張瑛瑛

?

甘草酸二銨對(duì)大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450酶含量及活性的影響

張瑛瑛

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，沈陽(yáng) 110032

[摘要]目的研究甘草酸二銨對(duì)大鼠肝微粒體的蛋白含量、CYP450酶總量和CYP2C6、CYP2C11、CYP2D2活性的影響。方法Wistar大鼠灌胃給予甘草酸二銨[50 mg/(kg·d)]，連續(xù)7 d，測(cè)定其肝微粒體蛋白含量、CYP450蛋白含量以及CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2活性。結(jié)果與對(duì)照組比較，甘草酸二銨給藥組大鼠肝微粒體蛋白含量及肝微粒體CYP450含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CYP2C6、CYP2C11酶的活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CYP2D2酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論甘草酸二銨可以抑制CYP2C6、CYP2C11酶的活性。

[關(guān)鍵詞]甘草酸二銨；CYP450；CYP2C6；CYP2C11；CYP2D2

0　引言

甘草酸二銨是甘草有效成分的第三代提取物，具有抗炎、抗過(guò)敏、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝細(xì)胞、改善肝臟功能及抗癌等作用，臨床上主要用于各類病毒性肝炎以及腫瘤化療和腎移植術(shù)后的肝功能異常的治療[1-2]?？诜o藥后甘草酸二銨經(jīng)胃酸水解，在鏈霉菌和肝中葡糖醛酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為甘草次酸，并由甘草次酸發(fā)揮藥物的生物活性作用[3-4]。目前隨著中草藥使用的增加，草藥-藥物相互作用的報(bào)道也逐漸增多，其中多數(shù)顯著的草藥-藥物相互作用都是由草藥介導(dǎo)的對(duì)CYP450酶的調(diào)節(jié)作用引起的[5]。因此，闡明草藥有效成分對(duì)CYP450酶的影響對(duì)保證草藥-西藥臨床聯(lián)合用藥的安全性具有重要意義。甘草作為一種廣泛使用的草藥，其有效成分甘草酸已被證明對(duì)大鼠CYP3A4、CYP1A2和CYP2B1及一些Ⅱ相代謝酶，包括GT1、GT2和GST具有誘導(dǎo)作用，而對(duì)CYP2E1和CYP1A1則表現(xiàn)明顯的抑制作用，對(duì)人肝微粒體CYP1A2、CYP3A4、CYP2C19、CYP2EI、CYP2D6的活性沒(méi)有明顯影響[6-7]，但甘草次酸可以明顯抑制CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4的活性[8]。為進(jìn)一步完善甘草對(duì)CYP450酶影響的數(shù)據(jù)，本文研究了甘草酸二銨對(duì)大鼠CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2酶活性的影響。

1　材料與方法

1.1主要儀器島津UV50紫外分光光度計(jì)，島津公司；Q TRAP 2000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Applied Biosystem公司；Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Agilent公司。

1.2藥品與試劑甘草酸二銨，購(gòu)于武漢貝爾卡生物醫(yī)藥有限公司；奧美拉唑、5-羥基奧美拉唑、甲苯磺丁脲、4-羥基甲苯磺丁脲、右美沙芬、氧去甲基右美沙芬(純度均>98.0%)購(gòu)自Sigma公司；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，進(jìn)口分裝；牛血清白蛋白，購(gòu)自上海市浦江應(yīng)用生物化學(xué)研究所，西德進(jìn)口分裝。甲醇、乙腈為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3動(dòng)物與處理健康雄性Wistar大鼠18只，體重(200±20)g，隨機(jī)分成3組，每組6只。苯巴比妥誘導(dǎo)組(苯巴比妥組)：腹腔注射苯巴比妥鈉，75 mg/kg，每天1次，連續(xù)3 d；空白對(duì)照組(對(duì)照組)：腹腔注射相同體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d；甘草酸二銨給藥組(甘草酸二銨組)，灌胃給予甘草酸二銨，50 mg/kg，每天1次，連續(xù)給藥7 d。大鼠處死前12 h禁食，末次給藥后24 h拉頸處死動(dòng)物取出肝臟，采用差速離心法制備肝微粒體，用Tris-HCl緩沖液懸浮均勻，分裝，于-80 ℃保存待用。

1.4蛋白濃度測(cè)定采用Folin-酚法測(cè)定蛋白含量[9]。所得蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線為C=0.002 6 A，r=0.998。取肝微粒體樣品，用0.5 mol/L NaOH稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取1.0 mL依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸收度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。

1.5CYP450含量測(cè)定根據(jù)Wang等[10]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定大鼠肝微粒體CYP450含量。肝微粒體樣品用Tris-HCl緩沖液稀釋至0.4 mg/mL，分別取2.5 mL放于樣品池和參比池中；加入少量Na2S2O4，輕微攪拌，對(duì)樣品池通CO氣體30 s后，于450和490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，按Beer定律計(jì)算CYP450的含量。計(jì)算公式為：CYP450(nmol/mg protein)=(A450-490×1 000/91×C)，其中，A450-490為450和490 nm的吸收度之差，C為被測(cè)樣品的蛋白濃度(mg/mL)，而CYP450-CO結(jié)合物的摩爾消光系數(shù)為91 L/(mmol·cm)。本實(shí)驗(yàn)雙樣本分析，求算平均值。

1.6CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2酶活性的檢測(cè)以探針底物法結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定各種酶的活性[11]。CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2催化的特異性反應(yīng)分別為甲苯磺丁脲→4-羥基甲苯磺丁脲、奧美拉唑→5-羥基奧美拉唑和右美沙芬→氧去甲基右美沙芬。以這些反應(yīng)為基礎(chǔ)建立孵化體系。孵育體系總體積為500 μL，其中含大鼠肝微粒體蛋白1.0 mg/mL、NADPH 1.0 mmol/L、MgCl210.0 mmol/L、KCl 10.0 mmol/L，探針底物甲苯磺丁脲、奧美拉唑、右美沙芬的濃度分別為100、5、2.5 μmol/L，孵育時(shí)間20 min。反應(yīng)結(jié)束后加預(yù)冷的醋酸乙酯2 mL終止反應(yīng)。根據(jù)文獻(xiàn)方法測(cè)定特異性產(chǎn)物4-羥基甲苯磺丁脲、5-羥基奧美拉唑和氧去甲基右美沙芬的濃度。以單位時(shí)間單位蛋白量生成探針代謝物的量[pmol·mg/(protein·min)]。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1甘草酸二銨對(duì)大鼠肝微粒體蛋白和CYP450含量的影響各組間肝微粒蛋白含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，苯巴比妥組CYP450含量明顯高于對(duì)照組和甘草酸二銨組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，甘草酸二銨組CYP450含量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　甘草酸二銨對(duì)大鼠肝微粒體蛋白和CYP450含量的影響

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05

2.2甘草酸二銨對(duì)肝微粒體CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2酶活性的影響苯巴比妥組3種酶的活性均高于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甘草酸二銨組CYP2C6、CYP2C11酶活性與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CYP2D2酶活性與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　甘草酸二銨對(duì)CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2酶活性的影響

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05

3　討論

CYP450酶是人體及動(dòng)物體內(nèi)的重要Ⅰ相代謝酶，參與大多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)和外源性藥物的生物轉(zhuǎn)化，而許多藥物也會(huì)對(duì)CYP450酶活性產(chǎn)生抑制或誘導(dǎo)，從而導(dǎo)致藥物代謝性相互作用[12]。FDA藥物相互作用研究指南中對(duì)CYP450酶水平的藥物相互作用有著明確的要求。因此，了解藥物對(duì)CYP450活性的影響對(duì)藥物開(kāi)發(fā)、臨床合理用藥指導(dǎo)均有重要意義。

甘草作為傳統(tǒng)植物藥，在臨床上廣泛應(yīng)用，而且常作為芳香劑和甜素添加于食品甚至煙草中。以往的研究已證實(shí)，甘草可以通過(guò)改變代謝酶活性或表達(dá)量而改變其他藥物的代謝過(guò)程。但甘草對(duì)CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2酶活性的影響未見(jiàn)報(bào)道。CYP2C家族是重要的CYP450酶，參與許多臨床藥物的代謝。CYP2C約占大鼠CYP總量的55%，其中CYP2C11和CYP2C6分別約占大鼠肝CYP2C總量的50%和20%，在藥物代謝中發(fā)揮重要作用。研究顯示，雙香豆素可以抑制這兩種酶的活性，從而抑制花生四烯酸的代謝[13-14]。甘草對(duì)CYP2C家族酶活性影響的報(bào)道結(jié)果不一。盡管甘草酸對(duì)人CYP2C19活性沒(méi)有影響，但其體內(nèi)主要活性成分甘草次酸可以明顯抑制CYP2C19和CYP2C9的活性。

本文研究結(jié)果顯示，甘草酸二銨對(duì)大鼠CYP2C11和CYP2C6酶活性有明顯抑制作用，由于本研究采用的是大鼠灌胃給藥，因而甘草酸二銨的作用也可能是通過(guò)其效應(yīng)成分甘草次酸發(fā)揮的。甘草酸二銨制劑是目前應(yīng)用較多的保肝藥物，在與經(jīng)CYP2C代謝的藥物聯(lián)用時(shí)，應(yīng)根據(jù)底物代謝酶特征，選擇性地對(duì)某些治療窗窄、安全范圍小的藥物進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，適當(dāng)調(diào)節(jié)給藥劑量，從而達(dá)到安全、合理聯(lián)合用藥。

參考文獻(xiàn)：

[1]郝飛.甘草酸國(guó)外研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房,2001,12(8):500-501.

[2]Fiore C,Eisenhut M,Krausse R,et al.Antiviral effects of Glyeyrrhiza species[J].Phytother Res,2008,22(2):141-148.

[3]Kim DH,Hong SW,Kim BT,et al.Biotransformation of glycyrrhizin by human intestinal bacteria and its relation to biological activities[J].Arch Pharm Res,2000,23(2):172-177.

[4]Yim JS,Kim YS,Moon SK,et al.Metabolic activities of ginsenoside Rb1,baicalin,glycyrrhizin and geniposide to their bioactive compounds by human intestinal microflora[J].Biol Pharm Bull,2004,27(10):1580-1583.

[5]Izzo AA,Emst E.Interactions between herbal medicines and prescribed drugs: a systematic review[J].Drugs,2001,61:2163-2175.

[6]楊靜,彭仁琇,孔銳,等.18α-甘草酸二銨對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞色素P450和II相酶的影響[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2001,36(5):321-324.

[7]徐匯華.甘草酸對(duì)CYP450酶的影響及其機(jī)制研究[D].長(zhǎng)沙:中南大學(xué),2010.

[8]Liu L,Xiao J,Peng ZH,et al.In vitro metabolism of glycyrrhitic acid by human cytochrome P450[J].Acta Pharmaceutica Sinica,2011,46(1):81-87.

[9]Wang GJ.Drug pharmacokinetics[M].Beijing:Chemical Industry Press,2005:440-441.

[10]Bertz RJ,Granneman GR.Use of in vitro and in vivo data to estimate the likelihood of metabolic pharmacokinetic interactions[J].Clin Pharmacokinet,1997,32:210-258.

[11]和凡,鐘國(guó)平,趙立子,等.槲皮素、山奈酚、蘆丁對(duì)大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450酶的誘導(dǎo)作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2010,30(9):728-731.

[12]Nedelcheva V,Gut I.P450 in the rat and man: methods of investigation,substrate specificities and relevance to cancer[J].Xenobiotica,1994,24:1151-1175.

[13]Vecera R,Zacharová A,Orolin J,et al.Fenofibrate-induced decrease of expression of CYP2C11 and CYP2C6 in rat[J].Biopharm Drug Dispos,2011,32:482-487.

[14]Zacharová A,Siller M,Spicáková A,et al.Rosuvastatin suppresses the liver microsomal CYP2C11 and CYP2C6 expression in male Wistar rats[J].Xenobiotica,2012,42:731-736.

收稿日期：2015-09-16

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603006

Effects of diammonium glycyrrhizinate on the content and activity of CYP450 in rats

ZHANG Ying-ying

(Desect1ment of Pharmacy,Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of diammonium glycyrrhizinate on the content of liver microsome protein,cytochrome P450 (CYP450) and the activity of CYP2C6,CYP2C11 and CYP2D2 in cytomicrosome of rat liver.MethodsRats were given diammonium glycyrrhizinate by oral administration [50 mg/(kg·d)] for 7 days,and the content of liver microsome protein,CYP450 and the activity of CYP2C6,CYP2C11 and CYP2D2 in cytomicrosome were detected.ResultsCompared with control group,there was no significant difference in the content of liver microsome protein,CYP450 or the activity of CYP2D2 in treatment group,but there were significant differences in the activities of CYP2C6 and CYP2C11(P<0.05).ConclusionDiammonium glycyrrhizinate can inhibit the activity of CYP2C6 and CYP2C11 in rats.

Key words：Diammonium glycyrrhizzinate; CYP450; CYP2C6; CYP2C11; CYP2D2