喬 軍石 瑤連 勇劉富中陳鈺輝張 映李素文王利英*

（1天津科潤蔬菜研究所，蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）

降低茄子莖段組培染菌率的初步研究

喬 軍1石 瑤1連 勇2劉富中2陳鈺輝2張 映2李素文1王利英1*

（1天津科潤蔬菜研究所，蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）

茄子莖段組培容易染菌，為了測試15種滅菌方法的滅菌效果，選取紫圓茄、紫長茄、綠茄3種類型茄子品種，根據(jù)染菌率和植株再生成活率判斷最佳滅菌方法。結(jié)果表明，不同類型茄子適用的滅菌方法不同。紫圓茄莖段適宜的滅菌方法為：2% NaClO浸泡10 min，再用0.1% HgCl2浸泡10 min；紫長茄莖段適宜的滅菌方法為：4% NaClO浸泡10 min，再用0.3% HgCl2浸泡10 min；綠茄莖段適宜的滅菌方法為：6% NaClO浸泡10 min，再用0.1% HgCl2浸泡10 min。綠茄莖段保存試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫保存有利于降低茄子莖段組培染菌率，其中最適保存條件為5 ℃下保存3 d以內(nèi)，染菌率在20%以下，再生成活率保持在60%左右，可以滿足植株再生要求。

茄子；莖段；組培；染菌率

植物組織培養(yǎng)技術(shù)對單倍體育種、誘變育種及種質(zhì)保純脫毒等方面具有重要意義（王利英 等，2015，2016），經(jīng)過近一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，已經(jīng)在科研和生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用（周俊輝，1999）。污染、褐化和玻璃化是組培中經(jīng)常碰到的問題，尤其細(xì)菌污染最為普遍（胡凱 等，2007）。采取有效的滅菌方法對外植體進(jìn)行徹底滅菌，同時(shí)又不傷害生長點(diǎn)，保證外植體較高的成活率是組培成功的關(guān)鍵（穆紅梅 等，2015）。近年來由于基因工程的快速發(fā)展，茄子再生體系研究受到重視，前人主要從外植體類型（俞瓊 等，2007；方巖巖 等，2013）、激素（洪曉華 等，2009；李燁 等，2014）、無菌苗生產(chǎn)（謝超 等，2012）、不定芽及根誘導(dǎo)（黃志銀和曹必好，2012；張明華 等，2014）等方面進(jìn)行了廣泛的再生體系研究。國外學(xué)者對組培相關(guān)研究主要集中在單倍體誘導(dǎo)和莖尖脫毒上（Salas et al.，2011；Wang et al.，2016）。染菌是所有茄子再生研究中經(jīng)常碰到的問題，亟待找出更好的滅菌方法以降低染菌率。

莖段培養(yǎng)可以快速、有效地繁殖所需材料，尤其對于無種子種質(zhì)資源及野生資源保存意義重大（黃碧蘭 等，2008）。本試驗(yàn)研究了不同品種、不同滅菌方式和保存條件對茄子莖段組培染菌率和植株再生成活率的影響，旨在為構(gòu)建茄子莖段離體再生體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2014年在天津科潤蔬菜研究所進(jìn)行，供試茄子類型共3種，均為天津科潤蔬菜研究所自育品種。圓茄品種圓豐園為紫圓茄一代雜種，紫紅莖，莖有白色絨毛；長茄品種津豐長茄4號(hào)為紫長茄一代雜種，紫黑莖，莖有白色絨毛；綠茄品種青豐1號(hào)為綠茄一代雜種，綠莖，莖有白色絨毛。6 月15日播種育苗，7月25日定植于日光溫室，每份材料種植50株，株距50 cm，行距70 cm，高壟地膜覆蓋，正常栽培管理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 滅菌方法 試驗(yàn)在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，共設(shè)置15種滅菌方法（表1），選取3個(gè)類型茄子品種，每個(gè)品種3次重復(fù)，分3 d進(jìn)行。10月1日開始采集帶有生長點(diǎn)的幼嫩莖段，莖段長度為5～8 cm，每個(gè)品種采集39個(gè)莖段，3個(gè)品種共計(jì)117個(gè)莖段，分別裝在1 000 mL透明試劑瓶中。采樣后1、2、3 d采用第1種滅菌方法，每天每個(gè)品種取13個(gè)莖段進(jìn)行滅菌組培；之后繼續(xù)采集3個(gè)品種共計(jì)117個(gè)莖段，每天每個(gè)品種取13個(gè)莖段采用第2種滅菌方法進(jìn)行滅菌組培；以此類推，直到15種滅菌方法全部試驗(yàn)完畢。莖段組培10 d后統(tǒng)計(jì)染菌率。

1.2.2 莖段組培方法 提前配制MS基本培養(yǎng)基，主要成分：MS+3%蔗糖+7 g·L-1瓊脂+0.5 g·L-1活性炭，調(diào)節(jié)pH值為5.8，分裝在200 mL組培瓶中，每瓶40 mL。高溫121 ℃、高壓0.1 MPa下滅菌20 min。滅菌后及時(shí)放在超凈工作臺(tái)中通風(fēng)保存，待瓶內(nèi)基本無水滴時(shí)進(jìn)行莖段培養(yǎng)。

先用自來水將外植體莖段沖洗干凈，再在超凈工作臺(tái)中用表1所列滅菌方法進(jìn)行滅菌，最后用無菌水沖洗3次后轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基。1瓶培養(yǎng)基只轉(zhuǎn)接1個(gè)莖段，記錄品種名稱和轉(zhuǎn)接時(shí)間，放置在光照強(qiáng)度2 000 lx、光照14 h·d-1、溫度25 ℃的組培架上培養(yǎng)30 d后調(diào)查植株再生成活率。

植株再生成活率=（無菌苗數(shù)/轉(zhuǎn)接莖段數(shù)）×100%

1.2.3 綠茄莖段保存試驗(yàn) 采集綠茄莖段，分別保存在5、10、15、25 ℃避光恒溫箱里1、2、3 d后進(jìn)行莖段組培試驗(yàn)，選取滅菌方法13，即6% NaClO浸泡10 min、再用0.1% HgCl2浸泡10 min。組培10 d后統(tǒng)計(jì)染菌率，組培30 d后調(diào)查植株再生成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌方法對組培染菌率的影響

15種滅菌方法的染菌率差異明顯（表2）。采用滅菌方法7，即用2% NaClO浸泡10 min、再用0.1% HgCl2浸泡10 min，普通MS培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接紫圓茄莖段培養(yǎng)10 d后染菌率僅為9.2%；但該滅菌方法并不適用于紫長茄和綠茄。采用滅菌方法12，即用4% NaClO浸泡10 min、再用0.3% HgCl2浸泡10 min，普通MS培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接紫長茄莖段培養(yǎng)10 d后染菌率最低，為40.8%。采用滅菌方法13，即用6% NaClO浸泡10 min、再用0.1% HgCl2浸泡10 min，普通MS培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接綠茄莖段培養(yǎng)10 d后染菌率最低，為27.5%?？梢姡煌愋颓炎舆m用的滅菌方法也不同。這可能是因?yàn)椴煌愋偷那炎忧o段表面絨毛多少不一，抗氧化能力各有差異，導(dǎo)致使用同一種滅菌方法染菌率會(huì)有明顯差異。

由表2還可以看出，0.1% HgCl2是一種有效的殺菌劑，配合使用2%～6% NaClO可以達(dá)到較好的滅菌效果。

表2 不同滅菌方法下3種類型茄子莖段組培10 d后染菌率

2.2 不同滅菌方法對植株再生的影響

如表3所示，采用滅菌方法7處理的紫圓茄植株再生成活率最高，為64.5%；采用滅菌方法12處理的紫長茄植株再生成活率最高，為50.4%；采用滅菌方法13處理的綠茄植株再生成活率最高，為61.1%?？梢娙揪首畹偷臏缇椒▽?yīng)最高的植株再生成活率，證明降低染菌率是提高組培植株成活率的基礎(chǔ)，且試驗(yàn)的滅菌方法對外植體傷害性不大，不影響植株再生。

表3 不同滅菌方法下3種類型茄子莖段組培植株再生成活率

2.3 不同保存條件對綠茄莖段組培染菌率和植株再生成活率的影響

由表4可見，5 ℃下保存3 d內(nèi)的綠茄莖段培養(yǎng)10 d后染菌率在12%～16%之間，可以滿足試驗(yàn)要求。5 ℃下保存3 d內(nèi)的綠茄莖段植株再生成活率與其他處理差異顯著，植株再生成活率達(dá)到60%左右。可見低溫保存不僅可以降低染菌率，同樣可以提高植株再生成活率。染菌率和植株再生成活率成反比，說明低溫保存條件有利于外植體培養(yǎng)，降低染菌率的同時(shí)可以提高植株再生成活率。

表4 不同保存條件下的綠茄莖段染菌率和組培植株再生成活率

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)室組培接種外植體后經(jīng)過一段時(shí)間才會(huì)出現(xiàn)染菌現(xiàn)象，根據(jù)外植體攜帶菌的數(shù)量不同，染菌暴發(fā)的時(shí)間呈現(xiàn)階梯性。如果外植體接種10 d后沒有染菌，后期繼續(xù)培養(yǎng)就可以實(shí)現(xiàn)無菌植株再生，所以染菌率調(diào)查設(shè)置為接種后10 d。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，0.1% HgCl2是一種有效的殺菌劑，配合使用2%～6% NaClO可以達(dá)到較好的滅菌效果。不同類型茄子適用的滅菌方法不同。紫圓茄莖段適合采用的滅菌方法為：2% NaClO浸泡10 min，再用0.1% HgCl2浸泡10 min；紫長茄莖段適合采用的滅菌方法為：4% NaClO浸泡10 min，再用0.3% HgCl2浸泡10 min；綠茄適合采用的滅菌方法為：6% NaClO浸泡10 min，再用0.1%HgCl2浸泡10 min。通過進(jìn)一步進(jìn)行的綠茄莖段保存試驗(yàn)證明，樣品在低溫條件下保存有利于降低茄子莖段組培染菌率，其中最適保存條件為5 ℃保存3 d以內(nèi)，染菌率在20%以下，植株再生成活率保持在60%左右，可以滿足植株再生要求。通過茄子莖段組培可以實(shí)現(xiàn)良種擴(kuò)繁和工廠化生產(chǎn)，滿足科研和生產(chǎn)需要。

方巖巖，王益奎，王紅，李文嘉，黎炎.2013.紅茄子葉的不定芽誘導(dǎo)及植株再生.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，44（5）：751-754.

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胡凱，張立軍，白雪梅，崔玉娜，阮燕曄.2007.植物組織培養(yǎng)污染原因分析及外植體的消毒.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，35（3）：680-681.

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Preliminary Studies on Reducing Contamination Rate of Stem Segment Tissue Culture in Eggplant

QIAO Jun1，SHI Yao1，LIAN Yong2，LIU Fu-zhong2，CHEN Yu-hui2，ZHANG Ying2，LI Su-weng1，WANG Li-ying1*

（1Tianjin Kernel Vegetable Research Institute，State Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation，Tianjin 300384，China；2Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Eggplant stem segment tissue culture was easy to be contaminated.Three types of eggplant were selected to test the sterilization effects of 15 kinds of sterilization methods.The best sterilization method was judged according to the contamination rate and plant regeneration rate.The result indicated that different eggplant types were applicable to different sterilization methods.Purple round eggplant was suitable for sterilization method Ⅶ，which was soaked for 10 minutes in 2% NaClO before soaking for 10 minutes in 0.1% HgCl2.Purple long eggplant was suitable for sterilization method Ⅻ，which was soaked for 10 minutes in 4% NaClO before soaking for 10 minutes in 0.3% HgCl2.Green eggplant was suitable for sterilization method ⅩⅢ，which was soaked 10 minutes in 6% NaClO before soaking for 10 minutes in 0.1% HgCl2.The green eggplant stem segment storage experiment showed that low temperature storage could reduce contamination rate.The optimum storage condition was under 5 ℃ for 3 days，the contamination rate remained below 20% and regeneration rate was kept in about 60%.All these could meet the requirements of plant regeneration.

Eggplant；Stem segment；Tissue culture；Contamination rate

）：王利英，女，研究員，專業(yè)方向：茄子育種，E-mail：sun_hwg@126.com

天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目（201304020），黃瓜等主要蔬菜商業(yè)化育種技術(shù)研究與示范項(xiàng)目（2014BAD01B0802），天津市財(cái)政項(xiàng)目高端設(shè)施茄果類蔬菜新品種示范推廣項(xiàng)目

喬軍，男，助理研究員，專業(yè)方向：茄子生物育種，E-mail：sxdtqj886@126.com

（

2016-01-15；接受日期：2016-05-26