余美霞，劉　迅，倪　健，馮　磊，張　靈，申曉麗，胡東霞，周詠明*

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·論著·

曲古菌素A誘導(dǎo)淋巴瘤Raji細(xì)胞表達(dá)共刺激分子CD80及CD86的表達(dá)

余美霞1a，劉迅2，倪健3，馮磊1b，張靈1b，申曉麗1b，胡東霞1b，周詠明1b*

1.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院，a.婦產(chǎn)科，b.血液科，武漢430064；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院腎內(nèi)科，廣州510630；3.美國哈佛醫(yī)學(xué)院布里格姆女子醫(yī)院腫瘤臨床藥劑科，波士頓MA02115

[摘要]目的探討組蛋白去乙?；敢种苿┣啪谹(TSA)誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞Raji細(xì)胞表達(dá)共刺激分子CD80和CD86及其與免疫應(yīng)答的關(guān)系。方法采用MTT法和倒置相差顯微鏡觀察不同濃度TSA對Raji細(xì)胞的抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測150 nmol/L TSA作用Raji細(xì)胞后的細(xì)胞表達(dá)共刺激分子CD80和CD86及細(xì)胞活力，RT-PCR分析CD80 mRNA和CD86 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果TSA對Raji細(xì)胞的抑制作用具有時間和劑量依賴性，150 nmol/L TSA作用后可上調(diào)Raji細(xì)胞表達(dá)CD80，并對Raji細(xì)胞有直接殺滅作用。結(jié)論TSA可以誘導(dǎo)Raji細(xì)胞表達(dá)共刺激分子CD80,不表達(dá)CD86，促進(jìn)細(xì)胞的免疫應(yīng)答，為抗惡性血液病提供了一個新的免疫治療方法。

[關(guān)鍵詞]曲古菌素A；CD80；CD86；免疫應(yīng)答

0　引言

組蛋白去乙?；?HDCI)對癌細(xì)胞增殖起著關(guān)鍵作用，抑制HDCI是有前景的藥物靶目標(biāo)。HDCI抑制劑曲古菌素A(TSA)對各種惡性腫瘤均具有抗癌作用，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞因子的生長、轉(zhuǎn)錄和分化[1-2]。共刺激分子CD80與CD86屬于免疫球蛋白超家族，CD80(又稱B7-1)和CD86(又稱B7-2)主要表達(dá)于激活的單核細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等表面，靜止的B細(xì)胞表面CD86表達(dá)水平極低[3-4]。TSA在抗腫瘤過程中，能否提高腫瘤細(xì)胞表面共刺激分子CD80與CD86，促進(jìn)細(xì)胞的免疫應(yīng)答，目前知之甚少，本研究旨在探討TSA在刺激Raji細(xì)胞中CD80與CD86表達(dá)中的作用及其與免疫應(yīng)答的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1實驗材料TSA，分子式為C17H22N2O3，分子量為302.4，純度為98%，購自Sigma公司。用二甲亞砜稀釋成30 μmol/L，等量分裝。CD80與CD86抗體購自美國BD公司。RT-PCR試劑盒Trizol盒購自美國Gibco公司。噻唑藍(lán)(Thiazolyl blue，MTT)購自中健公司。引物由上海博亞公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Raji細(xì)胞株購自華中科技大學(xué)協(xié)和醫(yī)院血液研究所，小牛血清購自中美合資蘭州有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，CB150型CO2培養(yǎng)箱(德國Binder公司)，在5% CO2、37 ℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。定期換液傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2細(xì)胞增殖抑制試驗采用MTT法，調(diào)整Raji細(xì)胞濃度為5×104個，接種于96孔板，分設(shè)對照組(PBS液)和不同濃度(75、150、300、500 nmol/L)TSA組，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)6、12、24、48 h，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，然后傾去培養(yǎng)液，每孔加入MTT 20 μL(5 g/L)，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，120×g離心5 min，棄上清，每孔加入150 μL二甲亞砜(DMSO)終止，振蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定，490 nm波長檢測吸光度(A)，以對照組細(xì)胞活力為100%，按公式計算各組細(xì)胞抑制率=(1-實驗組A/對照組A)×100%。

1.2.3PI染色方法測定細(xì)胞活力PI染色方法在流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞活力，收獲150 nmol/LTSA處理12、24、48 h后的Raji細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用0.3 mL PBS重懸細(xì)胞，加入10 μL PI上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞活力。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測Raji細(xì)胞CD80與CD86的表達(dá)用24孔培養(yǎng)板以5×105/mL濃度接種Raji細(xì)胞到每孔中，將Raji細(xì)胞分設(shè)實驗組和對照組，實驗組每孔加入150 nmol/L TSA，分別刺激12、24和48 h后收獲細(xì)胞，用1 mL PBS液分別洗滌Raji細(xì)胞2次，加入20 μL CD80與CD86抗體孵育20 min，再用1 mL PBS液洗滌細(xì)胞1次，用0.3 mL PBS液重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5RT-PCR半定量檢測CD80與CD86 mRNA的表達(dá)分別取1×106Raji細(xì)胞和HL-60細(xì)胞，用PBS洗滌2次，使用Trizol試劑盒分別提取用150 nmol/L TSA作用12、24、48 h的Raji細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度法定量后，取5 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。以GAPDH為對照，分別取1 μL模板進(jìn)行PCGGAR反應(yīng)，相應(yīng)的引物序列及反應(yīng)條件分別如下：CD80(605 bp):上游引物5′-AGTACAAGAACCGGACCAT-3′，下游引物5′-GGCGTACACTTTCCCTTCTC-3′；94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，32個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。CD86(332 bp):上游引物5′-AGGACAAGGGCTTGTATCAA-3′，下游引物5′-ATTGCTCGTAACAGGGCTTGTATCAA-3′；94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)后72 ℃延伸7 min。GAPDH(456 bp):上游引物5′-GAGTGGTGAAGCGGAGTC-3′，下游引物5′-ATGACTGTCTGGAGGTTGTTC-3′。94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用UVP凝膠電泳分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶吸光度分析。

2　結(jié)果

2.1MTT實驗細(xì)胞存活率實驗顯示，不同濃度TSA均能抑制Raji細(xì)胞的生長，藥物作用效果具有一定的時效和量效關(guān)系，TSA對Raji細(xì)胞生長的抑制作用隨藥物濃度增加、作用時間延長而增強(qiáng)(圖1)。其中150 nmol/L濃度組具有較強(qiáng)的生長抑制作用，并且能較好保持細(xì)胞活力，因此本研究的其他相關(guān)實驗均選用150 nmol/L TSA作為實驗濃度。

圖1　不同濃度曲古霉素A抑制Raji細(xì)胞的時效和量效關(guān)系

2.2細(xì)胞活力的測定用150 nmol/L TSA處理Raji細(xì)胞12、24、48 h后，PI染色方法測定細(xì)胞活力分別為96.6%、92.3%、88.3%。用150 nmol/L TSA處理HL-60細(xì)胞12、24、48 h后，PI染色方法測定細(xì)胞活力分別為97.5%、93.7%、89.1%。

2.3TSA誘導(dǎo)Raji細(xì)胞CD80與CD86的表達(dá)未用TSA刺激Raji細(xì)胞之前，流式細(xì)胞儀檢測Raji細(xì)胞12、24、48 h表達(dá)CD80，分別為(76.2%±4.6%)、(78.7%±6.9%)、(79.2%±3.4%)，CD86表達(dá)極低，用150 nmol/L TSA處理Raji細(xì)胞12、24、48 h后，可上調(diào)Raji細(xì)胞表達(dá)CD80，分別為(82.4%±7.2%)(P<0.05)、(84.8%±5.6%)(P<0.05)、(93.9%±8.7%)(P<0.05)，CD86不上調(diào)。

2.4TSA對Raji細(xì)胞中CD 80 mRNA表達(dá)水平的分析150 nmol/L TSA處理Raji細(xì)胞12、24、48 h后，分別收獲細(xì)胞提取RNA進(jìn)行RT-PCR分析，RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。對照組為0.45±0.32。12 h后Raji細(xì)胞CD80 mRNA開始增強(qiáng)，為0.54±0.23(P<0.05)，24 h明顯增強(qiáng)(0.76±0.43)，(P<0.01)，48 h Raji細(xì)胞CD 80 mRNA增強(qiáng)更明顯(0.87±0.36),(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　討論

轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)的主要機(jī)制是組蛋白乙?；富蚪M蛋白去乙?；敢鸬娜旧w改變，據(jù)推測，組蛋白乙酰化促進(jìn)轉(zhuǎn)錄可能是通過釋放DNA特異性片斷，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來實現(xiàn)的。組蛋白乙?；负徒M蛋白去乙酰化酶平衡紊亂，會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。HDACIs可以抑制組蛋白去乙?；富钚裕黾訋追N基因的轉(zhuǎn)錄活性，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[5]。目前已知的HDACIs有丁酸鈉(Sodium butyrate，SB)[6]、TSA[7]、TrapoxinA(TPX)[8]、Spiruchostatin B(SP-B)[9]和MS275[10]等。

T細(xì)胞有多種生物學(xué)功能，可直接殺傷靶細(xì)胞，輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，對特異性抗原和促有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)以及產(chǎn)生細(xì)胞因子等，對機(jī)體中抗感染、抗腫瘤起著重要作用。T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫，細(xì)胞免疫的效應(yīng)形式主要有2種：與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，破壞靶細(xì)胞膜，直接殺傷靶細(xì)胞；另一種是釋放淋巴因子，最終擴(kuò)大和增強(qiáng)免疫效應(yīng)，國內(nèi)外對T細(xì)胞抗腫瘤的研究很廣泛。T細(xì)胞活化需要第一、第二信號，T細(xì)胞受體與抗原肽-MHC-Ⅱ類分子復(fù)合物特異性結(jié)合，提供T細(xì)胞活化的第一信號?？乖岢始?xì)胞(APC)和T細(xì)胞表面多種共刺激分子相互作用，為T細(xì)胞活化提供第二信號。共刺激分子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等)提供T細(xì)胞活化所必需的第二信號，啟動免疫應(yīng)答[11-12]。共刺激分子包括TNF/TNFR超家族，CD27/CD27L，CD30/CD30L，CD40/CD40L，OX40/OX40L，4-1BB/41BBL，RANK/RANKL，F(xiàn)as/FasL。免疫球蛋白超家族，LAF1-ICAM-1/ICAM-2/ICAM-3，CD28-B7-1/B7-2，CTLA4-B7-1/B7-2，B7-H1/H2/H3，Icos/GL50-B7HRP-1，PD-1/PDL1/PDL2等。在諸多黏附分子對中，最重要的為T細(xì)胞表面共刺激分子對CD80和CD86的相互作用。共刺激分子B7家族對激活和抑制T細(xì)胞免疫非常關(guān)鍵。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面不表達(dá)共刺激分子B7，或表達(dá)水平很低，不能使T細(xì)胞活化，從而使腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫的監(jiān)視[13]。國外學(xué)者研究表明，AML表達(dá)MHC-I抗原，但缺乏MHC-Ⅱ抗原和共刺激分子的表達(dá)，推測共刺激分子低表達(dá)是機(jī)體不能識別腫瘤細(xì)胞的主要原因[14]。

本研究中，Raji細(xì)胞高表達(dá)CD80，低表達(dá)CD86，應(yīng)用TSA刺激12、24、48 h后，CD80上調(diào)明顯(P<0.05)，CD86上調(diào)不明顯。RT-PCR檢測亦證實TSA可上調(diào)Raji細(xì)胞表達(dá)共刺激分子CD80 mRNA的表達(dá)，CD86 mRNA無明顯變化，說明TSA可上調(diào)Raji細(xì)胞表面的共刺激分子。本研究還發(fā)現(xiàn)，TSA可抑制細(xì)胞生長，應(yīng)用TSA刺激后，PI檢測Raji壞死細(xì)胞明顯增多，說明TSA對腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用。有研究表明，敲除CD80的小鼠有正常的免疫力，而敲除CD86的小鼠則有嚴(yán)重的免疫缺陷，說明淋巴瘤患者高表達(dá)共刺激分子CD80而仍易患淋巴瘤[3]。Khan等[4]用TSA刺激多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞J558，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定TSA可誘導(dǎo)J558表達(dá)共刺激分子CD40、CD80和CD86，25 nmol/L TSA在24 h可提高J558細(xì)胞表達(dá)CD40、CD80和CD86 30%～40%，75 nmol/L可提高90%以上；J558細(xì)胞內(nèi)加入TSA共同培養(yǎng)后注入小鼠內(nèi)，當(dāng)用10 nmol/L TSA僅引起低水平CD40表達(dá)而CD80、CD86不表達(dá)時，幾乎全部小鼠均患腫瘤，與對照組沒有區(qū)別；用25 nmol/L TSA加入J558細(xì)胞內(nèi)，10 d內(nèi)有70%的小鼠免于腫瘤，對照組全部患腫瘤。研究亦表明TSA可導(dǎo)致J558凋亡，說明TSA的抗腫瘤作用是通過加強(qiáng)免疫反應(yīng)進(jìn)行，亦有直接殺滅腫瘤細(xì)胞作用，與本研究一致。此外，HDACIs可引起細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞分化和凋亡[15]，HDACIs可刺激胎兒血紅蛋白產(chǎn)生，對海洋性貧血和鐮狀細(xì)胞貧血有很好的療效[16]，在癌癥治療中，對ATRA和三氧化二砷難治的急性早幼粒白血病，HDACIs是一個有前景的治療藥物[17-18]，而且HDACIs也能誘導(dǎo)大多數(shù)AML細(xì)胞分化和凋亡[19-20]。

綜上所述，TSA可提高Raji細(xì)胞表達(dá)共刺激分子CD80和CD86，促進(jìn)細(xì)胞的免疫應(yīng)答，加強(qiáng)抗腫瘤作用，為抗惡性淋巴瘤提供了一個新的免疫治療方法。

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收稿日期：2015-09-08

基金項目：湖北省教育廳基金資助項目(530026)；江西省自然科學(xué)基金資助項目(0640190)；武漢科技大學(xué)專項基金資助項目(zx0802)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603001

Expression of costimulatory molecule CD80 and CD86 in Raji cells induced by trichostatin A

YU Mei-xia1a，LIU Xun2，NI Jian3，F(xiàn)ENG Lei1b，ZHANG Ling1b,SHEN Xiao-li1b,HU Dong-xia1b，ZHOU Yong-ming1b*

(1.a.Desect1ment of Gynecology and Obstetrics,b.Desect1ment of Hematology,the Affiliated Tianyou Hospital,Wuhan University of Science and Technology,Wuhan 430064,China;2.Division of Nephrology,the 3rd Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510630,China;3.Desect1ment of Oncology Clinical Pharmacy,Brigham and Women′s Hospital,Harvard Medical School,Boston MA 02115,USA)

【Abstract】ObjectiveTo explore the expression of costimulatory molecule CD80 and CD86 in myeloid lymphoma Raji cells induced by histone deacetylase inhibitors trichostatin A (TSA) as well as its relationship with immune response.MethodsThe proliferative activity of Raji cells was assessed by morphology and MTT assay.The expression of CD80 and CD86 was confirmed,and cells viability was examined by Flow Cytometer after managing Raji cells with 150 nmol/L TSA.The expression status of CD80 and CD86 mRNA was analyzed by RT-PCR.ResultsA time-and dose-dependent inhibition was detected in Raji cells treated with TSA.After TSA(150 nmol/L) treatment,the expression of CD80 was up-regulatied in Raji cells.Raji cells were directly killed.ConclusionTSA can induce costimulatory molecular CD80 expression of Raji cells,improve immune response of cells,and provide a novel immunotherapy for fighting against lymphoma disease.

Key words：Trichostatin A; CD80; CD86; Immune response