徐碧林,申　甜,夏　娟，喻　明，朱近悅，汪紅平

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白藜蘆醇拮抗游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島B細(xì)胞凋亡機(jī)制探討

徐碧林*,申甜,夏娟，喻明，朱近悅，汪紅平

上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院內(nèi)分泌科,上海 200062

[摘要]目的探討白藜蘆醇拮抗游離脂肪酸誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的胰島B細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。方法將10 μmol/L白藜蘆醇和500 μmol/L棕櫚酸同時(shí)作用于體外培養(yǎng)的胰島B細(xì)胞。共分為3組:空白組(不含棕櫚酸)、棕櫚酸組(PA組,含500 μmol/L棕櫚酸的脂性培養(yǎng)基)、白藜蘆醇組(Res組，含10 μmol/L白藜蘆醇+500 μmol/L棕櫚酸)。以流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，RT-PCR檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2 mRNA水平。結(jié)果與PA組相比，Res能顯著降低B細(xì)胞凋亡率(95.82%±1.94% vs.11.03%±1.08%，P<0.01)，降低Bax mRNA(0.185±0.005 vs.0.161±0.003，P<0.01)，升高Bcl-2 mRNA(0.004±0.001 vs.0.008±0.001，P<0.01)。結(jié)論白藜蘆醇能拮抗棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島B細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]細(xì)胞凋亡;白藜蘆醇;棕櫚酸

0　引言

2型糖尿病常合并脂代謝紊亂，在2002年美國糖尿病協(xié)會年會上，McGarry提出了“糖尿病是糖脂病”的概念?！爸拘浴痹谔悄虿〉陌l(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。游離脂肪酸可以通過多種途徑導(dǎo)致胰島B細(xì)胞凋亡，如激活氧化應(yīng)激[1]、誘導(dǎo)凋亡相關(guān)因子[2]失衡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[3]等。白藜蘆醇屬于一種酚類植物抗毒素，近年來的研究表明，白藜蘆醇具有明顯的降低血糖、改善糖尿病的作用。其具體機(jī)制尚未完全明了。我們的前期研究結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，白藜蘆醇可以明顯抑制游離脂肪酸引起的B細(xì)胞凋亡[4]。本研究將進(jìn)一步探討其抑制B細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料小鼠胰島素瘤細(xì)胞(β-TC-6細(xì)胞株)(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所),白藜蘆醇、棕櫚酸(上海安譜生物科技有限公司),DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone),優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Biowest南美血源),AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司),逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptⅢ Reverse Transcriptase(R250-01,invitrogen)；熒光染料SYBR Green I(CS7561，invitrogen),5%二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱(Shell-Lab公司)，流式細(xì)胞儀(BD FACSCALIBUR),熒光定量PCR儀(CFX96TMReal-Time Systerm,Bio Rad)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)β-TC-6細(xì)胞至對數(shù)生長期,接種于96孔板,每孔細(xì)胞數(shù)3×104。根據(jù)培養(yǎng)基中是否含棕櫚酸及不同白藜蘆醇濃度,設(shè)立3組,分別為:空白組(不含游離脂肪酸的條件培養(yǎng)基)、棕櫚酸組(含500 μmol/L棕櫚酸的脂性培養(yǎng)基)、白藜蘆醇組(10 μmol/L白藜蘆醇+500 μmol/L棕櫚酸)，每組濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。置于含5% CO2的37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中,觀察細(xì)胞生長形態(tài)。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡上述各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入適量胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min，2次后棄上清,每樣本加200 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞后加入10 μL AnnexinV-FITC,輕輕混勻,置室溫避光孵育15 min,加入5 μL碘化丙啶(PI),置相同條件下孵育5 min,1 h內(nèi)入流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞比率。

1.4RT-PCR法檢測Bax、Bcl-2 mRNATrizol法抽提各組細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄到cDNA后，進(jìn)行QPCR擴(kuò)增,將通過的基因Ct值拷貝到《QPCR相對定量計(jì)算表》中，選擇對照樣品，完成計(jì)算分析。Bax、Bcl-2引物應(yīng)用primer premier 5軟件設(shè)計(jì)，由上海諾百生物科技有限公司合成。Actin：agggaaatcgtgcgtgac，gctcattgccgatagtg；Bcl-2：ggggctacgagtgggatact，gacggtagcgacgagagaag；Bax：gcgaattggcgatgaactgg，tagaaaagggcaaccacccg。Bax、Bcl-2 mRNA的PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,70 ℃ 45 s,40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 10 s，每秒降0.5 ℃，65 ℃ 0.05 s讀板。

2　結(jié)果

2.1白藜蘆醇和棕櫚酸對β-TC-6細(xì)胞凋亡的影響培養(yǎng)24 h后，棕櫚酸組、白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡率均高于空白組(P<0.05)；白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡率較棕櫚酸組明顯下降(P<0.01)，細(xì)胞存活率較棕櫚酸組明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1　流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞存活和凋亡率(%)

注：與空白組比較,*P<0.05；與棕櫚酸組比較,#P<0.01

2.2各組Bax、Bcl-2 mRNA結(jié)果培養(yǎng)24 h后，棕櫚酸組、白藜蘆醇組Bax水平高于空白組，Bcl-2水平低于空白組(P<0.01)；白藜蘆醇組Bax水平低于棕櫚酸組，Bcl-2水平高于棕櫚酸組(P<0.01)。見表2。

表2　各組Bax、Bcl-2 mRNA結(jié)果

注：與空白組比較,*P<0.01；與棕櫚酸組比較,#P<0.01

3　討論

2型糖尿病以胰島素抵抗和胰島B細(xì)胞功能受損為特征。其中B細(xì)胞功能受損在2型糖尿病的發(fā)生中起決定作用。已有研究表明，B細(xì)胞高水平的凋亡是胰島B細(xì)胞功能受損的主要原因[5]。因此，抑制B細(xì)胞凋亡，可保護(hù)B細(xì)胞功能，從而有效緩解糖尿病病情。

在2型糖尿病中，線粒體途徑是胰島B細(xì)胞凋亡的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。線粒體途徑是由抗凋亡蛋白(如B淋巴細(xì)胞瘤蛋白家族Bcl-2、Bcl-xl等)與促凋亡蛋白(如Bax、Bak、Bid等)的異常改變導(dǎo)致線粒體外膜通透性改變，內(nèi)膜中的細(xì)胞色素C(Cyt-C)釋放入胞質(zhì)，與凋亡蛋白酶激活因子1和前caspase-9、ATP形成凋亡體，活化caspase-9，從而激活效應(yīng)caspase-3、6、7，導(dǎo)致凋亡。Bcl-2家族成員可通過改變線粒體外膜通透性而調(diào)控線粒體活化，在線粒體誘導(dǎo)的凋亡途徑中起重要作用。Lupi等[6]發(fā)現(xiàn)，與游離脂肪酸共同培養(yǎng)的人胰島細(xì)胞Bcl-2 mRNA明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著提高。Federici等[7]在比較了高糖濃度和正常糖濃度下培養(yǎng)人胰島細(xì)胞5 d后的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)抗凋亡基因Bcl-2沒有變化，而促凋亡基因Bax、Bak、Bid在高糖濃度下均過度表達(dá)，因此，Bcl家族中抗凋亡和促凋亡蛋白的平衡可能是決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的關(guān)鍵。

白藜蘆醇是一種天然的多酚類化合物，主要存在于各種紅葡萄果實(shí)和紅葡萄酒中，其在中藥虎杖中的含量遠(yuǎn)高于葡萄等其他植物。諸多研究表明，白藜蘆醇對于腫瘤、腦缺血、心血管疾病均有良好的治療作用。尤其近年來研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇還具有降低血糖，改善糖尿病的作用。其機(jī)制可能有：促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，改善胰島素敏感性[8]；改善胰島素分泌[9]；增加胰升糖素樣肽1(GLP-1)分泌[10]。

本研究結(jié)果顯示，棕櫚酸能夠明顯增加胰島B細(xì)胞凋亡，升高Bax水平，降低Bcl-2水平，證實(shí)了游離脂肪酸可通過Bcl-2家族引起B(yǎng)細(xì)胞凋亡，這與國外報(bào)道一致[6,11]。我們的前期研究結(jié)果表明，白藜蘆醇在一定濃度范圍內(nèi)可以明顯抑制胰島B細(xì)胞凋亡，且這種作用在10 μmol/L時(shí)作用最強(qiáng)[4]，因此，本研究選擇10 μmol/L為白藜蘆醇濃度。結(jié)果顯示，10 μmol/L的白藜蘆醇能夠明顯降低促凋亡蛋白Bax水平，升高抗凋亡蛋白Bcl-2水平，提示白藜蘆醇可能直接參與了線粒體途徑，從而調(diào)控胰島B細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，白藜蘆醇能明顯拮抗棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島B細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與其改變了抗凋亡蛋白以及促凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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收稿日期：2015-09-17

基金項(xiàng)目：上海市衛(wèi)生局基金課題(20124265)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603003

Mechanism of resveratrol in inhibiting apoptosis of B cells induced by palmitic acidinvitro

XU Bi-lin*,SHEN Tian,XIA Juan,YU Ming,ZHU Jin-yue,WANG Hong-ping

(Desect1ment of Endocrinology,Shanghai Putuo District Central Hospital,Shanghai 200062,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of resveratrol in inhibiting apoptosis of B cells induced by palmitic acid (PA),a free fatty acid,in vitro.MethodsB cells were treated with 10 μmol/L resveratrol+500 μmol/L palmitic acid in vitro,and were divided into three groups: blank group (excluding free fatty acids),PA group (500 μmol/L palmitic acid lipid medium),resveratrol group (10 μmol/L resveratrol+500 μmol/L palmitic acid),respectively.The percentage of apoptotic cells was calculated by flow cytometry.Bax and Bcl-2 mRNA were measured by RT-PCR.ResultsAt 24 h,compared with PA group,resveratrol could significantly decrease B cells apoptosis percentage (95.82%±1.94% vs.11.03%±1.08%,P<0.01) and Bax mRNA (0.185±0.005 vs.0.161±0.003,P<0.01),elevate Bcl-2 mRNA (0.004±0.001 vs.0.008±0.001,P<0.01).ConclusionResveratrol can significantly inhibit B cell apoptosis induced by palmitic acid in vitro.The mechanism may be related to the regulation of resveratrol on some apoptosis protein.

Key words：Cell apoptosis; Resveratrol; Palmitic acid