裴冬麗　　　　　　　劉筱斐　　　　　　李成偉

(植物與微生物互作重點實驗室(商丘師范學(xué)院)，商丘，476000)　(商丘市第一高級中學(xué))　(植物遺傳與分子育種重點實驗室(周口師范學(xué)院))

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楊樹白粉病病原菌鑒定1)

裴冬麗劉筱斐李成偉

(植物與微生物互作重點實驗室(商丘師范學(xué)院)，商丘，476000)(商丘市第一高級中學(xué))(植物遺傳與分子育種重點實驗室(周口師范學(xué)院))

對河南商丘地區(qū)的毛白楊白粉病菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。顯微觀察該病原菌無性和有性世代特征，初步鑒定為楊球針殼白粉菌(Phyllactiniapopuli)；對該病原菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列測定，該序列與GenBank中楊球針殼白粉菌的同源性為99%。

毛白楊；楊球針殼白粉菌；形態(tài)學(xué)鑒定；ITS序列

毛白楊(Populustomentosa)因其具有生長快、樹干挺拔、樹形優(yōu)美等特點，是優(yōu)良的造林綠化樹種之一，被廣泛應(yīng)用于城市綠化、速生材林、防護(hù)林等。楊樹白粉病發(fā)生較為普遍，病害發(fā)生嚴(yán)重時，引起葉片小，生長勢衰弱，影響綠化效果和樹木材質(zhì)。據(jù)研究報道，山西楊樹白粉菌主要由楊球針殼菌(Phyllactiniapopuli)侵染所致[1]，甘肅楓楊白粉菌由胡桃球針殼菌(P.juglandis)侵染所致[2]，內(nèi)蒙古楊樹白粉菌主要由楊球針殼白粉菌(P.populi)和鉤絲殼白粉菌(Uncinulamandshurica)侵染所致[3-4]。病原菌一般6—9月份致病，嚴(yán)重時使整個葉片呈白色，秋后形成閉囊殼，成熟后越冬。2013年6月，河南省商丘地區(qū)種植的毛白楊暴發(fā)了嚴(yán)重的白粉病，嚴(yán)重地塊發(fā)病率達(dá)到了80%～90%。筆者報道了河南商丘地區(qū)白粉病菌的發(fā)生，對其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析，為楊樹白粉病防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

供試植物材料為河南商丘師范學(xué)院校園內(nèi)種植的毛白楊。

1.2病原菌顯微形態(tài)鑒定

病原菌染色采用臺盼蘭染色法[5]。將感染葉片剪切后，浸沒于固定液中(V(無水乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)，固定脫色12 h；0.3%的臺盼蘭溶液染色葉片組織，于水浴鍋(70～80 ℃)中染色1 min后，葉片組織于染液中常溫染色12 h；用2.5 g·mL-1的水合三氯乙醛沖洗被染色的葉片組織3次，最后樣品可以于水合三氯乙醛中放置數(shù)月。顯微觀察時，制成水裝片。

病原菌水裝片制作：取新鮮發(fā)病葉片，挑取白粉菌的白粉層和閉囊殼，制成水裝片，在顯微鏡下觀察病菌的分生孢子、分生孢子梗、閉囊殼、子囊和子囊孢子的形態(tài)，并用分析軟件測量其大小。

1.3病原菌致病性鑒定

采集菌絲茂盛的病葉，采用接觸法，輕輕按壓接種至未染病區(qū)域健康的毛白楊嫩葉上，觀察其致病過程，與自然發(fā)病的楊樹白粉病癥狀比較，再次收集病原菌，進(jìn)行顯微形態(tài)學(xué)觀察。

1.4病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.4.1基因組的提取

采用CTAB法提取楊樹白粉菌DNA[6]。引物是核糖體ITS區(qū)段通用序列ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[7]。

1.4.2PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10×PCR反應(yīng)緩沖液2.0 μL，dNTP混合物(各2.5 mmol·L-1)1.6 μL，Mg2+(25 mmol·L-1)1.6 μL，上游及下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，Taq聚合酶(5 U·μL-1)0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，無菌水11.3 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.4.3產(chǎn)物純化與測序

切膠回收PCR產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒(TakaRa)純化產(chǎn)物，純化后產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，鑒定出陽性菌落，送南京金絲瑞生物科技有限公司測序。

1.4.4序列分析

測得楊樹白粉菌ITS序列于GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn搜索，發(fā)現(xiàn)與其高同源性的序列。利用Clustal X軟件和MEGA3.1軟件對相關(guān)序列進(jìn)行分析，基于Kimura-2-Parameter雙參數(shù)模型，采用鄰近接連法(N-J)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析親緣關(guān)系。

2　結(jié)果與分析

2.1病原菌形態(tài)特征

毛白楊白粉菌可生長于葉的兩面，發(fā)病初期葉片上出現(xiàn)圓形或不規(guī)則形白色斑點，后逐漸擴(kuò)散，嚴(yán)重時白色粉狀物(無性世代的分生孢子和菌絲體)可連成片，覆蓋整個葉片(圖1A)；后期病斑上產(chǎn)生黃色到黑褐色的小顆粒(有性世代的閉囊殼)，散生至聚生。

顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)特征。楊樹白粉菌分生孢子為寬棍棒形，(70～79)μm×(23～32)μm(圖1B)；閉囊殼球形，直徑160～190 μm；附屬絲針狀，基部膨大為球形，多為6～11根，長100～325 μm，為閉囊殼直徑的0.7～1.5倍(圖1C)；每個閉囊殼內(nèi)子囊8～20個，橢圓形，(45～90)μm×(25～45)μm；子囊內(nèi)子囊孢子通常為2個，卵形或橢圓形，黃橙色，(23～44)μm×(15～30)μm(圖1C)。依據(jù)其該病原菌顯微形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定為楊球針殼白粉菌[8]。

A．葉片上白粉菌菌斑；B.白粉菌菌絲和分生孢子(箭頭所指為分生孢子)；C.白粉菌閉囊殼(箭頭所指為含有2個子囊孢子的子囊)。比例尺為50 μm。

2.2病原菌致病性鑒定

摘取病葉，采用按壓接觸法接種至健康5株毛白楊嫩葉上，10～12 d后，葉片上開始發(fā)病，病癥與自然發(fā)病葉片癥狀相同；對接種后病斑進(jìn)行顯微形態(tài)學(xué)觀察，其形態(tài)結(jié)構(gòu)與接種病原菌相同。未接種的對照株不發(fā)病。

2.3病原菌分子生物學(xué)鑒定

以提取的毛白楊白粉病菌的基因組DNA為模板，用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得650 bp左右的目的片段(圖2)。測定該片段序列，長度為657 bp，BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，該病原菌ITS序列中1～30 bp為部分18 S rDNA，31～263 bp為ITS1區(qū)段序列，264～417 bp為5.8 S rDNA的全序列，418～599 bp為ITS2區(qū)段序列，600～657 bp為部分28 S rDNA序列。該序列于GenBank中序列登記號為KC357772。

1.2 000 bp Marker；2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.4ITS同源序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

楊樹白粉菌KC357772序列(菌株編號：SQbaiyang-1)于GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn，發(fā)現(xiàn)其與GenBank中登記的楊樹楊球針殼白粉菌的ITS序列(登記號：JQ250805)具有99%的同源性。下載與其高度同源的球針屬白粉菌ITS序列，應(yīng)用MEGA3.1軟件做近鄰歸群法分析。結(jié)果表明，依據(jù)ITS序列的不同，不同種球針屬白粉菌聚為2個大的分支，而該菌株與P.populi聚在一個大分枝下的小枝，自展支持率達(dá)100%。其它球針殼屬白粉菌因其寄主不同，分屬于不同的種，分別為棒球針殼(Phyllactiniaguttata)、梣球針殼(P.fraxini)、胡桃球針殼(P.juglandis)、薩蒙球針殼(P.salmonii)、柿生球針殼(P.kakicola)，說明了由于寄主范圍的特異性形成白粉菌不同的小生境，進(jìn)而激發(fā)了這些白粉菌的遺傳差異的產(chǎn)生[9]。

分析結(jié)果進(jìn)一步說明，來自河南商丘地區(qū)的楊樹白粉病病原菌是楊球針殼白粉菌。

圖3　依據(jù)ITS序列構(gòu)建的球針屬白粉菌N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹

3　結(jié)束語

世界上楊樹白粉菌報道共計3屬9種，楊樹白粉菌在我國山西、江西、甘肅、寧夏和內(nèi)蒙古等省市均有報道，主要由胡桃球針殼菌、楊球針殼白粉菌和鉤絲殼白粉菌3種白粉菌侵染所致[1-4]。河南省毛白楊白粉菌的報道對楊樹白粉病病原菌的防治具有一定的意義。本研究報道了河南商丘地區(qū)毛白楊白粉菌的發(fā)生，通過對白粉菌的無性和有性世代顯微形態(tài)學(xué)特征觀察，致病性鑒定和分子生物學(xué)鑒定，明確了該病原菌為楊球針殼白粉菌，并進(jìn)一步對白粉菌球針殼屬進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，指出了由于白粉菌針球菌屬寄主不同造成的小生境的差異，導(dǎo)致球針菌屬分化為不同的種來適應(yīng)不同的環(huán)境。

[1]王建明,賀運(yùn)春,李宏斌.山西白粉菌的種類、寄主及分布研究(I)[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1996,16(4):329-335.

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Identification of Powdery Mildew onPopulustomentosa//

Pei Dongli

(Key Laboratory of Plant-Microbe Interactions, Shangqiu Normal University, Shangqiu 47600, P. R. China); Liu Xiaofei(Shangqiu First Senior High School); Li Chengwei(Key Laboratory of Plant Genetics and Molecular Breeding, Zhoukou Normal University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(1)：100-102.

The experiment was conducted to test the morphological and molecular identification of powdery mildew onPopulustomentosa. It was identified asPhyllactiniapopuliby asexual generation and sexual generation characteristics by microscopic observation. The pathogen rDNA ITS was amplified and sequenced, which was with 99% identity withPhyllactiniapopulisequence from GenBank.

Populustomentosa；Phyllactiniapopuli； Morphological identification； ITS sequences

裴冬麗，女，1971年11月生，植物與微生物互作重點實驗室(商丘師范學(xué)院)，教授。E-mail：peidongli@126.com。

李成偉，植物遺傳與分子育種重點實驗室(周口師范學(xué)院)，教授。E-mail：lichengweiwau@hotmail.com。

2014年8月13日。

S763.15

1)國家自然科學(xué)基金項目(31571997、31071807)；河南省高等學(xué)校重點科研項目(13B210199、15A180019)。

責(zé)任編輯：程紅。