián)合定值的結(jié)果。

采用液相色譜-面積歸一化法測(cè)定羅丹明B的純度，其結(jié)果不包含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的水分和殘?jiān)?，因此需要?duì)其水分和殘?jiān)M(jìn)行測(cè)試。

（2）水分測(cè)試。水分測(cè)試采用卡爾費(fèi)休水分測(cè)定儀，重復(fù)測(cè)量6次，取平均值作為水分測(cè)試結(jié)果，得到羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水分含量為0.17%。

（3）殘?jiān)鼫y(cè)試。殘?jiān)治鐾ㄟ^(guò)高溫灼燒測(cè)得。稱(chēng)取適量樣品，在（650±50）℃的馬弗爐中灼燒至恒重進(jìn)行稱(chēng)量，重復(fù)測(cè)量6次，取平均值得到羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)殘?jiān)繛?.34%。

（4）定值結(jié)果。根據(jù)多家實(shí)驗(yàn)室液相色譜法定值結(jié)果及樣品水分和殘?jiān)臏y(cè)定值，羅丹明B的純度：

2.4.2定值結(jié)果的不確定度評(píng)定

根據(jù)JJG 1006-1994 《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的相關(guān)規(guī)定［4-7］，標(biāo)準(zhǔn)值定值結(jié)果的不確定度由3部分組成：羅丹明B定值實(shí)驗(yàn)引入的不確定度u定值；樣品不均勻引入的不確定度u均；樣品不穩(wěn)定性引入的不確定度u穩(wěn)。依據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)量結(jié)果，計(jì)算出羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度分量，各不確定度分量見(jiàn)表6。

表6　定值不確定度分量評(píng)定結(jié)果

根據(jù)表6，合成不確定度：

取包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度：

羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果：

3　結(jié)論

研制的羅丹明B純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過(guò)了均勻性、穩(wěn)定性考察，采用多家實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行聯(lián)合定值，定值結(jié)果準(zhǔn)確可靠。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制可滿(mǎn)足食品、藥品、日化、環(huán)境保護(hù)及化工產(chǎn)品的檢測(cè)需要，可用于相關(guān)儀器（色譜儀）的校準(zhǔn)、分析方法評(píng)價(jià)，為統(tǒng)一相關(guān)量值發(fā)揮作用。

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Development of Rhodamine B Certified Reference Material

Zhou Jinyan， Chen Ling， Mao Yuanwen， Zhou Yang， Yin Qiang， Xu Junbin
（Guangdong Institute of Metrology， Guangzhou 510405， China）

Rhodamine B certified reference material was developed. Raw material was recrystallized for preparation of Rhodamine B by business purchased. The structure of Rhodamine B certified reference material was comfirmed by infrared spectroscopy （IR），high resolution mass spectral and nuclear magnetic resonance （NMR）. The homogeneity testing were evaluated by liquid chromatography with diode array detector detector （LC-DAD）. According to analysis procedure of homogeneity，15 bottles of sample were randomly taken from 400 bottles，and the results were validated by F-test statistical method. The test results indicated that the homogeneity was good in the 95% confidence interval. The stability inspection was carried at room temperature for 30 months. The results indicated that the stability was good. A cooperative certification was conducted by eight qualified laboratories. The certified purity value of the reference material of Rhodamine B was 99.0% with relative expaned uncertainty of 1.0%（k=2）. The reference material can meet the technical requirement of the certified reference material， it can be used for the method validation and quality control regarding Rhodamine B.

Rhodamine B； certified reference material； purity； recrystallization； uncertainty

O657

A

1008-6145（2016）04-0004-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.04.001

*廣東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013ZJ02）

聯(lián)系人：周瑾艷；E-mail: zhoujinyan2005@163.com

2016-05-17