馮俊宸,徐華能（.上海外國語大學(xué)附屬外國語學(xué)校，上海 00083；.上海市農(nóng)藥研究所，上海 0003）

快速檢測農(nóng)藥殘留技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

馮俊宸1,徐華能2
（1.上海外國語大學(xué)附屬外國語學(xué)校，上海 200083；2.上海市農(nóng)藥研究所，上海 200032）

主要綜述了目前廣泛應(yīng)用的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)酶抑制檢測法、酶聯(lián)免疫檢測法、活體生物測定法、生物傳感器法等快速測定方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)。

農(nóng)藥殘留；酶抑制；酶聯(lián)免疫；活體生物測定；生物傳感器；

農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的地位和作用不容置疑。如不使用農(nóng)藥，農(nóng)作物的產(chǎn)量將減少1/3。但是由于部分使用者未規(guī)范、正確使用農(nóng)藥（如超范圍或超劑量使用等），導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥品種及殘留量超出安全標(biāo)準(zhǔn)，給食品帶來了很大的安全隱患。當(dāng)前我國政府正在不斷加強(qiáng)食品安全（尤其是農(nóng)產(chǎn)品的食品安全）保障工作，對農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行規(guī)范監(jiān)測就是其中一項(xiàng)重要的措施。為此，農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的改進(jìn)，檢測技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確率的提高以及對快速檢測分析新技術(shù)的開發(fā)與建立，已經(jīng)顯得日益迫切和十分重要。直接檢測農(nóng)藥分子的常規(guī)農(nóng)藥殘留分析方法，存在著樣品前處理復(fù)雜，儀器設(shè)備昂貴，分析時(shí)間長等問題。這些方法已不能滿足諸如大型農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場、超市等現(xiàn)場快速檢測某些高毒農(nóng)藥的需求，促使人們運(yùn)用新的原理和方法去開發(fā)特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、結(jié)果確定的快速檢測新技術(shù)。本文主要綜述了目前廣泛應(yīng)用的酶聯(lián)免疫分析方法、酶抑制法、活體生物測定方法和生物傳感器法等快速測定方法的應(yīng)用現(xiàn)狀［1］。

1 酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）

1.1 原理

ELISA的核心技術(shù)是抗原抗體的特異性反應(yīng)。ELISA的基本原理是將抗原抗體之間的特異性免疫反應(yīng)和酶對底物的高度催化效應(yīng)結(jié)合起來，以酶促反應(yīng)的放大作用來顯示初級(jí)免疫反應(yīng)。它既可測抗原，也可測抗體［2］。

1.2 方法

EUSA需要固相載體作為吸附劑，用固相載體吸附抗體（抗原），加待測抗原（抗體），再與相應(yīng)酶標(biāo)記抗體（抗原）進(jìn)行抗原抗體特異免疫反應(yīng)，生成抗體（抗原）-待測抗原（抗體）-酶標(biāo)記抗體（抗原）復(fù)合物，最后再與該酶底物發(fā)生反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。待測抗原（抗體）的量與有色產(chǎn)物量成正比，因此可借吸光度值計(jì)算抗原（抗體）量。ELISA法既可進(jìn)行定性測定，又可進(jìn)行定量測定。在上述反應(yīng)中，酶促反應(yīng)只進(jìn)行一次，而抗原一抗體免疫反應(yīng)可進(jìn)行一次或數(shù)次［3］。

1.3 應(yīng)用

ELISA技術(shù)還可應(yīng)用于食品中其他成分的測定，⑴ 抗?fàn)I養(yǎng)素因子如大豆及其制品中的胰蛋白酶抑制因子；⑵ 食品營養(yǎng)成分如牛初乳中乳鐵蛋白含量等；⑶ 食品加工過程中的酶的含量變化；⑷ 檢測某些特定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)蛋白，以分析食品是否來自轉(zhuǎn)基因生物或者含有轉(zhuǎn)基因成分［4］。

1.4 影響因素

影響因素一般涉及到樣本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷、結(jié)果報(bào)告和解釋等方面［5］。

1.5 前景

免疫分析法以其固有的優(yōu)勢，在農(nóng)藥殘留分析中日益顯示出強(qiáng)大的應(yīng)用前景。其中以EUSA技術(shù)最活躍，EUSA具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡便、痕量檢測，以及可大批量樣本檢測的優(yōu)點(diǎn)，其檢測限可達(dá)到納克甚至更低濃度。到現(xiàn)在為止，國際上已有上百種農(nóng)藥可用免疫分析法檢測，且已制成商品化快速檢測試劑盒或試劑條。目前我國已研制出6種農(nóng)藥殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（甲霜靈、甲胺磷、毒死蜱、對硫磷、2,4-滴、百菌清），膠體金免疫快速檢測試紙16種（3,5,6一三氯二吡啶醇、苯菌靈、除草定、丁草胺、毒死蜱、禾草靈、甲草胺、甲萘威、甲霜靈、霜霉威、西瑪津、溴苯腈、乙草胺、異丙草胺、異丙甲草胺、莠去津）。另外研制出高效快速檢測生物毒素的免疫檢測試劑盒13種和免疫膠體金紙條5種；研制出獸藥殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒11種，其中有些試劑盒已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。與國外相比，國內(nèi)在這方面的研究相對較少，但正越來越受到研究檢測工作者的高度重視。目前研發(fā)各種農(nóng)藥殘留檢測試劑盒的步伐日益加快，所以ELISA法在農(nóng)藥殘留檢測中將有廣闊的應(yīng)用前景［6］。

抗體特異性及靈敏性雖有較大程度提高，但仍不能同時(shí)檢測數(shù)10種甚至更多農(nóng)藥殘留。用于食品農(nóng)藥殘留檢測，在檢測單個(gè)農(nóng)藥時(shí)具有快速、方便等優(yōu)點(diǎn)。但由于農(nóng)藥品種繁多及混配使用等原因，在檢測大批樣品時(shí)，仍顯得無能為力［6］。

2 酶抑制法

酶抑制法是一種簡便、靈敏、經(jīng)濟(jì)的快速檢測方法，是相對成熟的一種速測部分農(nóng)藥殘留技術(shù)。它基于有機(jī)磷農(nóng)藥對酶活性的抑制作用，適用于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥。在目前條件下，酶抑制法是凈化蔬菜市場的一種有效可行的方法，其優(yōu)點(diǎn)是能對抑制膽堿酯酶的農(nóng)藥品種進(jìn)行快速靈敏的檢測，樣品前處理簡單，檢測時(shí)間短，所需儀器設(shè)備簡單，適用于現(xiàn)場測定。缺點(diǎn)是使用的酶基質(zhì)和顯色劑有一定的特異性，需控制的條件較多［2］。

2.1 影響因素

2.1.1 溫度和pH對酶促反應(yīng)的影響

酶的活性都隨著溫度的升高先升高后降低［5］。

2.1.2 時(shí)間對酶促反應(yīng)的影響［5］

隨反應(yīng)時(shí)間延長，反應(yīng)速度下降。酶的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該在初速度時(shí)間范圍內(nèi)選擇。

2.1.3 溫度對農(nóng)藥抑制作用的影響

在一定的溫度范圍內(nèi)（25～45 ℃）植物酯酶和乙酰膽堿酯酶受到農(nóng)藥的抑制作用都是隨著溫度的升高而增強(qiáng)［5］。

2.2.4 時(shí)間對農(nóng)藥抑制作用的影響

抑制時(shí)間越長，農(nóng)藥的抑制作用越強(qiáng)［5］。

2.2 分類

酶抑制法根據(jù)所使用的酶的種類不同可大致分為2類：膽堿酯酶法和植物酯酶法。

2.2.1 膽堿酯酶法

2.2.1.1 原理

乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制法的檢測原理以乙酰膽堿為底物，在AChE的作用下，乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，膽堿和二硫?qū)ο趸郊姿幔―TNB）產(chǎn)生顯色反應(yīng)，使反應(yīng)液呈黃色［2］。

2.2.1.2 特點(diǎn)

該法操作簡單，測定所需的時(shí)間短，不需要貴重的儀器，費(fèi)用較低，適合于現(xiàn)場的快速檢測。AChE抑制法雖然在回收率和精密度上較經(jīng)典方法差一些，但可以滿足半定量的要求，適合于我國小規(guī)模分散式的農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)與經(jīng)銷體系。另外，各種農(nóng)藥因其化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理不同對AChE的抑制能力也不相同，氧化型有機(jī)磷的抑制能力較強(qiáng)，AChE抑制法對其的靈敏度較高，最小檢出濃度較低；而硫代型有機(jī)磷的抑制能力較差，最小檢出濃度較高；但辛硫磷因?yàn)楹须炕x擇毒力大大增強(qiáng)，最小檢出濃度較低；對氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測靈敏度相對都較高［4］。

2.2.2 植物酶抑制法

2.2.2.1 原理

植物酯酶水解2,6-二氯乙酰靛酚，水解產(chǎn)物靛酚為藍(lán)色，最大吸收波長為605 nm。根據(jù)反應(yīng)溶液在水解前后顏色的變化，用目測或儀器來判定農(nóng)藥對酶的抑制程度，從而判斷有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留量［2］。

2.2.2.2 特點(diǎn)

在利用酶抑制原理測定農(nóng)藥殘留的方法中，植物酯酶與動(dòng)物酯酶相比，抑制程度的各項(xiàng)指標(biāo)均不遜色很多，同時(shí)又具有酶源方便易得，提取、保存方便，成本低等優(yōu)勢。但是目前的研究表明植物酯酶方法的精確度和靈敏度不及乙酰膽堿酯酶法，乙酰膽堿酯酶法的檢出限數(shù)量級(jí)在0.001 mg/kg附近，而植物酯酶法只能在0.1 mg/kg附近，靈敏度較低［4］。

3 活體生物測定

3.1 原理

活體檢測法是使用活的生物體直接測定。如農(nóng)藥與細(xì)菌作用后可影響細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度，以檢測農(nóng)藥殘留量［2］。

3.2 方法

3.2.1 用發(fā)光細(xì)菌檢測農(nóng)藥殘留

發(fā)光細(xì)菌體內(nèi)的熒光素在有氧時(shí)經(jīng)熒光酶的作用會(huì)產(chǎn)生熒光，但當(dāng)受到某些有毒化合物的作用時(shí)光會(huì)減弱，其減弱的程度與有毒物的濃度呈一定的線性關(guān)系。利用這一特點(diǎn)對農(nóng)藥殘留試樣進(jìn)行測定。該方法的特點(diǎn)是快速、簡便、靈敏、價(jià)廉，適合于現(xiàn)場，缺點(diǎn)是農(nóng)藥濃度與發(fā)光強(qiáng)度的線性關(guān)系不夠準(zhǔn)確，只能用于半定量測定［3］。

3.2.2 用家蠅檢測蔬菜中的殘留農(nóng)藥

以采收前1～2 d的蔬菜為檢測對象，隨機(jī)抽取檢測樣品，將家蠅放于菜汁中，接觸后3～4 h觀察死亡率，并且需要用無農(nóng)藥污染的蔬菜作為對照。死亡率在4%以下為安全或較安全；死亡率為5%～10%，蔬菜中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)；死亡率大于11%，表示污染嚴(yán)重或極嚴(yán)重。該方法的優(yōu)點(diǎn)是無需儀器，無需前處理，過程簡單。缺點(diǎn)是無法定量，檢測時(shí)間比較長，敏感性家蠅飼養(yǎng)比較困難［3］。

4 生物傳感器法

生物傳感器是將傳感技術(shù)與農(nóng)藥免疫技術(shù)相結(jié)合而建立起來的，可以說它是免疫分析技術(shù)的一種延伸或分支。根據(jù)生物功能不同主要分為不同類型傳感器，利用農(nóng)藥對靶酶活性的抑制作用研制傳感器時(shí)，應(yīng)選擇活性高而其活性對農(nóng)藥敏感的酶作為生物傳感器稱為酶傳感；利用農(nóng)藥與特異性抗體結(jié)合特性研制免疫傳感器；另外還有微生物傳感器和組織傳感器等［3］。

4.1 原理

生物敏感膜內(nèi)含有能與目標(biāo)物進(jìn)行選擇性作用的生物活性組分；換能器則能敏感捕捉生物活性組分與目標(biāo)物之間的作用過程，并將其表達(dá)為可檢測的物理信號(hào)。當(dāng)待測物與具有分子識(shí)別作用的利用特殊技術(shù)固定在換能器內(nèi)（或表面）的生物活性因子作用時(shí)，產(chǎn)生光學(xué)、熱學(xué)、壓電學(xué)或電化學(xué)等響應(yīng)信號(hào)，最后把所得的電信號(hào)經(jīng)過電子技術(shù)的處理后，在儀器上顯示或記錄下來，其信號(hào)大小與分析物含量或濃度存在定量關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對待測物質(zhì)的定量檢測［2］。

4.2 應(yīng)用

Ngeh-Ngwainbi等最早研究成功了對硫磷的生物傳感器，以后又有人制成了光導(dǎo)纖維免疫傳感器，利用熒光標(biāo)記抗體產(chǎn)生的反應(yīng)，分析測定對硫磷在溶液中含量。生物傳感器能廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生物、臨床化學(xué)和診斷、農(nóng)業(yè)和畜牧獸醫(yī)、化學(xué)分析、軍事、過程控制與監(jiān)測、環(huán)境監(jiān)控與保護(hù)等領(lǐng)域。隨著生物、化學(xué)、物理學(xué)、醫(yī)學(xué)、電子技術(shù)等相關(guān)學(xué)科的迅速發(fā)展，生物傳感器的發(fā)展也被帶動(dòng)，各種類型的生物傳感器相繼出現(xiàn)［4］。

生物傳感器相對于酶免疫吸附測定法的優(yōu)點(diǎn)是簡單、快速且減少了樣品的前處理。適于野外快速監(jiān)測，減少有機(jī)溶劑使用量。雖然生物傳感器在實(shí)驗(yàn)室條件下使用狀態(tài)良好，但在實(shí)際中還沒有廣泛應(yīng)用，其最大優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定性、精確度和可信度高。它的缺點(diǎn)是一種傳感器只能對應(yīng)一種或一類農(nóng)藥，應(yīng)用范圍窄，研究過程長，不易制備［4］。

生物傳感器是一門跨學(xué)科的高新技術(shù)，起步較晚，研制過程有諸多難點(diǎn)，在實(shí)際推廣應(yīng)用中還有許多待探索和改進(jìn)的地方。⑴ 生物傳感器壽命、穩(wěn)定性及制備的復(fù)雜性制約著研究成果商品化與批量生產(chǎn)；⑵ 穩(wěn)定性：由于生物單元的引入，生物結(jié)構(gòu)固有的不穩(wěn)定、易變性給生物傳感器的應(yīng)用帶來不少困難［6］。

［1］曾小嵐, 張歆, 付東亮, 等. 酶抑制法檢測蔬菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥［J］.環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù), 2004, 16（6）:12-14.

［2］邱靜. 我國主要農(nóng)藥殘留快速檢測方法及產(chǎn)品現(xiàn)狀分析［J］. 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全, 2011（5）: 41-46.

［3］謝艷姣, 吳榮順, 苑婷婷. 農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 中國果菜, 2015（12）: 31-34.

［4］鄧敏姬, 鄧敏航, 鄭琪, 等. 農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 廣西熱帶農(nóng)業(yè), 2010（5）: 7-11.

［5］楊靚, 劉小娟, 郭玉雙. 農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012（10）: 150-153.

［6］王亮, 潘琇, 徐婉莉, 等.食品農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］.溫州農(nóng)業(yè)科技, 2005（10）: 10-12.

Research of Rapid Detection of Pesticide Residue Technology

FENG Jun-cheng, XU Hua-neng
（1.Shanghai Foreign Language School Affiliated SISU, Shanghai 200083, China; 2.Shanghai Pestcide Research Institute, Shanghai 200032, China）

The detection techniques of the pesticide residues currently widely used are the enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme inhibition assay, in vivo bioassay and biological sensors. The paper introduces the principles, advantages and weaknesses and progress of those rapid determination methods.

pesticide residues; enzyme-linked immunosorbent assay; enzyme inhibitor; vivo bioassay; biological sensors

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2016.02.07

TQ450

A

1009-6485（2016）02-026-04

馮俊宸（1999—），男，上海人，參與開發(fā)了“Pesticide Kille”農(nóng)殘快速檢測試劑盒，取得SAGE 2015中國區(qū)第3名。

徐華能（1979—），男，上海人，高級(jí)工程師，主要從事農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作。E-mail: xuhuaneng@cnshspl.com。

2016-03-20。