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        二氧化碳氣腹對大鼠肝臟造成的缺血再灌注損傷及異丙酚促進HO-1表達的保護作用

        2016-08-15 06:25:00鄒海波孫曉峰
        實用藥物與臨床 2016年3期
        關(guān)鍵詞:異丙酚二氧化碳肝臟

        鄒海波,楊 竹,王 穎,孫曉峰

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        二氧化碳氣腹對大鼠肝臟造成的缺血再灌注損傷及異丙酚促進HO-1表達的保護作用

        鄒海波,楊竹,王穎,孫曉峰*

        沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院麻醉科,沈陽 110000

        [摘要]目的探討實驗室二氧化碳(CO2)模擬腹腔鏡高氣腹壓力對大鼠肝臟造成的缺血再灌注損傷以及異丙酚的保護作用和機制。方法選用280~320 g的Wistar成年雄性大鼠,實驗前各組大鼠禁食12 h,可自由飲水。選取雄性大鼠48只,隨機分成4組,每組12只:對照組(A組)、缺血組(B組)、再灌注組(C組)、異丙酚組(D組),觀察各組天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及血紅素氧合酶1(HO-1)表達的變化。結(jié)果B組、C組與A組比較,MDA逐漸增高,而SOD逐漸降低,HO-1表達反應(yīng)性逐漸增加,HE染色和免疫組化提示損傷逐漸加重;D組與B組、C組比較,MDA指標明顯降低,SOD明顯增高,HO-1表達繼續(xù)增加,HE染色和免疫組化可見損傷明顯減輕。結(jié)論CO2氣腹可以造成大鼠肝臟缺血再灌注損傷;缺血和再灌注是不同的損傷過程,即:缺血狀態(tài)解除后,對大鼠肝臟損傷并未停止,反而由于再灌注過程而進一步加重;異丙酚可通過促進HO-1的表達機制而發(fā)揮其保護性作用。

        [關(guān)鍵詞]二氧化碳;缺血再灌注損傷;肝臟;異丙酚;血紅素氧合酶1

        0 引言

        在外科領(lǐng)域,隨著人們對微創(chuàng)理念的認可,腹腔鏡手術(shù)脫穎而出,憑借其微創(chuàng)、美觀、術(shù)后恢復(fù)快等諸多優(yōu)點而倍受醫(yī)生和患者的喜愛,因此在臨床外科手術(shù)中的應(yīng)用越來越廣泛,但CO2高氣腹壓對腹腔臟器帶來的諸多不良影響也日漸引起了世人的關(guān)注。異丙酚作為一種臨床麻醉常用藥,具有抗氧化應(yīng)激作用,它對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用及其機制目前還存在爭議。本實驗以Wistar大鼠肝臟為實驗靶點,觀察氣腹前后各個功能指標的變化,從而探討二氧化碳氣腹對大鼠肝臟造成的缺血再灌注損傷及異丙酚促進HO-1表達的保護作用。

        1 材料與方法

        1.1動物分組及動物模型模型:實驗前禁食12 h,自由飲水,實驗時將大鼠固定,經(jīng)大鼠腹腔給予10%水合氯醛(3 mL/kg)進行麻醉,腹部插入氣腹針,氣腹壓力設(shè)置20 mmHg,頸動脈剖開插管待抽血。分組:選用成年Wistar雄性大鼠48只,體重280~320 g,隨機分成4組,每組12只。A組(對照組):經(jīng)尾靜脈穿刺置管,泵注生理鹽水1 h[10 mL/(kg·h)];B組(缺血組):在A組基礎(chǔ)上給予20 mmHg氣腹壓力1 h;C組(再灌注組):在B組的基礎(chǔ)上,放開氣腹0.5 h;D組(異丙酚組):經(jīng)尾靜脈泵注異丙酚(購于阿斯利康A(chǔ)straZeneca公司,批號CD495)10 mg/(kg·h)(用生理鹽水進行10倍稀釋),同時給予20 mmHg氣腹壓1h后放開氣腹后0.5 h。

        1.2待檢指標超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA):取肝臟組織液氮中冷凍,待檢MDA(硫代巴比妥酸比色法測定,試劑盒:購于南京建成生物工程研究所)和SOD(試劑盒:購于南京建成生物工程研究所,黃嘌呤氧化酶法測定);應(yīng)用HE染色肺臟組織學(xué)變化;應(yīng)用免疫組化檢測HO-1的表達;應(yīng)用Realtime PCR檢測HO-1 mRNA;應(yīng)用Western印跡檢測肝組織HO-1表達(兔抗大鼠HO-1多克隆抗體:購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒:購于武漢博士德公司;鏈霉親合素-生物素復(fù)合物免疫組化試劑盒:購于武漢博士德公司)。

        2 結(jié)果

        2.1生化指標實驗分為4組,每組大鼠12只,大鼠肝缺血再灌注損傷時組織中SOD、MDA、ALT、AST的變化見表1。

        表1 大鼠肝缺血再灌注損傷時組織中SOD、MDA、ALT、AST的變化結(jié)果(n=12)

        注:*與A組相比,P<0.05;,+與B組相比,P<0.05;#與C組相比,P<0.05

        2.2HE染色缺血組圖片中,可見肝細胞出現(xiàn)了大量變性,甚至偶可見到壞死的肝細胞;再灌注組圖片中,可見肝細胞壞死數(shù)量明顯增多,證明再灌注后損傷明顯加重;異丙酚組圖片中,肝細胞變性和死亡的數(shù)量減少,損傷程度明顯減輕。見圖1。

        圖1 肝HE染色

        2.3免疫組化對照組中,HO-1蛋白表達較少,但在缺血組可以看到HO-1表達明顯增多,再灌注發(fā)生后HO-1表達持續(xù)增加,特別是在異丙酚組,HO-1蛋白密集排列并發(fā)生“聚集現(xiàn)象”,表明這是I/R發(fā)生以后,異丙酚促使HO-1表達量增加所致。見圖2。

        圖2 肝免疫組化

        2.4Realtime PCR檢測HO-1mRNA在應(yīng)激狀態(tài)下可以表達一種保護性蛋白HO-1,在A組、B組、C組、D組中的表達逐漸增高(B組、C組與A 組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05;D組和C組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01),見圖3。

        圖3 Realtime PCR檢測HO-1 mRNA的表達

        2.5Western印跡檢測與A組比較,B組、C組中HO-1蛋白表達水平逐漸升高;D組HO-1表達水平明顯高于B組和C組。見圖4。

        圖4 Western印跡檢測結(jié)果

        3 討論

        肝臟缺血再灌注損傷(I/R)是手術(shù)中比較常見的病理生理過程,多見于肝臟血流受阻斷的肝臟外科手術(shù)[1],非阻斷肝血流的手術(shù)(如:腹腔鏡膽囊切除)也可以對肝臟造成缺血再灌注性損傷,因此已經(jīng)引起臨床外科和麻醉醫(yī)生的重視。肝臟是一個對缺血缺氧極為敏感的器官,一旦血流被阻斷,肝細胞內(nèi)的能量很快消耗殆盡,并由于能量不足引起結(jié)構(gòu)和功能損害。這種損傷不僅發(fā)生在缺血時,恢復(fù)血流后,損傷不但不會減輕,反而還會繼續(xù)加重,即缺血再灌注損傷[2]。Kupffer細胞激活釋放大量氧自由基和炎性介質(zhì),被認為是缺血再灌注早期最主要的損傷機制[3]。從分子水平層面,肝臟I/R具有十分復(fù)雜的分子機制,諸多分子通道與炎癥因子產(chǎn)物相互反饋,產(chǎn)生一系列的級聯(lián)效應(yīng),導(dǎo)致肝組織的嚴重損傷[4]。在正常生理狀態(tài),自由基的清除與生成處于動態(tài)平衡中,但在某些病理狀態(tài)下(如肝臟再灌注損傷)時,組織通過“呼吸爆發(fā)”、吞噬細胞系統(tǒng)、兒茶酚胺的自身氧化途徑等產(chǎn)生大量氧自由基(OFR)。OFR是缺血器官再灌注后致組織損傷最早、最重要的有害物質(zhì)之一[5]。大量氧自由基可激活NF-κB,促使炎癥因子釋放大大增加[6]。

        MDA是發(fā)生過氧化反應(yīng)(LP)過程中,細胞膜內(nèi)所含的不飽和脂肪酸受到氧自由基攻擊后所產(chǎn)生的毒性過氧化產(chǎn)物(LPO)。雖然大量LPO產(chǎn)生,但其性質(zhì)極不穩(wěn)定,直接測定其在肝臟組織中的含量極為困難。而MDA作為LP過程的終末代謝產(chǎn)物,其性質(zhì)比較穩(wěn)定。測定MDA含量可間接反映肝臟組織內(nèi)LP的過氧化程度,進而間接反映肝臟缺血再灌注損傷的程度,同時也間接反映細胞損傷的程度[7]。 SOD是體內(nèi)最主要的自由基清除劑。正常生理狀態(tài)時,SOD與過氧化氫發(fā)生反應(yīng),再由過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶轉(zhuǎn)變?yōu)樗瑥亩棺杂苫宄?;但在I/R過程中,“氧化-抗氧化”的平衡狀態(tài)被打破,過氧化反應(yīng)呈病理性增強,自由基可以與細胞膜磷脂等重要功能性單位發(fā)生反應(yīng),使其失去正常的生理功能。因此,SOD在I/R發(fā)生過程中的含量變化可以很敏感地反映肝臟組織的損傷程度。

        HO-1又稱熱休克蛋白32(Hsp32),是一種限速酶,正常生理情況下可存在于多個臟器與組織中,表達量較少。但在應(yīng)激情況下,HO-1的表達便會反應(yīng)性地增強,以減少應(yīng)激狀態(tài)帶來的損傷[8]。有研究表明,HO-1可通過催化血紅素生成一氧化碳(CO)、鐵離子和膽綠素的機制,在肝臟缺血再灌注方面發(fā)揮重要作用;HO-1可以減輕自由基對細胞膜所引發(fā)的過氧化反應(yīng),下調(diào)半胱氨酸蛋白酶活性,以對抗細胞凋亡和腫瘤壞死因子(TNF)水平。在本實驗中,通過免疫組化、Realtime PCR檢測和Western印跡檢測的方式,多層面地證明HO-1在A組、B組、C組、D組中的表達逐漸增高,以D組最為明顯,也充分證明了異丙酚在大鼠肝臟缺血再灌注損傷過程中,可以通過誘導(dǎo)HO-1的表達而發(fā)揮對肝臟的保護性作用。 異丙酚是一種較有效的酚類抗氧化劑,可以與氧自由基結(jié)合生成穩(wěn)定的酚氧自由基[9],在高氣腹壓所致I/R時,異丙酚可以明顯降低氧自由基水平,其主要保護性作用的機制如下:異丙酚可以直接與自由基發(fā)生反應(yīng),減輕細胞膜的過氧化反應(yīng),穩(wěn)定細胞膜;上調(diào)肝臟組織內(nèi)SOD的活性,間接減輕I/R的損傷程度;在I/R過程中,減輕中性粒細胞浸潤和膠質(zhì)細胞炎性因子的釋放[10];增加NO的含量,改善微循環(huán)障礙;脂溶性高,很容易進入細胞的脂質(zhì)雙分子層并在局部聚集,從而提高細胞抗氧化損傷的能力。此外,異丙酚能夠抑制I/R后TNFα-mRNA 和蛋白表達,發(fā)揮其保護作用[11]。目前認為,TNF-α和IL-1β在I/R中起初始激發(fā)作用[12]。本次實驗結(jié)果表明,異丙酚還具有另外一個保護機制:其可以在肝臟I/R過程中,促進HO-1的蛋白的表達,從而間接發(fā)揮保護性作用。

        綜上所述,CO2氣腹對大鼠肝臟可以造成缺血性損傷,但氣腹壓力解除后損傷并沒有停止,反而繼續(xù)加重,其原因為再灌注時,大量代謝產(chǎn)物、氧自由基等釋放入血進入全身循環(huán),進一步加重再灌注肝組織的損傷[13]。另外,肝臟發(fā)生I/R后,細胞凋亡是肝細胞死亡的主要方式[14]。除了肝自身的損傷以外,還會造成其他遠隔器官損傷[15]。異丙酚可以通過增加HO-1蛋白的表達機制減輕大鼠肝臟I/R的損傷。

        參考文獻:

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        收稿日期:2015-09-10

        *通信作者

        DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603007

        Hepatic ischemic reperfusion injury caused by experimental simulated laparoscopic high CO2pneumoperitoneum pressure and the protective effect and mechanism of propofol in rats

        ZOU Hai-bo,YANG Zhu,WANG Ying,SUN Xiao-feng*

        (Desect1ment of Anesthesiology,the Center Hospital Affiliated to Medical School of Shenyang,Shenyang 110000,China)

        【Abstract】ObjectiveTo investigate the hepatic ischemic reperfusion injury (IRI) caused by experimental simulated laparoscopic high CO2 pneumoperitoneum pressure and the protective effect and mechanism of propofol in rats.Methods48 Wistar rats (280~320 g) were selected and prepared by fasting but freely drinking for 12 hours before the following experiments.The selected rats were randomly divided into the following 4 groups (12 in each):control-group (group A),ischemic-group (group B),reperfusion-group (group C) and propofol-group (group D).The expression changes of AST,ALT,SOD,MDA and HO-1 were detected individually.ResultsCompared with group A,higher expression of MDA but lower SOD and reactive gradual increase of HO-1 were shown in group B and group C,and the results of hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry indicated an gradually aggravated injury.Compared with group B and group C,an obviously decreased MDA but increased SOD and HO-1 expression were shown in group D,meanwhile,the results of hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry revealed an alleviative injury.ConclusionCO2 pneumoperitoneum can cause the hepatic ischemic reperfusion injury in rats; The ischemia and reperfusion are two steps of different damages process.The liver damages do not stop but aggravate in reperfusion process though the ischemic state was removed; Propfol has a protective effect through the mechanism of promoting HO-1 expression.

        Key words:Carbon dioxide;Ischemic/reperfusion injury;Liver;Propfolum;HO-1

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