崔明華，雷尚芳，郭俐宏

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丹參酮ⅡA磺酸鈉聯(lián)合思美泰對同種異體1/2原位肝臟移植大鼠P450及肝功能的影響

崔明華a，雷尚芳b，郭俐宏c*

十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)a.婦產(chǎn)科，b.感染科，c.針灸科，湖北 十堰 442000

[摘要]目的采用改良雙袖套法建立大鼠同種異體1/2原位肝臟移植動(dòng)物模型，觀察術(shù)后丹參酮ⅡA磺酸鈉對細(xì)胞色素P450亞型酶活性及肝功能的影響，探討藥物干預(yù)機(jī)制，為臨床治療肝移植合理用藥提供理論依據(jù)。方法選擇60只大鼠，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、思美泰組及丹參酮組，思美泰組經(jīng)尾靜脈注射思美泰2 mg/(kg·d)，丹參酮組在此基礎(chǔ)上經(jīng)尾靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉5 mg/(kg·d)治療14 d，空白對照組及模型組注射等體積生理鹽水。采用高效液相色譜儀檢測治療前后肝微粒體細(xì)胞色素P450亞型酶(CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9)，生化檢測肝功能中膽汁酸(TBA)、總膽紅素(STB)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)水平，并計(jì)算肝移植術(shù)大鼠存活率，評價(jià)丹參酮ⅡA磺酸鈉對大鼠同種異體1/2原位肝臟移植的影響。結(jié)果經(jīng)丹參酮ⅡA磺酸鈉及思美泰藥物干預(yù)，丹參酮組CYP2E1、CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4酶活性及TBA、GGT、ALT、AST、STB均明顯降低，存活率達(dá)60%，與模型組及思美泰組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論丹參酮ⅡA磺酸鈉抑制大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450亞型酶活性，減輕過敏反應(yīng)，提高同種異體1/2原位肝臟移植大鼠存活率，恢復(fù)肝功能，與思美泰聯(lián)用可增強(qiáng)Na+/K+-ATP酶泵功能，同時(shí)，活血化淤、增加肝臟組織供氧相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]丹參酮ⅡA磺酸鈉；同種異體1/2原位肝臟移植動(dòng)物模型；肝功能；細(xì)胞色素P450亞型酶

0　引言

Lee于1973年首創(chuàng)大鼠原位肝移植動(dòng)物模型[1]，現(xiàn)在多采用改良雙袖套法進(jìn)行肝移植術(shù)。由于肝臟移植術(shù)后隨著血液再通，除機(jī)體正常的排異反應(yīng)外，還多伴有肝臟缺血再灌注損傷(Hepatic ischemia reperfusion，HIR)[2]。如何處理HIR，減輕排異反應(yīng)，延長肝移植后大鼠的存活時(shí)間，已成為肝移植術(shù)后治療的難題。因藥物預(yù)處理及缺血預(yù)處理可減輕排斥反應(yīng)，且臨床效果明顯優(yōu)于缺血預(yù)處理方法，故在肝移植中如何采用正確的缺血預(yù)處理及藥物預(yù)處理是提高術(shù)后存活時(shí)間的關(guān)鍵因素[3]。近年來，臨床使用丹參酮ⅡA磺酸鈉防治器官移植缺血再灌注損傷取得肯定的臨床效果。本實(shí)驗(yàn)研究采用大鼠同種異體1/2原位肝臟移植動(dòng)物模型，研究丹參酮ⅡA磺酸鈉對肝移植術(shù)后細(xì)胞色素P450亞型酶活性及肝功能的影響，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物分組及飼養(yǎng)SPF級SD大鼠60只，6～8周齡，體重(180±20)g，雄性，大鼠由十堰市太和醫(yī)院科研所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(鄂)2011-0031；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(鄂)2011-0008。動(dòng)物按隨機(jī)原則分為空白對照組、模型組及丹參酮組，每組20只。應(yīng)盡量在實(shí)驗(yàn)時(shí)減少動(dòng)物使用量并落實(shí)術(shù)后動(dòng)物福利：①飼養(yǎng)環(huán)境：動(dòng)物房恒溫(22 ℃，濕度50%～75%)，單籠飼養(yǎng)，12 h交替光照；②術(shù)后護(hù)理：傷口每日碘伏消毒1次，肌肉注射頭孢克洛0.1 g/(100 g·d)預(yù)防感染，消毒護(hù)理時(shí)盡量減少動(dòng)物的疼痛和不適等人道主義措施[4]；③飼養(yǎng)：滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求[5]，蘇醒后大鼠自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，觀察動(dòng)物飲水進(jìn)食情況，稱體重，及時(shí)清理糞便。

1.2檢測儀器及藥品思美泰組經(jīng)尾靜脈注射思美泰[丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射液，2 mg/(kg·d)]；Waters2010型高效液相色譜儀(迪馬公司)；GR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)(美國Beck-man公司)；CAY-1型液體快速混合器(北京長安儀器廠)；SHA-C水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市億通電子有限公司)；KQ-500E型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；丹參酮ⅡA磺酸鈉(菏澤步長制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z20026866)。

1.3大鼠肝臟移植動(dòng)物模型制備術(shù)前供體及受體均自由飲水，禁食，供體、受體大鼠體重應(yīng)相差≤15 g。于術(shù)前20 min肌肉注射阿托品0.04 mg，手術(shù)時(shí)先剪去腹部毛發(fā)備皮，碘伏消毒，3%戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹部向上仰臥位固定于大鼠固定器。參照文獻(xiàn)[6]，打開腹腔(供體、受體手術(shù)應(yīng)同時(shí)進(jìn)行)，采用何勇等改良雙袖套法中“2回折法、3結(jié)扎、4貫通”的方法，分別取供體、受體大鼠1/2肝臟進(jìn)行原位交叉植入手術(shù)(目的是節(jié)約動(dòng)物)，仔細(xì)吻合植入肝臟血管，分層縫合腹腔，碘伏消毒創(chuàng)口1周(1次/d)?？瞻讓φ战M手術(shù)同上但不造模型。術(shù)后丹參酮組經(jīng)尾靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉5 mg/(kg·d)，治療14 d，空白對照組及模型組注射等體積生理鹽水。

1.4術(shù)后觀察術(shù)后護(hù)理時(shí)主要觀察大鼠精神、活動(dòng)及自潔情況，體毛，攝食、飲水，存活。

1.5檢測指標(biāo)參照文獻(xiàn)[7]，經(jīng)大鼠眶靜脈取血0.5 mL置于肝素管，生化檢測肝功能TBA、GGT、ALT、AST、STB。大鼠斷頭取肝，用GR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)差速離心法制備大鼠肝微粒體。先按1∶4加入勻漿緩沖液(11.5 g/L氯化鉀，50 mmol/L～Tris，pH：7.4)勻漿，4 ℃下10 000 r/min離心60 min，將離心管中沉淀組織重懸于0.25 mol/L蔗糖溶液中即獲得肝微粒體，分別將各組大鼠肝微粒體標(biāo)本置于-80 ℃冰箱暫存，檢測時(shí)用SHA-C水浴恒溫振蕩器37 ℃先孵育并振蕩30 min，再離心20 min后取上清液，用Waters2010型高效液相色譜儀進(jìn)樣檢測各組大鼠細(xì)胞色素P450亞型酶(CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9)活性。

2　結(jié)果

2.1肝移植大鼠術(shù)后觀察空白對照組大鼠反應(yīng)敏捷，體毛光澤，飲食正常，無動(dòng)物死亡。模型組大鼠14只死亡，僅存活6只，存活率30%，蜷縮，拒絕活動(dòng)，精神極差，無舔足舔毛等自潔現(xiàn)象，拒絕攝食、少量飲水。思美泰組11只死亡，存活9只，存活率45%，蜷縮少動(dòng)，精神極差，舔足舔毛等自潔現(xiàn)象少，拒食、少量攝食、飲水。丹參酮組較模型組稍好，8只死亡，存活12只，存活率60%，蜷縮，活動(dòng)少，精神差，有舔足舔毛等自潔現(xiàn)象，少量攝食、飲水。

2.2丹參酮ⅡA磺酸鈉對肝功能的影響模型組、思美泰組及丹參酮組造模型后TBA、GGT、ALT、AST、STB均明顯升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)14 d治療，模型組TBA、GGT、ALT、AST、STB仍然保持在較高水平，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。思美泰組和丹參酮組TBA、GGT、ALT、AST、STB明顯降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。丹參酮組與思美泰組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　丹參酮ⅡA磺酸鈉對同種異體1/2原位肝臟移植大鼠肝功能ALT、AST、STB的影響

注：與空白對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與思美泰組比較，*P<0.05

2.3丹參酮ⅡA磺酸鈉對細(xì)胞色素P450亞型酶活性的影響空白對照組治療前后細(xì)胞色素P450亞型酶(CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9)活性保持正常水平；模型組及思美泰組細(xì)胞色素P450亞型酶表達(dá)均增強(qiáng)，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；丹參酮組CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6明顯降低，與模型組及思美泰組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CYP2C9無明顯變化，與模型組及思美泰組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　丹參酮ⅡA磺酸鈉對細(xì)胞色素P450亞型酶活性的影響(nmol/mL)

注：與空白對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與思美泰組比較，*P<0.05

3　討論

藥物吸收后90%均經(jīng)過細(xì)胞色素P450亞型酶(CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9)代謝，P450的抑制與誘導(dǎo)均影響藥物的療效，P450活性增強(qiáng)常導(dǎo)致藥物的治療作用降低，過敏等不良反應(yīng)增高[8]。TBA、GGT、ALT、AST、STB等可客觀反映肝功能，因此，我們采用P450及TBA、GGT、ALT、AST、STB等指標(biāo)評定丹參酮ⅡA磺酸鈉對大鼠同種異體1/2原位肝臟移植的影響。

丹參酮ⅡA磺酸鈉是從紅花丹參中純化提取的酮類化學(xué)物質(zhì)，未純化前的丹參主要有效成分包括丹參酚酸、丹參酮、紅花黃素、黃酮類化合物等[9]，《吳普本草》言丹參“味辛性涼、治心肌腹痛”；《藥品化義》言紅花“味辛性溫、善通利經(jīng)脈”[10]。兩藥合用具有“涼血消癰、調(diào)經(jīng)鎮(zhèn)痛、活血通經(jīng)、散癖鎮(zhèn)痛”的作用[11]。現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，兩藥純化提取的丹參酮ⅡA磺酸鈉是產(chǎn)生藥理效應(yīng)的主要成分，具有明顯的擴(kuò)管及降低缺血再灌注肝微粒體P450亞型酶的作用[11]。

本研究結(jié)果顯示，丹參酮組大鼠在治療14 d時(shí)，TBA、GGT、ALT、AST、STB、CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6明顯降低，存活率達(dá)60%。丹參酮ⅡA磺酸鈉降低細(xì)胞色素P450亞型酶有利于藥物的代謝，并且可以減少不良反應(yīng)、增加療效，與劉高峰等[12]的研究結(jié)果一致。而降低TBA、GGT、ALT、AST、STB說明其具有促進(jìn)肝功能恢復(fù)的作用。CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6占P450蛋白含量的80%以上，與藥物代謝及相互作用密切相關(guān)[13]。其活性升高說明藥物不良反應(yīng)增加，療效降低。本實(shí)驗(yàn)中CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6活性降低，說明丹參酮ⅡA磺酸鈉可抑制大鼠同種異體1/2原位肝臟移植術(shù)P450活性，減少不良反應(yīng)，增強(qiáng)療效，對缺血/再灌注肝臟具有保護(hù)作用。電生理特點(diǎn)分析認(rèn)為，丹參可能通過增強(qiáng)Na+/K+-ATP酶活性,改善肝臟組織能量代謝而起到保護(hù)作用[14]。腺苷蛋氨酸是思美泰的主要成分，由機(jī)體ATP和蛋氨酸腺苷蛋氨酸環(huán)化酶作用下生成，當(dāng)缺乏腺苷蛋氨酸時(shí)轉(zhuǎn)甲基作用受限，質(zhì)膜磷脂甲基化降低，Na+/K+-ATP酶泵功能及肝臟細(xì)胞膜流動(dòng)性均下降，直接導(dǎo)致TBA、GGT、ALT、AST、STB升高[15]。肝移植手術(shù)創(chuàng)傷及異體排斥反應(yīng)常造成肝功能各指標(biāo)升高，丹參酮組大鼠在經(jīng)丹參酮ⅡA磺酸鈉+思美泰治療后，肝功能明顯降低，說明在丹參酮ⅡA磺酸鈉及思美泰的共同作用下，思美泰中的腺苷蛋氨酸增強(qiáng)了Na+/K+-ATP酶泵功能，促進(jìn)質(zhì)膜磷脂甲基化。同時(shí)，丹參酮ⅡA磺酸鈉起到活血化瘀，減輕血管壁炎癥反應(yīng)，涼血消癰的作用[16]，進(jìn)而改善微循環(huán)，增加組織供氧，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)重建及血管新生，兩者共同作用促進(jìn)肝功能恢復(fù)。有研究表明，丹參具有提高缺血心肌血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)血管重塑并建立有效的側(cè)支循環(huán)及促有絲分裂原、升高肝細(xì)胞生長因子(HGF)表達(dá)的作用[17]。我們也對丹參酮ⅡA磺酸鈉與血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的相互關(guān)系進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在使用丹參酮ⅡA磺酸鈉后機(jī)體血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)增強(qiáng)，但其促血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)增強(qiáng)作用的具體機(jī)制有待闡明，這將是我們下一步重點(diǎn)研究方向。

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收稿日期：2015-07-07

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603005

Effects of sodium tanshinone A sulfonate combined with Si Mattel on P450 and liver function in 1/2 allogenic orthotopic liver transplantation rats

CUI Ming-huaa,LEI Shang-fangb,GUO Li-hongc*

(a.Desect1ment of Obstetrics and Gynecology,b.Desect1ment of Infectious Diseases,c.Desect1ment of Acupuncture and Moxibustion,Shiyan Taihe Hospital,Affiliated Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

【Abstract】ObjectiveThe modified two-cuff technique was used to establish rat orthotopic liver transplantation 1/2 animal model to observe the effect of sodium tanshinone A sulfonate on the activity of liver function and P450 isoform of cytochrome P450 enzyme after operation and to explore the mechanism of drug intervention,and provide a theoretical basis for clinical rational use of drugs in treatment of liver transplantation.MethodsSixty rats were randomly divided into blank control group,model group,Si Mattel group and tanshinone group.Rats in Si Mattel group were injected with 2 mg/(kg·d) Si Mattel by tail vein;on the basis of Si Mattel group,tanshinone group was intravenously injected sodium tanshinone A sulfonate 5 mg/(kg·d) for 14 days;blank control group and model group were injected with the same volume of physiological saline.HPLC method was used to detect the liver microsomal cytochrome P450 isoforms (CYP2E1,CYP1A2,CYP3A4,CYP2D6,CYP2C9) before and after treatment,biochemistry method was used to detect the level of bile acid biochemical liver function (TBA),total bilirubin (STB),assect1ate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT),gamma glutamyl transferase (GGT),and the survival rate of liver transplantation was calculated,and the effect of sodium tanshinone A sulfonate on rat allograft orthotopic liver transplantation 1/2 was calculated.ResultsThrough the drug intervention of tanshinone A sulfonic acid sodium and Si Mattel,CYP2E1,CYP1A2,CYP2C9 and CYP3A4 enzyme activity and TBA,GGT,ALT,AST and STB of tanshinone group were decreased and the survival rate increased to 60%;compared with model group and Si Mattel group,the differences were significant (P<0.05).ConclusionTanshinone A sulfonic acid sodium can improve the survival rate and restore liver function of 1/2 allograft orthotopic liver transplantation rats;the mechanism maybe related to inhibiting the activity of rat hepatic microsomal P450 isoform of cytochrome P450 enzymes,reducing the allergic reaction,reinforcing Na+/K+-ATP enzyme pump function through combination with Si Mattel,promoting blood circulation and removing blood stasis,and increasing hepatic tissue oxygen supply.

Key words：Sodium tanshinone A sulfonate; 1/2 allograft orthotopic liver transplantation animal model; Liver function; P450 isoform of cytochrome P450 enzymes