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        水稻抗二化螟特性鑒定技術(shù)的評(píng)價(jià)研究

        2016-08-15 11:53:06劉顯波謝黎虹唐紹清凃巨民胡培松羅炬中國(guó)水稻研究所杭州30006浙江大學(xué)杭州30000通訊作者luojuricecom
        中國(guó)稻米 2016年4期
        關(guān)鍵詞:水稻方法

        劉顯波 謝黎虹 唐紹清 凃巨民 胡培松 羅炬(中國(guó)水稻研究所,杭州30006;浙江大學(xué),杭州30000;通訊作者:luojurice@6.com)

        水稻抗二化螟特性鑒定技術(shù)的評(píng)價(jià)研究

        劉顯波1謝黎虹1唐紹清1凃巨民2胡培松1羅炬1*
        (1中國(guó)水稻研究所,杭州310006;2浙江大學(xué),杭州310000;*通訊作者:luojurice@126.com)

        采用離體葉片、離體莖稈、離體剝開(kāi)莖稈及活體成株4種室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定方法,對(duì)相同水稻材料進(jìn)行抗二化螟特性鑒定,同時(shí)對(duì)這些水稻室內(nèi)抗二化螟鑒定技術(shù)進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,這些方法的抗性鑒定結(jié)果高度吻合,離體葉片鑒定方法是目前最快速、有效的抗二化螟鑒定方法。并通過(guò)離體葉片和活體成株鑒定方法對(duì)轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻材料進(jìn)行鑒定,再次驗(yàn)證了離體葉片鑒定方法的有效性。此外,初步發(fā)現(xiàn)對(duì)于同為鱗翅目水稻害蟲(chóng)稻縱卷葉螟,用離體葉片鑒定方法也可進(jìn)行有效鑒定。

        水稻;二化螟;抗性鑒定;技術(shù)評(píng)價(jià)

        水稻是我國(guó)主要的糧食作物,近20年水稻播種面積占全國(guó)糧食播種面積的比例一直穩(wěn)定在27%~28%,水稻總產(chǎn)占全國(guó)糧食總產(chǎn)的1/3以上(數(shù)據(jù)來(lái)源于中國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局,http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj),超過(guò)一半以上的人口以稻米為主食,水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)對(duì)保障我國(guó)糧食安全至關(guān)重要。稻飛虱、二化螟和稻縱卷葉螟是我國(guó)水稻生產(chǎn)中最主要的害蟲(chóng),常年給水稻造成巨大的產(chǎn)量損失,2001-2004年間全國(guó)水稻病蟲(chóng)害發(fā)生面積超過(guò)850萬(wàn)hm2次,其中,2003年稻飛虱、稻縱卷葉螟、水稻螟蟲(chóng)發(fā)生面積占病蟲(chóng)害總發(fā)生面積的72.5%[1]。據(jù)全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心統(tǒng)計(jì),自2003年大爆發(fā)以來(lái)稻縱卷葉螟年發(fā)生2 000萬(wàn)hm2次以上,自2000年來(lái)螟蟲(chóng)的危害維持在2 000萬(wàn)hm2次左右。農(nóng)藥的大量使用造成了環(huán)境污染、生產(chǎn)成本增加。因此,培育抗蟲(chóng)(稻飛虱、二化螟和稻縱卷葉螟等)水稻新品種并應(yīng)用于生產(chǎn)是解決上述問(wèn)題最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。而建立水稻材料抗蟲(chóng)性的有效鑒定體系是進(jìn)行抗蟲(chóng)育種的根本基礎(chǔ)。

        二化螟Chilosuppressalis(Walker)屬于鉆蛀性害蟲(chóng),在水稻分蘗期危害造成枯鞘、枯心苗,在穗期危害造成傷株和白穗,系水稻3個(gè)主要害蟲(chóng)之一;然而對(duì)水稻抗二化螟特性的高效準(zhǔn)確鑒定難度大,其原因主要有:幼蟲(chóng)容易轉(zhuǎn)株為害、試驗(yàn)中易發(fā)生逃逸;接蟲(chóng)時(shí)二化螟的活性強(qiáng)弱、受鑒水稻材料的發(fā)育階段以及環(huán)境條件如溫度、濕度等諸多因素影響,試驗(yàn)條件難以保證高度一致;鑒定操作流程多且復(fù)雜,易出現(xiàn)偏差。早在1985年國(guó)際水稻研究所提出了活體成株抗蟲(chóng)鑒定方法和抗級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[2];2000年葉恭銀等提出利用離體葉片用于轉(zhuǎn)蘇云金桿菌毒蛋白基因水稻的二化螟鑒定,研究發(fā)現(xiàn),鑒定結(jié)果與活體成株鑒定法所取得的結(jié)果相吻合[3];2002年姚青等發(fā)明了離體稻株抗二化螟鑒定技術(shù),該方法可靠而且準(zhǔn)確[4]。2010年四川省制定“水稻抗二化螟鑒定技術(shù)規(guī)程”地方標(biāo)準(zhǔn)(DB51),包括田間鑒定和離體莖稈鑒定方法[5],這些鑒定方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。由于是不同的研究者利用不同的材料在不同的時(shí)期用不同的方法進(jìn)行室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定,鑒定方法和鑒定結(jié)果的有效性需要進(jìn)一步明確[6]。鑒于此,筆者利用同一批水稻材料,采用離體葉片、離體莖稈、離體剝開(kāi)莖稈及活體成株等多種室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定方法進(jìn)行抗蟲(chóng)性鑒定比較,以期對(duì)這些水稻室內(nèi)抗二化螟鑒定技術(shù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),為有效鑒定和評(píng)價(jià)水稻抗二化螟能力提供技術(shù)支撐。同時(shí),選擇綜合評(píng)價(jià)最優(yōu)方法對(duì)同為鱗翅目水稻害蟲(chóng)稻縱卷葉螟進(jìn)行抗蟲(chóng)性鑒定,以期找到一種方便快捷的稻縱卷葉螟抗蟲(chóng)性鑒定方法。

        1 材料與方法

        1.1供試蟲(chóng)準(zhǔn)備

        供試驗(yàn)用二化螟卵塊購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。將購(gòu)買(mǎi)的卵塊置于培養(yǎng)皿中,保持一定的溫度(25℃~28℃)和濕度(RH 80%~90%),直至孵化,取剛剛孵化的幼蟲(chóng)供正式試驗(yàn)用。稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)及蟲(chóng)卵在中國(guó)水稻研究所富陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地試驗(yàn)田內(nèi)采集。

        1.2供試水稻材料

        供試水稻材料包括臺(tái)中在來(lái)1號(hào)(簡(jiǎn)稱(chēng)TN 1,感蟲(chóng)對(duì)照)、轉(zhuǎn)cry1Ab/1Ac基因水稻華恢1號(hào)(抗蟲(chóng)對(duì)照)及其非轉(zhuǎn)基因受體材料明恢63、轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻及其非轉(zhuǎn)基因受體材料日本晴。

        1.3試驗(yàn)地點(diǎn)及種植方式

        試驗(yàn)在中國(guó)水稻研究所富陽(yáng)轉(zhuǎn)基因中試基地進(jìn)行,供試水稻材料5月25日播種,單本分別移栽至大田和塑料桶中,大田每個(gè)材料種植4行8株,每個(gè)材料種植25個(gè)塑料桶。整個(gè)生育期間不施任何殺蟲(chóng)劑。

        1.4華恢1號(hào)陽(yáng)性株鑒定

        取華恢1號(hào)水稻葉片放置于1.5 mL離心管中研磨,并以蒸餾水抽提和稀釋?zhuān)瑢ry1Ab/1Ac膠體金免疫檢測(cè)試紙條(美國(guó)一龍公司)插入樣品液,5min后觀(guān)察結(jié)果。在試紙條上出現(xiàn)1條檢測(cè)線(xiàn)和1條質(zhì)控線(xiàn)為陽(yáng)性(含毒蛋白),記為“+”;僅出現(xiàn)1條質(zhì)控線(xiàn)為陰性(無(wú)毒蛋白),記為“-”。

        1.5抗螟性鑒定方法

        1.5.1離體葉片法

        參考農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測(cè)抗蟲(chóng)水稻抗蟲(chóng)性鑒定標(biāo)準(zhǔn)》(農(nóng)業(yè)部953公告-8.1-2007)中的方法,在水稻分蘗中期,分別從各供試材料的單本種植的稻株中,隨機(jī)從3個(gè)分蘗上剪取3~4 cm長(zhǎng)的葉片(倒1葉)各1片。隨后在葉片兩端壓上用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過(guò)的小濾紙片,將葉片移置小平底玻管(9.5 cm×1.5 cm)內(nèi)徑,然后每管分別接入12頭蟻螟(二化螟或稻縱卷葉螟),管口塞緊脫脂棉花。第4天向管內(nèi)添加新鮮供試葉片2~3片,自開(kāi)始接蟲(chóng)后第7天檢查葉片,記錄幼蟲(chóng)存活數(shù),對(duì)每個(gè)玻璃管的活蟲(chóng)體質(zhì)量進(jìn)行稱(chēng)量。每個(gè)株系鑒定10株,2次重復(fù)。

        根據(jù)試蟲(chóng)存活情況,計(jì)算各供試材料每個(gè)株系的試蟲(chóng)死亡率,并參照感蟲(chóng)對(duì)照的平均試蟲(chóng)死亡率計(jì)算試蟲(chóng)校正死亡率和平均校正死亡率,根據(jù)校正死亡率劃分抗、感等級(jí),評(píng)價(jià)供試材料的抗二化螟或稻縱卷葉螟特性。校正死亡率=(供試材料試蟲(chóng)死亡率-感蟲(chóng)對(duì)照試蟲(chóng)平均死亡率)/(1-感蟲(chóng)對(duì)照試蟲(chóng)平均死亡率)× 100。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):

        級(jí)別抗性幼蟲(chóng)校正死亡率

        0級(jí)HR(高抗)>80%

        1級(jí)R(抗)60.1%~80%

        3級(jí)MR(中抗)40.1%~60%

        5級(jí)MS(中感)20.1%~40%

        7級(jí)S(感)<20%

        9級(jí)HS(高感)全部死亡

        1.5.2離體莖稈法

        取分蘗盛期的主分蘗稻苗2根,把稻苗擦干,將2根稻苗截取成包含葉鞘的5 cm莖稈2根,隨后在莖稈兩端壓上用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過(guò)的小濾紙片。然后每根莖稈分別接入6頭二化螟蟻螟,將2根莖稈移置小平底玻管(9.5 cm×1.5 cm)內(nèi)徑,管口塞緊脫脂棉花。接蟲(chóng)后第7天分別考查或測(cè)定幼蟲(chóng)死亡率和活蟲(chóng)體質(zhì)量。其間,于第3天在莖稈兩端增加用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過(guò)的小濾紙片確保莖稈濕潤(rùn)。每個(gè)株系鑒定5株,2次重復(fù)。結(jié)果統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)同離體葉片法。

        1.5.3離體剝開(kāi)莖稈法

        取分蘗盛期的主分蘗稻苗2根,把稻苗擦干,將2根稻苗截取成包含葉鞘的5 cm莖稈2根,將莖稈剝開(kāi),用細(xì)毛筆輕輕將12頭二化螟蟻螟接種在剝開(kāi)的莖稈中(每個(gè)莖稈接蟲(chóng)6頭),隨后在莖稈兩端壓上用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過(guò)的小濾紙片,將莖稈移置小平底玻管(9.5 cm×1.5 cm)內(nèi)徑,管口塞緊脫脂棉花。接蟲(chóng)后第7天分別考查或測(cè)定幼蟲(chóng)死亡率和活蟲(chóng)體質(zhì)量。其間,于第3天在莖稈兩端增加用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過(guò)的小濾紙片確保莖稈保濕。每個(gè)株系鑒定5株,2次重復(fù)。結(jié)果統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)同離體葉片法。

        1.5.4活體成株抗蟲(chóng)性鑒定法

        參照國(guó)際水稻研究所抗蟲(chóng)鑒定方法,將種植在塑料桶中且?guī)?~3個(gè)分蘗的稻株搬至溫室,用細(xì)毛筆輕輕將二化螟蟻螟接種在夾于莖稈與葉鞘之間的葉舌處,每株接10頭,并加塑料網(wǎng)罩(直徑20 cm,高70 cm)。接蟲(chóng)后2周移去網(wǎng)罩。接蟲(chóng)后15 d、30 d考查各稻株中有無(wú)枯心,調(diào)查枯心率和枯心指數(shù)。每個(gè)株系鑒定10株,2次重復(fù)。枯心率(%)=單株枯心數(shù)/單株分蘗數(shù)。參照Heinrichs[2]溫室鑒定二化螟抗性按枯心指數(shù)進(jìn)行分級(jí)評(píng)定??剐詷?biāo)準(zhǔn):

        級(jí)別抗性枯心指數(shù)

        0級(jí)HR(高抗)無(wú)害

        1級(jí)R(抗)<20%

        3級(jí)MR(中抗)20.1%~40%

        5級(jí)MS(中感)40.1%~60%

        7級(jí)S(感)60.1%~80%

        9級(jí)HS(高感)>80%

        2 結(jié)果與分析

        2.1華恢1號(hào)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性檢測(cè)

        在移栽至大田和塑料桶1周后,對(duì)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號(hào)所有的單株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性檢測(cè),剔除陰性單株,防止陰性單株與陽(yáng)性單株抗蟲(chóng)性差異造成的試驗(yàn)誤差。選取陽(yáng)性單株進(jìn)行抗蟲(chóng)性鑒定,結(jié)果見(jiàn)圖1。

        2.24種室內(nèi)抗蟲(chóng)鑒定方法的吻合性比較

        表1 利用離體葉片、離體莖稈和離體剝離莖稈法對(duì)水稻材料抗二化螟特性評(píng)價(jià)結(jié)果

        表2 利用活體成株鑒定法對(duì)水稻材料進(jìn)行二化螟抗性評(píng)價(jià)結(jié)果

        表3 利用離體葉片鑒定法對(duì)水稻材料抗稻縱卷葉螟特性評(píng)價(jià)結(jié)果

        圖1 華恢1號(hào)的Cry1Ab/1Ac蛋白檢測(cè)結(jié)果

        分別利用離體葉片、離體莖稈、離體剝開(kāi)莖稈鑒定技術(shù)對(duì)感蟲(chóng)對(duì)照TN1、抗蟲(chóng)對(duì)照華恢1號(hào)及常規(guī)稻明恢63等3份水稻材料進(jìn)行抗二化螟特性鑒定,結(jié)果如表1。從表1可以看出,感蟲(chóng)對(duì)照TN1各重復(fù)均表現(xiàn)為不抗二化螟,表現(xiàn)穩(wěn)定;以TN1作為參照,抗蟲(chóng)對(duì)照華恢1號(hào)的校正死亡率為100%,表現(xiàn)為高抗二化螟;而常規(guī)稻明恢63 3種鑒定方法的平均校正死亡率在3.44%~13.56%之間,表現(xiàn)為感二化螟,方差分析表明,3種鑒定方法結(jié)果無(wú)顯著差異。利用活體成株鑒定方法對(duì)同樣3個(gè)品種進(jìn)行二化螟抗性評(píng)估,結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可見(jiàn),TN1枯心率達(dá)100%,華恢1號(hào)未發(fā)現(xiàn)枯心,分別表現(xiàn)為高感和高抗二化螟,與離體葉片法、離體莖稈法、離體剝開(kāi)莖稈法鑒定結(jié)果相吻合;常規(guī)稻明恢63接蟲(chóng)后第15天和第30天的枯心率分別為62.5%和72.5%,表現(xiàn)為感二化螟,與上述3種鑒定方法的結(jié)果相同。總體而言,4種鑒定方法均適宜用于水稻抗二化螟特性的評(píng)價(jià),鑒定結(jié)果無(wú)明顯差異。

        2.3對(duì)稻縱卷葉螟的抗性評(píng)價(jià)

        利用離體葉片鑒定方法對(duì)感蟲(chóng)對(duì)照TN1、抗蟲(chóng)對(duì)照華恢1號(hào)及常規(guī)稻明恢63等3份水稻材料進(jìn)行抗稻縱卷葉螟特性鑒定,結(jié)果與抗二化螟特性鑒定結(jié)果一致,以TN1作為參照,抗蟲(chóng)對(duì)照華恢1號(hào)的評(píng)價(jià)校正死亡率為100%,表現(xiàn)為高抗稻縱卷葉螟,而常規(guī)稻明恢63平均校正死亡率為3.85%,表現(xiàn)為感稻縱卷葉螟(表3)。因此,對(duì)轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)水稻的稻縱卷葉螟抗性鑒定可利用離體葉片鑒定方法進(jìn)行鑒定。

        2.4轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻材料抗蟲(chóng)性檢測(cè)

        利用離體葉片鑒定法和活體成株鑒定法對(duì)轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻材料進(jìn)行抗二化螟特性鑒定,除感蟲(chóng)對(duì)照品種TN1外,轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻材料和對(duì)照日本晴在接蟲(chóng)30 d后的枯心率均略高于接蟲(chóng)15 d的枯心率(表4),表明接蟲(chóng)15 d后二化螟的危害在繼續(xù)擴(kuò)展。因此,抗二化螟的特性分析以接蟲(chóng)30 d的枯心率結(jié)果為準(zhǔn),其中,明恢63在接蟲(chóng)15 d和30 d的枯心率的差異也有相同反應(yīng)(表2)。2種鑒定方法鑒定結(jié)果表明,13GV-12、13GV-18、13GV-30表現(xiàn)為高抗二化螟,抗二化螟能力均優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N日本晴,GV-2、GV-38、GV-48、GV-54、GV-63、GV-81表現(xiàn)為感或中感二化螟,與對(duì)照日本晴抗二化螟能力相仿,再次驗(yàn)證離體葉片鑒定方法與活體成株鑒定方法的研究結(jié)果相一致。

        表4 利用離體葉片鑒定法和活體成株鑒定法對(duì)轉(zhuǎn)Vip3A水稻材料抗二化螟特性評(píng)價(jià)結(jié)果

        3 小結(jié)與討論

        目前常用的抗蟲(chóng)性鑒定方法主要包括田間抗蟲(chóng)性鑒定和室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定。田間抗蟲(chóng)性鑒定是在自然條件下進(jìn)行,方法簡(jiǎn)便,真實(shí)感強(qiáng),但易受田塊中蟲(chóng)口密度不均勻、被檢測(cè)群體大?。爸貜?fù)數(shù))、氣候條件(如溫度、濕度等)甚至鳥(niǎo)獸危害等多方面因素影響,鑒定結(jié)果容易出現(xiàn)偏差。室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定環(huán)境可以控制或保護(hù),采取人工接蟲(chóng),方法易規(guī)范,結(jié)果可比性強(qiáng)、重復(fù)性好,但對(duì)于離體材料(葉、莖稈等)存在保鮮、供試蟲(chóng)齡、適宜的被檢測(cè)群體、后期剝檢查蟲(chóng)工作量大等問(wèn)題,相對(duì)于室外抗蟲(chóng)性鑒定,離體抗蟲(chóng)性鑒定的檢測(cè)成本較高,過(guò)程較煩瑣,這種方法適宜有條件的單位在需對(duì)水稻材料抗蟲(chóng)性準(zhǔn)確鑒定的情況下使用。研究結(jié)果表明,對(duì)水稻抗二化螟特性鑒定采取離體葉片法、離體莖稈法、離體剝開(kāi)莖稈法鑒定與活體成株法鑒定的結(jié)果完全吻合。離體葉片鑒定法具有快速、簡(jiǎn)便、不損傷稻株、后期容易剝檢查蟲(chóng)的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于離體莖稈鑒定剝開(kāi)與否,試驗(yàn)證明對(duì)二化螟的存活和生長(zhǎng)無(wú)明顯差異,但對(duì)鑒定后期剝檢查蟲(chóng)而言,離體剝開(kāi)莖稈鑒定法更容易造成二化螟鉆入莖稈內(nèi)鞘內(nèi)部,由于為害后期莖稈顏色與幼蟲(chóng)體色相近,容易漏檢蟲(chóng)數(shù),從而造成數(shù)據(jù)偏差,而離體莖稈中的幼蟲(chóng)主要存在于莖稈內(nèi)鞘??傮w而言,離體葉片鑒定法是目前最快速、有效的抗二化螟鑒定方法。另外,離體鑒定法中供試蟲(chóng)齡,以剛剛孵化6 h以?xún)?nèi)的蟻螟為宜。運(yùn)用離體葉片鑒定法測(cè)定水稻抗稻縱卷葉螟和抗二化螟的結(jié)果一致,對(duì)轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)水稻的稻縱卷葉螟抗性鑒定可以利用離體葉片鑒定法進(jìn)行鑒定。由于稻縱卷葉螟和二化螟同屬于鱗翅目害蟲(chóng),且對(duì)Bt蛋白更加敏感,初步判斷對(duì)于轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)水稻的稻縱卷葉螟抗性鑒定可以參照其二化螟抗性鑒定結(jié)果進(jìn)行評(píng)估,結(jié)論是否成立可以通過(guò)進(jìn)一步增加測(cè)試品種進(jìn)行驗(yàn)證。

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        Evaluation of Appraisement Method for Rice Resistance to Striped Stem Borer

        LIU Xianbo1,XIE Lihong1,TANG Shaoqing1,TU Jumin2,HU Peisong1,LUO Ju1*
        (1China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China;2Zhejiang University,Hangzhou 310000,China;*Corresponding author:luojurice@126.com)

        The identification result was consistent with the resistance evaluation to striped stem borer through four different bioassay methods,including detached-leaf bioassay,detached-stem bioassay,stripping detached-stem bioassay and whole plant bioassay.The detached-leaf bioassay is considered as the most rapid and effective method for evaluating resistance ability to striped stem borer.By both detached-leaf and whole plant bioassays,the author identified transgenic rice with Vip3A gene,and further validated the identification effectiveness of the detached-leaf bioassay method.Simultaneously,our preliminary results revealed that detached-leaf bioassay could also perform an accurate identification to rice leaf roller as lepidoptera pests of rice.

        rice;striped stem borer;resistance evaluation;technology appraisement

        S511;S435.112+1

        A

        1006-8082(2016)04-0035-04

        2016-02-25

        農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重大專(zhuān)項(xiàng)(2014ZX08001-001,2016ZX08001-001)

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