陳琴華，余　飛，李　鵬，朱　軍

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喜樹堿及其衍生物對肝癌細胞HepG2增殖抑制與凋亡的研究

陳琴華，余飛，李鵬*，朱軍

湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院藥物分析與篩選研究所，湖北 十堰 442008

[摘要]目的探討喜樹堿(CPT)及其衍生物10-羥基喜樹堿(HCPT)、7-乙基喜樹堿(SN22)、7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN38)在體外對肝癌細胞HepG2增殖抑制與凋亡的影響。方法取對數(shù)期生長的HepG2細胞，分為對照組以及實驗組，將4種藥物配成濃度梯度0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的藥物溶液。將不同濃度的藥物溶液作用于肝癌細胞48 h，MTT法測定HepG2細胞的增殖情況,Anexin V-PI染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結(jié)果MTT法顯示，4種藥物對肝癌細胞HepG2的增殖具有抑制作用，在一定范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，對HepG2細胞增殖的抑制作用逐漸增強，呈量效依賴關系，其中7-乙基-10-羥基喜樹堿抑制效果最好，10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿次之，喜樹堿抑制效果最差。不同濃度的喜樹堿及衍生物處理肝癌細胞HepG2，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，隨著藥物濃度的變化，細胞凋亡也呈現(xiàn)梯度變化,結(jié)構(gòu)修飾后的SN38比SN22、HCPT及CPT作用更強。結(jié)論喜樹堿及衍生物對肝癌細胞HepG2有抑制作用，并且能夠誘導細胞凋亡。

[關鍵詞]喜樹堿；10-羥基喜樹堿；7-乙基喜樹堿；7-乙基-10-羥基喜樹堿；HepG2細胞

0　引言

肝細胞癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，早期發(fā)現(xiàn)困難，臨床病程短，進展迅速，中位生存期僅3～6個月。治療上以手術(shù)切除為主，但多數(shù)患者確診時已喪失手術(shù)時機。非手術(shù)治療以肝動脈栓塞化療為首選，經(jīng)皮肝穿瘤體內(nèi)冷凍、射頻、無水乙醇及抗癌藥物注射治療也有一定效果，針對肝癌常選用的化療藥物有順鉑、阿霉素、絲裂霉素、羥基喜樹堿等[1-3]。喜樹堿屬于萜類吲哚生物堿，由Wall等首次從我國特有物種喜樹的莖部分離純化得到。1985年，Hisang等發(fā)現(xiàn)，喜樹堿能通過特異性地阻斷拓撲異構(gòu)酶Ⅰ(Topoisomerase Ⅰ，Topo Ⅰ)的合成抑制癌細胞增殖，區(qū)別于以往對拓撲異構(gòu)酶Ⅱ(Topoisomerase Ⅱ，Topo Ⅱ)為靶點進行攻擊的抗癌藥物，因而備受關注。而后研究者們又通過對CPT環(huán)7、9、10、11位的結(jié)構(gòu)改造，獲得了拓撲替康、依立替康、勒托替康、羥基喜樹堿(HCPT)、9-氨基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、DB-67(7-t-butyldimethylsilyl-10-hydroxycamptothecin)等，其中拓撲替康和CPT-11、HCPT已用于臨床治療結(jié)腸癌、卵巢癌和小細胞肺癌[4-7]。目前提出的喜樹堿類可能的抗腫瘤機制包括細胞凋亡通路、信號通路、細胞周期和端粒損傷作用等[8-13]。本實驗通過HepG2細胞株在喜樹堿及其衍生物7-乙基-喜樹堿、10-羥基-喜樹堿、7-乙基-10-羥基-喜樹堿的作用下，與對照組對比觀察其細胞的增殖抑制情況以及凋亡率，初步判斷藥物的抗癌療效，為臨床用藥提供基礎。

1　資料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑喜樹堿(西安匯林生物科技有限公司，含量：99.32%，批號：20130301)，10-羥基喜樹堿(西安匯林生物科技有限公司，含量:99.26%，批號：20130301)，7-乙基喜樹堿(西安匯林生物科技有限公司，含量：99.23%，批號：20130301)，7-乙基-10-羥基喜樹堿(西安匯林生物科技有限公司，含量：99.13%，批號：20130301)，DMEM(Gibco，USA)，新生牛血清FBS(杭州四季青公司)，四甲基偶氮唑(MTT,美國Sigma公司)，二甲基亞楓(DMSO，日本進口)，96孔細胞培養(yǎng)板(Corning，USA)，Annexin V-PI試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.1.2儀器CKX-31倒置顯微鏡(Olympus)，CO2孵育箱(Therma)，MQX200型酶標儀(BioTek)，F(xiàn)ACS Calibur型流式細胞儀(BDFACSCalibur)。

1.1.3細胞株HepG2細胞株購自西安交通大學醫(yī)學院，培養(yǎng)于含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組將人體肝癌細胞HepG2用含10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，按常規(guī)方法消化、傳代，待細胞長至80%融合時進行實驗。所有實驗均在細胞對數(shù)生長期進行。將細胞分為對照組和給藥組，即喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿的不同濃度實驗組。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖抑制率取處于對數(shù)生長期的HepG2細胞加入胰蛋白酶消化，吹打制成單個細胞懸液，調(diào)整細胞密度為104個/mL，以每孔體積200 μL接種于96孔培養(yǎng)板上。培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后更換含不同濃度喜樹堿以及衍生物的藥物培養(yǎng)基，對照組加等體積的培養(yǎng)液，每組設6個復孔，將細胞置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入180 μL新鮮DMEM培養(yǎng)液，每孔加5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，輕輕扣板于濾紙上，每孔加入DMSO溶液200 μL，置于搖床上振蕩3 min使結(jié)晶充分溶解，用酶標儀在490 nm波長處測各孔的光密度值(OD值)，然后計算不同濃度的喜樹堿以及衍生物對細胞的生長抑制情況，細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗孔OD值/對照孔OD值)×100%，并計算IC50值。

1.2.3Anexin V-PI染色法流式細胞儀檢測細胞凋亡率培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期，消化吹打成單細胞懸液后用培養(yǎng)基稀釋，調(diào)整細胞濃度為2×106個/mL，接種于6孔板內(nèi)，每孔2 mL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直到細胞貼壁良好，細胞處于對數(shù)生長期，細胞長至孔底面積70%或80%左右時，棄去原培養(yǎng)液，加入含藥培養(yǎng)基，作用48 h后收集各組細胞。按試劑盒操作，將各組細胞離心，預冷PBS洗滌棄上清，殘渣細胞收集至流式管。每管加10 μL Annexin V和 5 μL PI，避光靜置15 min，加300 μL預冷PBS，振蕩混勻上機。

2　結(jié)果

2.1喜樹堿及其衍生物對HepG2細胞增殖的影響喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿類藥物在作用48 h后均呈現(xiàn)對細胞增殖的抑制作用，不同藥物不同濃度細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，隨著作用濃度增加，抑制作用越明顯，增殖抑制作用的大小呈濃度依賴性(見圖1)。4種藥物對肝癌細胞HepG2抑制作用強弱依次為7-乙基-10-羥基喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、喜樹堿。7-乙基-10-羥基喜樹堿相同濃度時表現(xiàn)出最大的抑制作用，0.01 μmol/L時的抑制率為17.04%，1 μmol/L時的抑制率為59.91%，10 μmol/L時的抑制率增至70.50%；喜樹堿表現(xiàn)出最小的增殖抑制作用，0.1 μmol/L時的抑制率為3.82%，1 μmol/L時的抑制率增至36.21%，10 μmol/L時的抑制率增至43.33%。10-羥基喜樹堿與7-乙基喜樹堿藥物對肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用接近，但隨著濃度的增加，7-乙基喜樹堿的增殖抑制率較10-羥基喜樹堿升高更為明顯。4種藥物的IC50分別為1.859 1、3.363 3、6.265 9、8.523 3 μmol/L。

圖1　喜樹堿及衍生物對肝癌細胞HepG2的抑制曲線圖

2.2喜樹堿及其衍生物對HepG2細胞凋亡的影響運用Annexin V-FITC/PI雙染色結(jié)合流式細胞術(shù)觀察并計算喜樹堿誘導細胞凋亡率，得到藥物濃度-凋亡率圖，見圖2。喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿對肝癌細胞HepG2凋亡影響的結(jié)果顯示，對照組48 h后的凋亡率為8.93%。肝癌細胞HepG2在4種藥物作用下細胞凋亡率較對照組明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且不同藥物的凋亡率隨濃度的增加呈不同幅度升高，總體作用結(jié)果呈現(xiàn)濃度依賴性。說明喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿能促進肝癌細胞HepG2的凋亡，其中7-乙基-10-羥基喜樹堿誘導效果最為明顯(見圖3)，喜樹堿最弱。

圖2　喜樹堿及衍生物對肝癌細胞HepG2的流式細胞圖

圖3　SN38濃度依賴性流式細胞凋亡率圖以及HCPT和SN22在10 μmol/L的流式凋亡圖

3　討論

喜樹堿主要是通過抑制腫瘤細胞中Topo Ⅰ的活性來發(fā)揮抗腫瘤作用。TopoⅠ是一種與DNA復制、重組和轉(zhuǎn)錄有關的細胞核內(nèi)酶。處于S期的細胞對喜堿類藥物誘導凋亡更為敏感，S期細胞易感原因與DNA復制有關。當細胞DNA在大量復制活躍時，TopoⅠ剪切DNA雙鏈形成的TopoⅠ-DNA可裂解復合物，喜樹堿能與其結(jié)合，形成CPT-TopoⅠ-DNA三元復合物，使可逆的可解離復合物轉(zhuǎn)變成不可逆的復合物，抑制由TopoⅠ介導的DNA裂解和重新連接反應，最終引起DNA鏈斷裂，從而導致細胞死亡[14-16]。

本實驗也進一步證實了喜樹堿及其衍生物對肝癌細胞HepG2具有較明顯的抑制作用。自喜樹堿被發(fā)現(xiàn)以來，一直具有良好的抗癌效果，到目前為止，經(jīng)過優(yōu)化結(jié)構(gòu)得到一系列的衍生物也在臨床上廣泛使用。本實驗結(jié)果表明，喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿呈濃度依賴性顯著抑制肝癌細胞的增殖，尤其是7-乙基-10-羥基喜樹堿在癌細胞增殖方面有很強的抑制作用。細胞凋亡情況顯示喜樹堿及其衍生物對肝癌細胞HepG2有良好的凋亡誘導作用，與正常組比較，早期與晚期凋亡百分比均明顯提高，其中7-乙基-10-羥基喜樹堿誘導作用最佳。

綜上所述，喜樹堿以及衍生物對肝癌細胞HepG2具有良好的抑制增殖和誘導凋亡作用，具有良好的開發(fā)空間，有望給臨床用藥提供基礎。

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收稿日期：2015-08-25

基金項目：湖北省教育廳科學技術(shù)研究項目(D20152105)；十堰市科學技術(shù)研究與開發(fā)項目(15Y48)；湖北省自然科學基金面上項目(2015CFB615)；湖北醫(yī)藥學院優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團隊計劃(2014CXG04)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603004

Research on the effect of camptothecin and its derivatives on proliferation and apoptosis of liver cancer cell HepG2

CHEN Qin-hua,YU Fei,LI Peng*,ZHU Jun

(Desect1ment of Medical Experiment Center,Affiliated Dongfeng Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of camptothecin (CPT) and its derivatives 10-hydroxy camptothecin (HCPT),7-ethyl camptothecin (SN22),7-ethyl-10-hydroxy camptothecin (SN38) on inhibition of hepatoma cell line HepG2 and induction of its apoptosis.MethodsThe vegetative HepG2 cells of logarithmic phase were assigned as control group and experimental group.Four drugs were made to different concentrations,which were 0.01,0.1,1,10,100 μmol/L.Different concentrations of drug solutions were effected on HepG2 cells in 48 h,then MTT method was used to detect the proliferation of HepG2 cell and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry (FCM) using Anexin V-PI staining.ResultsThe results by MTT method showed four drugs had inhibitory effect on proliferation of HepG2 cells,moreover,the proliferation inhibition of HepG2 cells was enhanced gradually with the increase of drug concentrations in a certain scope drug concentrations,and the proliferation inhibition was dependent on drug concentration.The sequences of proliferation inhibition were SN38,HCPT,SN22,and CPT.With different concentrations of camptothecin and derivatives with HepG2 liver cancer cells,there were significant differences compared with control group,and as drug concentration changed,cell apoptosis also presents gradient change;structure modification of SN38 was stronger than SN22,CPT and HCPT function by FCM using AnexinV-PI staining.ConclusionCamptothecin and its derivatives can inhibit HepG2 cells and induce cell apoptosis.

Key words：Camptothecin; 10-hydroxy camptothecin; 7-ethyl camptothecin; 7-ethyl-10-hydroxy camptothecin; HepG2 cells