鄒雪艷，張于濤，王　朋，董　爍，郭靜玉，何建英*

(1.河南大學 納米材料工程研究中心，河南 開封 475004；　2.河南大學 民生學院，河南 開封 475004；3.河南大學 醫(yī)學院,河南 開封 475004；　4. 河南大學 化學化工學院,河南 開封 475004)

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納米SiO2親和吸附劑的制備及性能

鄒雪艷1，張于濤2，王朋2，董爍3，郭靜玉4，何建英4*

(1.河南大學 納米材料工程研究中心，河南 開封 475004；2.河南大學 民生學院，河南 開封 475004；3.河南大學 醫(yī)學院,河南 開封 475004；4. 河南大學 化學化工學院,河南 開封 475004)

采用水熱法一步合成了巰基納米二氧化硅(SiO2-SH)，隨后在其表面修飾亞氨基二乙酸基團(-IDA)得到了SiO2-SH/IDA，利用-SH和-IDA雙官能團更多的吸附溶液中的Ni2+，從而得到SiO2-SH/IDA-Ni2+納米親和吸附劑. 制備的親和吸附劑可直接用于六聚組氨酸為標簽的(His-tagged)融合蛋白的分離純化. 利用TEM、FT-IR、TG、SDS-PAGE等大型儀器表征了樣品的形貌、結(jié)構(gòu)及親和分離能力. 結(jié)果表明制備的SiO2-SH/IDA-Ni2+納米親和吸附劑平均粒徑為60 nm，對His-tagged蛋白具有較好的特異性和較低的檢測限(約為1.9×10-5mol/L)，且該吸附劑再生能力較強，再生3次后對目標蛋白仍具有較好的分離效果.

納米二氧化硅；功能化；His-tagged；親和分離

蛋白質(zhì)作為生物體內(nèi)的基礎(chǔ)物質(zhì)，于生物體具有極為重要的作用. 為了進一步研究特定蛋白的物理化學性能，首要的就是對該目標蛋白進行分離純化[1]. 目前蛋白質(zhì)分離提純的常規(guī)方法有：色譜法、毛細管電泳法、反膠團萃取法、鹽析法、層析法、累加進樣分離法、超濾技術(shù)等[2-5]. 其中親和層析分離技術(shù)是一種成本低廉、選擇性好、分離效率高的蛋白質(zhì)分離手段[6-8]. 它的主要原理是親和吸附劑的配體分子與目標蛋白進行特異性結(jié)合，從而達到分離提純目標蛋白的目的. 盡管如此，它也存在放大困難、操作繁瑣、層析柱易被污染和堵塞等缺點. 近年來將無機微/納米材料用作親和沉淀的載體是近年來的研究熱點[9-10]. BAE等[11]在SiO2納米管表面修飾了Au納米顆粒，再以Au顆粒為橋梁，實現(xiàn)對半胱氨酸(Cys)及含有Cys片段的其它蛋白的分離純化. XU等[12]在磁性Fe2O3表面偶聯(lián)多巴胺分子，用于對His-tagged融合蛋白的分離純化，該磁性納米顆粒具有高度的專一性，并可回收再利用. 由于這些親和吸附劑通常只含有只有一種螯合基團，吸附Ni2+能力相對較弱，本文中我們采用生物相容性好的納米二氧化硅為載體[13-15]，以-SH和-IDA雙功能化螯合基團為有效基團，可以更多的吸附溶液中的Ni2+，從而更好的分離純化His-tagged融合蛋白.

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

巰基丙基三甲氧基硅烷(MPS，95%)購于Alfa-Aesar公司；十六烷基三甲基氯化銨(CTAC，≥98.0%)購于國藥集團化學試劑有限公司；亞氨基二乙酸(IDA，≥98%)和三乙醇胺(TEA，≥99.0%)，γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS，≥97%)均購于阿拉丁公司；氯化鎳(NiCl2·6H2O，98%)，無水乙醇(C2H5OH，≥99.7%)和氫氧化鈉(NaOH，≥96%)均購于天津市科密歐化學試劑有限公司；正硅酸乙酯(TEOS，99%)購于天津市福晨化學試劑廠；濃鹽酸(HCl，37%)購于洛陽昊華化學試劑廠.

樣品的形貌組成分別使用透射電子顯微鏡(TEM，日本電子株式會社)、熱重分析儀(TG，Merrler-Toledo Instruments公司)、傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR，美國尼高力公司)及原子吸收分光光度計(AAS，日本日立公司)進行檢測. 捕獲的His-tagged蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(SDS-PAGE，Power PAC 300，鄭州寶賽科貿(mào)有限公司)，穩(wěn)壓電壓是70 V，分離電壓是120 V.

1.2實驗過程

1.2.1合成SiO2-SH樣品

取17 mL CTAC于50 mL三口瓶內(nèi)，加入2.8 mL無水乙醇，室溫攪拌10 min；加入1.1 mL TEA，繼續(xù)攪拌20 min升溫至60 ℃，緩慢滴加1.5 mL TEOS和MPS混合液(體積比1∶10)，持續(xù)反應(yīng)3 h后轉(zhuǎn)入50 mL高壓反應(yīng)釜中，110 ℃反應(yīng)48 h，冷至室溫后離心洗滌干燥，即得SiO2-SH樣品.

1.2.2合成SiO2-SH/IDA樣品

取20 mL IDA溶液于三口瓶中，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)溶液pH至11，冰浴條件下滴加2 mL GPTMS，攪勻后升溫至65 ℃反應(yīng)12 h. 取3 mL上述產(chǎn)物用6 mol/L HCl調(diào)溶液pH至2，加入0.1 g SiO2-SH樣品，攪勻后升溫至90 ℃繼續(xù)反應(yīng)3 h. 反應(yīng)結(jié)束后得到的沉淀充分洗滌后即得SiO2-SH/IDA樣品，60 ℃烘干后備用.

1.2.3合成SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品

取50 mL 2 mol/L NiCl2溶液于試管中，加入3 mg SiO2-SH/IDA樣品，分散均勻后25℃振蕩反應(yīng)2 h，沉淀充分洗滌后即得SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品，樣品分散在1 mL 25%的乙醇中備用.

1.2.4His-tagged 蛋白的分離方案

將SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品用破菌buffer(20 mmolL-1Tris-HCl，含0.2 mol·L-1NaCl)洗滌數(shù)次后沉淀中直接加入1 000 μL細胞裂解液，于4 ℃搖床上孵育2 h；孵育后的樣品用上述破菌 buffer洗滌數(shù)次以除去表面物理吸附的蛋白. 隨后加入300 μL一定濃度的咪唑進行洗脫，洗脫后的蛋白用于SDS-PAGE分析. 將洗脫后的親和吸附劑用EDTA和NiCl2溶液處理后，重復(fù)以上步驟3次，以檢測其再生后分離目標蛋白的能力.

2　結(jié)果與討論

2.1TEM表征分析

圖1為SiO2-SH/IDA樣品的透射圖及粒徑分布圖. 從圖1a、1b可以看出，制備的樣品為實心微球，平均粒徑為108 nm，分散性好(圖1c).

2.2FT-IR表征分析

圖2為合成的SiO2-SH(1)和SiO2-SH/IDA(2)樣品的FT-IR圖. 從圖中可以看出，3 428 cm-1為樣品表面吸附水的-OH的吸收峰；1 124 cm-1、804 cm-1、694 cm-1處對應(yīng)SiO2的特征吸收峰：1 124 cm-1歸屬于Si-O-Si的反對稱伸縮吸收峰，804 cm-1為Si-O對稱伸縮振動吸收峰；在2 550 cm-1處為-SH的伸縮振動，說明制備的樣品表面含有-SH. 從圖2曲線2可以看出，2 930 cm-1為-IDA與GPTMS上的亞甲基的伸縮振動峰，694 cm-1為IDA中-NH鍵的伸縮振動峰，說明-IDA與-SH均修飾在了SiO2的表面[16-17].

圖1　制備SiO2-SH/IDA樣品的TEM圖(a,b)和粒徑分布圖(c)Fig.1　TEM images (a,b) and size distribution histogram (c) of the prepared SiO2-SH/IDA

圖2　制備SiO2-SH (1)和SiO2-SH/IDA (2)樣品的FT-IR圖Fig.2　FT-IR spectra of the prepared SiO2-SH (1) and SiO2-SH/IDA (2) samples

2.3TG曲線分析

圖3為制備SiO2-SH(1)和SiO2-SH/IDA(2)的TG圖，從圖3中可以看出樣品從室溫～800 ℃有明顯的失重，其中主要的失重出現(xiàn)在220～700 ℃，從曲線1可以看出樣品SiO2-SH的失重率約為52.3%，這主要為表面巰基的熱分解. 從曲線2可以看出，樣品SiO2-SH/IDA的失重率為57.4%，這主要是由于表面修飾的-SH和-IDA基團的熱分解所致，說明二氧化硅載體表面具有較高的官能團密度.

圖3　制備SiO2-SH(1)和SiO2-SH/IDA (2)樣品的TG曲線Fig.3　TG curves of the prepared SiO2-SH (1) and SiO2-SH/IDA (2) samples

2.4分離蛋白示意圖

圖4為SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品的制備以及分離His-tagged TRX融合蛋白的示意圖. 首先，采用TEOS與MPS共同水解合成了SiO2-SH納米微球. 隨后在SiO2-SH微球表面修飾-IDA基團形成SiO2-SH/IDA復(fù)合微球，然后繼續(xù)吸附Ni2+形成SiO2-SH/IDA-Ni2+親和吸附劑. 最后用制備的SiO2-SH/IDA-Ni2+納米吸附劑直接應(yīng)用于His-tagged TRX融合蛋白的分離純化. 文中采用-SH和-IDA長短相間的兩種連接臂，一定程度上減小了分離蛋白時的空間位阻，從而可以更好地實現(xiàn)對目標蛋白的親和分離.

圖4　SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品的制備及其分離His-tagged TRX融合蛋白示意圖Fig.4　Synthesis of the SiO2-SH/IDA-Ni2+ sample and separation of His-tagged TRX protein by the prepared sample

2.5SDS-PAGE分析

圖5為SiO2-SH/IDA-Ni2+親和吸附劑在不同咪唑濃度(0.5～3 mol/L)洗脫條件下分離His-tagged蛋白的SDS-PAGE圖. 泳道1～2為Marker與混合蛋白，泳道3～6咪唑濃度分別為0.5、1、2及3 mol/L. 從圖5中可以看出，隨著咪唑洗脫濃度的增加，洗脫目標蛋白的量略有變化，當咪唑濃度為1 mol/L時，洗脫下來目標蛋白已達到最大，且?guī)缀鯖]有雜蛋白. 因此，咪唑的最佳洗脫濃度為1 mol/L.

圖5　不同濃度咪唑洗脫條件下SiO2-SH/IDA-Ni2+親和吸附劑分離His-tagged TRX融合蛋白的SDS-PAGE圖Fig.5　SDS-PAGE analysis of purified His-tagged TRX proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+ adsorbent

為測試制備SiO2-SH/IDA-Ni2+親和吸附劑對目標蛋白的檢測限，我們對不同濃度梯度的His-tagged TRX蛋白進行檢測. 圖6中泳道1～4為不同His-tagged TRX濃度加入量分離蛋白的SDS-PAGE圖：泳道1，1.9×10-4mol/L；泳道2，1.9×10-5mol/L；泳道3，1.9×10-6mol/L；泳道4，1.9×10-7mol/L. 從泳道1～4可以看出，當His-tagged TRX濃度在1.9×10-4～1.9×10-5mol/L時，制備的吸附劑對目標蛋白均有較好的檢測效果，而當?shù)鞍诐舛鹊陀?.9×10-6mol/L時，該吸附劑不能檢測到目標蛋白，說明制備的SiO2-SH/IDA-Ni2+吸附劑對His-tagged TRX蛋白的檢測限至少為1.9×10-5mol/L，具有較好的響應(yīng)效果.

圖6　不同梯度的His-tagged TRX蛋白下SiO2-SH/IDA-Ni2+親和吸附劑分離His-tagged TRX蛋白的電泳圖Fig.6　SDS-PAGE of His-tagged TRX protein separated by prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+ adsorbent in different concen-tration of His-tagged TRX proteins

為了驗證制備SiO2-SH/IDA-Ni2+吸附劑再生后分離His-tagged TRX蛋白的能力，我們采用EDTA和NiCl2溶液對親和吸附劑進行預(yù)處理. 圖7為SiO2-SH/IDA-Ni2+吸附劑分離His-tagged TRX蛋白的SDS-PAGE圖. 其中，泳道1為Marker，泳道2為混合蛋白，泳道3、4、5分別為第一、二、三次再生后親和吸附劑對His-tagged TRX蛋白分離的電泳圖. 從圖7可以看出，再生三次后的微球，仍然對混合蛋白中的His-tagged TRX蛋白有比較高的分離能力，說明制備的SiO2-SH/IDA-Ni2+吸附劑具有較強的再生能力.

圖7　SiO2-SH/IDA-Ni2+吸附劑再生后分離His-tagged TRX蛋白的SDS-PAGE圖Fig.7　SDS-PAGE analysis of purified His-tagged TRX proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+ adsorbent for three times

3　結(jié)論

利用水熱反應(yīng)合成了巰基納米二氧化硅(SiO2-SH). 然后在其表面修飾亞氨基二乙酸基團(-IDA)，形成了SiO2-SH/IDA雙功能團納米微球，吸附Ni2+后用于His-tagged融合蛋白的特異性分離，該納米吸附劑對目標蛋白具有較低的檢測限及較強的再生能力，具有潛在的市場價值.

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[責任編輯：劉紅玲]

Preparation and properties of nano-SiO2affinity adsorbent

ZOU Xueyan1, ZHANG Yutao2, WANG Peng2, DONG Shuo3, GUO Jingyu4, HE Jianying4*

(1.EngineeringResearchCenterforNanomaterials,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China; 2.HenanUniversityMinshengCollege,Kaifeng475004,Henan,China; 3.HenanUniversitySchoolofMedicine,Kaifeng475004,Henan,China; 4.Collegeofchemistryandchemicalengineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Silica nanospheres (NSs) with thiol group (SiO2-SH) were synthesized by the hydrothermal method. Then the iminodiacetic acid group (-IDA) was modified on the surface of SiO2-SH to obtain SiO2-SH/IDA NSs. Subsequently the Ni2+ions in the solution were adsorbed by both -SH group and -IDA group of SiO2-SH/IDA NSs, which could adsorb more Ni2+on the surface of these NSs to get SiO2-SH/IDA-Ni2+adsorbent. Then the adsorbent was used to separate His-tagged proteins. The morphology, composition and affinity separation properties were detected by TEM, FT-IR, TG and SDS-PAGE. The results show that the average size of the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+adsorbent is about 60 nm, which can separate the His-tagged protein specificly and has lower detection limit (1.9×10-5mol/L) and the better regeneration ability after three times reuse.

nanometer silica; functionalization; His-tagged; affinity separation

1008-1011(2016)04-0482-05

2015-05-15.

國家自然科學基金(21271062), 河南大學民生學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(MSCXCY2015004).

鄒雪艷(1981-), 女, 實驗師, 研究方向為復(fù)合納米材料的制備及其對蛋白質(zhì)的親和分離.*通訊聯(lián)系人, E-mail:hjy@henu.edu.cn.

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