甄成　李淑娟

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

張玉雙　嚴(yán)善春　　孫小環(huán)　許艷玲　張雅奎

(東北林業(yè)大學(xué))　　　　　　　　　(大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院)

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藍(lán)莓種間雜交及雜交種子的無菌萌發(fā)1)

甄成李淑娟

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

張玉雙嚴(yán)善春孫小環(huán)許艷玲張雅奎

(東北林業(yè)大學(xué))(大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院)

為了培育適合北方高寒地區(qū)的藍(lán)莓雜交新品種，以藍(lán)莓栽培品種‘美登’、‘北藍(lán)’、‘黑珍珠’及大興安嶺野生藍(lán)莓為親本進(jìn)行了種間雜交。對雜種結(jié)實率、雜種果實質(zhì)量、雜交種子的質(zhì)量及雜交種子的萌發(fā)方法進(jìn)行研究，同時結(jié)合母本自然授粉的結(jié)實情況，探究藍(lán)莓不同雜交組合種間雜交的親和性。結(jié)果表明：藍(lán)莓不同種間雜交均可結(jié)實并得到雜交種子，但坐果率及單果種子數(shù)均低于自然授粉；不同種間雜交的親和性存在較大差異，栽培品種間雜交親和性較強(qiáng)，平均結(jié)實率為31.92%，其中‘北藍(lán)’和‘黑珍珠’正反交結(jié)實率分別達(dá)到42.86%和50.03%，野生藍(lán)莓與栽培品種間親和性較弱，平均結(jié)實率僅為7.32%；在倍性相同情況下，相同植株類型間親和性較強(qiáng)；雜交種子經(jīng)100 μg·g-1赤霉素處理，接種24 d內(nèi)平均出芽率達(dá)82.88%，其中‘黑珍珠’ב美登’組合出芽率達(dá)到100%。

藍(lán)莓；種間雜交；雜交種子；無菌萌發(fā)

藍(lán)莓(Blueberry)是杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vacciniodeae)藍(lán)色小漿果的總稱，為多年生落葉小灌木或常綠灌木，全世界約有400余種，主要分布于北半球的溫帶和亞熱帶，我國約有91個種、28個變種，主要分布于東北和西南地區(qū)[1]。其中大興安嶺野生藍(lán)莓產(chǎn)量占全國總量的70%以上，占世界野生藍(lán)莓總量的20%左右[2]。藍(lán)莓具有極高的經(jīng)濟(jì)價值，其果實含有花青素、有機(jī)酸等多種生理活性成分，具有防止腦神經(jīng)衰老、增強(qiáng)心臟功能、明目及抗癌等獨特功效，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[3]。

藍(lán)莓人工栽培已有百年歷史，但我國藍(lán)莓研究起步較晚。20世紀(jì)80年代以來，吉林農(nóng)大、中科院南京植物所、山東省果樹研究所等單位先后從美國、加拿大、澳大利亞、芬蘭等國家引入藍(lán)莓優(yōu)良品種100余個，并且對藍(lán)莓的栽培技術(shù)進(jìn)行了深入研究。但我國的藍(lán)莓育種工作仍相對薄弱，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的藍(lán)莓新品種極少[4]。此外，藍(lán)莓種子具休眠特性，自然條件下萌發(fā)困難。劉肖等[5]的研究顯示，藍(lán)莓種子細(xì)小，出芽率低，萌發(fā)時間長，雜交種子需要55 d才能出芽，且出芽率僅為4%。因此，必須找到更有效的方法解決藍(lán)莓種子出苗率低的難題。

本研究以3個引自國外的藍(lán)莓栽培品種及大興安嶺野生藍(lán)莓為親本進(jìn)行種間雜交，對不同雜交組合的結(jié)實率、果實質(zhì)量、種子數(shù)量及種子質(zhì)量進(jìn)行研究，在此基礎(chǔ)上，通過無菌萌發(fā)探索高效的種子育苗方法，旨在通過有性創(chuàng)造和無性利用對藍(lán)莓進(jìn)行遺傳改良，利用雜種優(yōu)勢改善其遺傳結(jié)構(gòu)，提高其耐寒性、坐果量和果品質(zhì)量，為我國北方高寒地區(qū)培育雜交新品種奠定基礎(chǔ)。

1　試驗地概況

雜交試驗在大興安嶺農(nóng)林科學(xué)院藍(lán)莓試驗基地進(jìn)行，該基地位于黑龍江省加格達(dá)奇市南7 km處。該地區(qū)屬寒溫帶大陸性季風(fēng)氣候，夏季清涼雨水較多，冬季漫長而嚴(yán)寒，春、夏、秋季短，年溫差較大。極端最低溫度-45.1 ℃，最高溫度37.3 ℃，年平均氣溫-1.4 ℃，降水量為481.9 mm，5—8月份占全年雨量的70%以上，無霜期109 d[6]。種子的無菌萌發(fā)試驗在林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))進(jìn)行。

2　材料與方法

本研究選用的藍(lán)莓雜交親本由大興安嶺農(nóng)林科學(xué)院提供，栽培品種‘美登’(‘Blomidon’)、‘北藍(lán)’(‘Northblue’)和‘黑珍珠’(‘Blackpearl’)由漿果研究室于2010年從大連莊河引種并定植于藍(lán)莓基地。這3個品種雖經(jīng)4～5年引種馴化，但仍需采用覆土措施才能安全越冬并開花結(jié)實，2012—2014年連續(xù)3年調(diào)查，3個品種的花期基本是在5月25日—6月15日；野生藍(lán)莓(Vacciniumuliginosum)是從大興安嶺野生分布區(qū)選優(yōu)并帶土挖回，定植在花盆內(nèi)，以備春季提早打破休眠，使其與3個栽培品種花期一致。雜交親本的栽培特性見表1。

表1　雜交親本的栽培特性

雜交組合設(shè)置：以3個栽培品種‘美登’、‘北藍(lán)’、‘黑珍珠’及野生藍(lán)莓為親本分別進(jìn)行正反交，共設(shè)置12個雜交組合。同時，分別以各雜交親本自然授粉為對照，每個品種分別標(biāo)記30朵。

套袋及控制授粉：控制授粉于2014年5月30日—6月6日進(jìn)行，當(dāng)各個藍(lán)莓品種達(dá)到始花期時，分別選取10～20株長勢好的母株，每株選取3～4個發(fā)育好的花序，每個花序保留3～4朵即將開放的花蕾。去雄時將整個花被用鑷子撕下來，保留子房和柱頭，套袋隔離。定期觀察柱頭的發(fā)育狀況，當(dāng)綠色的柱頭發(fā)亮，并有黏液滲出時即可授粉。從父本樹上選取盛開的花朵，當(dāng)看到黃色花粉散出時將其直接涂抹在母本柱頭上，每個柱頭重復(fù)授粉3次，每個雜交組合授粉100朵以上。授粉后繼續(xù)套袋，防止外源花粉污染，并掛好標(biāo)簽，標(biāo)注雜交組合及授粉日期，記錄授粉個數(shù)。當(dāng)子房膨大、柱頭萎蔫時摘袋，并于授粉后7、30、50 d分別對受精個數(shù)、結(jié)實個數(shù)及果實質(zhì)量等進(jìn)行調(diào)查，以授粉后7 d子房比原來膨大1/2為受精，受精率=(子房膨大個數(shù)/授粉個數(shù))×100%[7]；結(jié)實率=(獲得果實個數(shù)/授粉個數(shù))×100%。

果實采收及種子的儲藏：果實成熟時及時采收，每個組合分別采摘并做好標(biāo)記，裝入透氣網(wǎng)袋帶回實驗室。將采收的果實分別平鋪在桌面上，保持室內(nèi)通風(fēng)，存放15 d左右待種子完成生理后熟收集種子，選取飽滿種子在室內(nèi)陰干1～2 d，密封后放置冰箱-20 ℃保存。

雜交種子的無菌萌發(fā)：將對照種子(親本)分批次在超凈臺上進(jìn)行消毒處理，經(jīng)70%酒精消毒20 s、3%次氯酸鈉處理7～8 min、無菌水清洗3遍，然后放入小三角瓶中，密封后在25 ℃、120 r·min-1的條件下震蕩2 d，無菌條件下每隔3～4 h更換一次無菌水。然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、50、100、150 μg·g-1的赤霉素溶液浸泡1 d，倒掉溶液，將種子用無菌濾紙吸干表面水分，分別接種于無激素添加的萌發(fā)培養(yǎng)基中，每個處理重復(fù)3次，每次接種30粒種子，培養(yǎng)溫度為(24±1)℃，暗室培養(yǎng)。將對照組篩選出的最優(yōu)方案用于雜交種子的無菌萌發(fā)。

3　結(jié)果與分析

3.1親本自然授粉

親本的自然授粉結(jié)實能力是影響雜交親和性的重要因素之一，選擇自然授粉狀態(tài)下結(jié)實率高的品種作母本有利于提高雜交成功率[8]。由表2可知，本研究中各親本的自然授粉結(jié)實率差異不明顯，其中3個栽培品種結(jié)實率都在80%以上，野生藍(lán)莓結(jié)實率為73.3%，且各品種成熟果實形態(tài)正常，同一品種內(nèi)果實質(zhì)量相差不明顯，種子發(fā)育飽滿，單果種子數(shù)量多，由此說明這些品種本身育性較好。

3.2不同雜交組合的受精結(jié)實

研究顯示，與藍(lán)莓品種自然授粉相比，種間雜交各組合受精率和坐果率均較低，且不同種間雜交存在一定差異。由表3可知，3個藍(lán)莓栽培品種間正反交受精率平均達(dá)到65.42%，結(jié)實率平均為31.92%，其中‘北藍(lán)’、‘黑珍珠’正反交結(jié)實率相對較高，平均結(jié)實率分別達(dá)到42.86%和50.03%，說明‘北藍(lán)’和‘黑珍珠’雜交親和性強(qiáng)；野生藍(lán)莓與3個栽培品種正反交平均受精率為13.57%，平均結(jié)實率僅為7.32%，說明野生藍(lán)莓與栽培品種間雜交親和性不強(qiáng)。但野生藍(lán)莓與美登正反交結(jié)實率明顯高于其與‘北藍(lán)’和‘黑珍珠’正反交結(jié)實率，暗示在倍性相同情況下，相同類型植株間的雜交親和性更好。由表3還可以看出，受精率高的組合坐果率不一定高，例如，以‘美登’為母本的雜交組合受精率較高，但結(jié)果率卻偏低，說明受精后胚的發(fā)育因親本組合不同而異。此外，同一對親本的正交和反交結(jié)實率也有較大差異，例如，‘美登’和‘北藍(lán)’的正交結(jié)實率僅為其反交結(jié)實率的1/2，所以，在雜交育種中，可通過正反交設(shè)計尋找親和性更強(qiáng)的雜交組合，以提高雜種結(jié)實率和種子質(zhì)量。

表2　各藍(lán)莓親本自然授粉結(jié)實情況

表3　不同雜交組合受精率、結(jié)實率及平均單果質(zhì)量

從雜交果實的單果質(zhì)量來看，各雜交組合果實的單果質(zhì)量多數(shù)與母本相似，這說明雜種果實特性受母本影響較大，但單憑果實質(zhì)量這一性狀來判斷是否具有雜種優(yōu)勢還為時尚早，要等到雜種苗期、甚至開花結(jié)實后才能做出準(zhǔn)確判斷。

3.3雜交種子數(shù)量與質(zhì)量

在所有雜交組合中，共獲得雜交果實292個、雜交種子2 391粒，其中栽培品種間獲得雜種果實227個，平均單果種子數(shù)8.27粒，而野生藍(lán)莓與各栽培品種間獲得雜交果實65個，平均單果種子數(shù)為6.20粒，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于栽培品種間的平均種子數(shù)，說明藍(lán)莓栽培品種間雜交親和性較強(qiáng)，而野生藍(lán)莓與栽培品種雜交親和性較弱。另外，在野生和栽培品種雜交中，野生與‘美登’雜交的平均種子數(shù)明顯多于野生與另兩個栽培品種，說明同為矮叢植株的‘美登’和野生藍(lán)莓的親和性更強(qiáng)，這與受精率、結(jié)實率的分析結(jié)果相一致。

通過與親本進(jìn)行對比，多數(shù)雜交種子質(zhì)量與母本相近，例如，1-2、1-3兩組合雜交種子質(zhì)量與母本‘美登’(0.292 mg)相近;2-1、2-3兩組合雜交種子質(zhì)量與母本‘北藍(lán)’(0.378 mg)相近;3-1、3-2兩組合雜交種子質(zhì)量與母本‘黑珍珠’(0.334 mg)相近。然而以野生藍(lán)莓為母本，3個栽培品種為父本的雜交種子質(zhì)量比母本野生藍(lán)莓(0.285 mg)小，例如，0-1、0-2、0-3三個組合種子質(zhì)量均小于母本，究其原因可能是野生與幾個栽培品種間雜交親和性不強(qiáng)，造成種子發(fā)育不良，種粒不飽滿，這樣的種子利用常規(guī)播種方法很難成苗。

表4　各雜交組合獲得的雜交種子數(shù)量及質(zhì)量

3.4雜交種子的無菌萌發(fā)

從表5可以看出，組培無菌萌發(fā)可以顯著提高藍(lán)莓種子的出芽率，并極大地縮短發(fā)芽時間。50、100、150 μg·g-1的赤霉素溶液均能促進(jìn)種子萌發(fā)，當(dāng)赤霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 μg·g-1時，10 d開始出芽，出芽率為67.98%；當(dāng)赤霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 μg·g-1時，5 d開始出芽，出芽率為88.50%；當(dāng)赤霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為150 μg·g-1時，8 d開始出芽，出芽率為82.35%。據(jù)此確定雜交種子的赤霉素處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 μg·g-1。

由表6可知，經(jīng)100 μg·g-1赤霉素處理后，各雜交種子無菌萌發(fā)的始出芽時間為5～7 d，持續(xù)出芽14～17 d。不同雜交組合的出芽時間差異不明顯，且各雜交種子出芽率均較高，平均出芽率為80.55%，其中野生與栽培品種組合的平均出芽率為70.93%，低于平均水平；而栽培品種組合的平均出芽率為90.16%，高于平均水平，其中‘黑珍珠’ב美登’組合的雜交種子接種10 d大部分出芽，接種20 d出芽率達(dá)100%，說明栽培品種間雜交親和性較好，種子發(fā)育較好?！谡渲椤痢赖恰s交組合種子萌發(fā)后的長勢見圖1。

表5　不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)赤霉素溶液對種子萌發(fā)的影響

表6　各雜交組合種子萌發(fā)時間及出芽率

A.雜交種子接種10 d；B.雜交種子接種20 d。

4　結(jié)束語

前人研究顯示，六倍體草莓在種間雜交時果實能膨大坐果，但不一定有可育種子[9]。本研究結(jié)果表明，各栽培品種間或野生與栽培品種間雜交均可結(jié)實并得到雜交種子，但不同雜交組合的坐果率及單果種子數(shù)存在較大差異。藍(lán)莓栽培品種間雜交結(jié)實率相對較高，平均單果種子數(shù)8.27粒；而野生藍(lán)莓與栽培品種間雜交結(jié)實率相對較低，除了野生與‘美登’正反交組合外，野生與其他品種雜交組合平均單果種子數(shù)均低于6.00粒，這說明栽培品種間雜交親和性較強(qiáng)，而野生藍(lán)莓與栽培品種間親和性相對較弱，如何提高野生藍(lán)莓與栽培品種間親和性還有待進(jìn)一步研究。此外，‘北藍(lán)’與‘黑珍珠’正反交結(jié)實率在栽培品種雜交組合中達(dá)到最高，分別為50.00%和42.86%；野生與‘美登’間正反交結(jié)實率在野生與栽培品種雜交組合中也達(dá)到最高，分別為17.51%和10.22%，這從另一側(cè)面暗示，在倍性相同基礎(chǔ)上，相同植株類型間(同是半高叢或矮叢)雜交親和性更強(qiáng)，并且同一雜交組合中正、反交的親和性也存在較大差異。因此，今后開展藍(lán)莓種間雜交育種工作時，既要考慮植株類型的搭配，又要考慮正反交組合的設(shè)計，才能從中篩選出親和性更強(qiáng)的雜交組合，從而提高雜種結(jié)實率和種子質(zhì)量。

藍(lán)莓種子具有較強(qiáng)的休眠特性，且體積微小，直播發(fā)芽率低，不易成活[10]。劉肖等[5]使用400 mg·L-1赤霉素浸泡雜交種子24 h后播種，種子發(fā)芽率為41%，且耗時長；王光野等[11]先后用35%鹽酸、200 mg·L-1赤霉素溶液處理藍(lán)莓種子，發(fā)芽率僅為15%；孫書偉等[12]采用組培方法對藍(lán)莓種子進(jìn)行萌發(fā)試驗，種子發(fā)芽率最高達(dá)16.9%。本研究利用組培方法對不同雜交組合的藍(lán)莓種子進(jìn)行無菌萌發(fā)，各組合雜交種子的出芽率均達(dá)到66.67%，且萌芽時間短，接種24 d內(nèi)平均出芽率達(dá)82.88%，很大程度上克服了藍(lán)莓種子出芽率低、耗時長的障礙，解決了藍(lán)莓育苗的技術(shù)難題。因此，本研究不僅為藍(lán)莓雜交新品種的培育奠定了基礎(chǔ)，而且對其他休眠種子的研究也有一定借鑒意義。

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Intervarietal Crosses and Hybrid Seedlings Aseptic Germination of Blueberry//

Zhen Cheng, Li Shujuan

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Zhang Yushuang, Yan Shanchun(Northeast Forestry University); Sun Xiaohuan, Xu Yanling, Zhang Yakui(Forestry and Agriculture of Academy in the Daxing’an Mountains)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(1)：52-55.

In order to cultivate blueberry hybrid varieties for the cold situation in northern area, we selected Blomidon, Northblue, Blackpearl andVacciniumuliginosumas parents to perform the intervarietal crosses, and studied the fruit setting rate, fruit weight, thousand-grain weight and budding rate of the hybrid seedlings. Compared with the natural pollination, we evaluated the cross affinity of different blueberry cultivars. Fruit and hybrid seeds can be got from different interspecific hybridization of blueberries, but the fruit setting rate and fruit seeds were lower than those of control. The cross affinity of cultivars was better than that of wild blueberry and cultivars. The fruit setting rate of cultivars was 31.92%, and those of ‘Northblue×Blackpearl’ and ‘Blackpearl×Northblue’ were up to 42.86% and 50.03%, respectively, while the cultivars and wild blueberry was only 7.32%. The cross affinity of the same plant type fit well under the same ploidy. For 24-d cultivation, the budding rate was up to 82.88% on average by 100 μg·g-1GA3. The budding rate of ‘Blackpearl×Blomidon’ was up to 100%.

Blueberry; Intervarietal crosses; Hybrid seeds; Aseptic germination

甄成，女，1990年11月生，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，碩士研究生。E-mail:13054298510@163.com。

李淑娟，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)), 高級工程師。E-mail:lishujuan@126.com。

2015年7月23日。

S334.2+5

1)林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))創(chuàng)新項目(2015B03)、大興安嶺行署科技局博士后項目 (2012A02)。

責(zé)任編輯：任俐。