劉顯波　謝黎虹　唐紹清　凃巨民　胡培松　羅炬（中國水稻研究所，杭州30006；浙江大學(xué)，杭州30000；通訊作者：luojurice@6.com）

水稻抗二化螟特性鑒定技術(shù)的評價研究

劉顯波1謝黎虹1唐紹清1凃巨民2胡培松1羅炬1*
（1中國水稻研究所，杭州310006；2浙江大學(xué)，杭州310000；*通訊作者：luojurice@126.com）

采用離體葉片、離體莖稈、離體剝開莖稈及活體成株4種室內(nèi)抗蟲性鑒定方法，對相同水稻材料進行抗二化螟特性鑒定，同時對這些水稻室內(nèi)抗二化螟鑒定技術(shù)進行了綜合評價。結(jié)果表明，這些方法的抗性鑒定結(jié)果高度吻合，離體葉片鑒定方法是目前最快速、有效的抗二化螟鑒定方法。并通過離體葉片和活體成株鑒定方法對轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻材料進行鑒定，再次驗證了離體葉片鑒定方法的有效性。此外，初步發(fā)現(xiàn)對于同為鱗翅目水稻害蟲稻縱卷葉螟，用離體葉片鑒定方法也可進行有效鑒定。

水稻；二化螟；抗性鑒定；技術(shù)評價

水稻是我國主要的糧食作物，近20年水稻播種面積占全國糧食播種面積的比例一直穩(wěn)定在27%～28%，水稻總產(chǎn)占全國糧食總產(chǎn)的1/3以上（數(shù)據(jù)來源于中國國家統(tǒng)計局，http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj），超過一半以上的人口以稻米為主食，水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)對保障我國糧食安全至關(guān)重要。稻飛虱、二化螟和稻縱卷葉螟是我國水稻生產(chǎn)中最主要的害蟲，常年給水稻造成巨大的產(chǎn)量損失，2001-2004年間全國水稻病蟲害發(fā)生面積超過850萬hm2次，其中，2003年稻飛虱、稻縱卷葉螟、水稻螟蟲發(fā)生面積占病蟲害總發(fā)生面積的72.5%［1］。據(jù)全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心統(tǒng)計，自2003年大爆發(fā)以來稻縱卷葉螟年發(fā)生2 000萬hm2次以上，自2000年來螟蟲的危害維持在2 000萬hm2次左右。農(nóng)藥的大量使用造成了環(huán)境污染、生產(chǎn)成本增加。因此，培育抗蟲（稻飛虱、二化螟和稻縱卷葉螟等）水稻新品種并應(yīng)用于生產(chǎn)是解決上述問題最經(jīng)濟有效的途徑。而建立水稻材料抗蟲性的有效鑒定體系是進行抗蟲育種的根本基礎(chǔ)。

二化螟Chilosuppressalis（Walker）屬于鉆蛀性害蟲，在水稻分蘗期危害造成枯鞘、枯心苗，在穗期危害造成傷株和白穗，系水稻3個主要害蟲之一；然而對水稻抗二化螟特性的高效準確鑒定難度大，其原因主要有：幼蟲容易轉(zhuǎn)株為害、試驗中易發(fā)生逃逸；接蟲時二化螟的活性強弱、受鑒水稻材料的發(fā)育階段以及環(huán)境條件如溫度、濕度等諸多因素影響，試驗條件難以保證高度一致；鑒定操作流程多且復(fù)雜，易出現(xiàn)偏差。早在1985年國際水稻研究所提出了活體成株抗蟲鑒定方法和抗級標準［2］；2000年葉恭銀等提出利用離體葉片用于轉(zhuǎn)蘇云金桿菌毒蛋白基因水稻的二化螟鑒定，研究發(fā)現(xiàn)，鑒定結(jié)果與活體成株鑒定法所取得的結(jié)果相吻合［3］；2002年姚青等發(fā)明了離體稻株抗二化螟鑒定技術(shù)，該方法可靠而且準確［4］。2010年四川省制定“水稻抗二化螟鑒定技術(shù)規(guī)程”地方標準（DB51），包括田間鑒定和離體莖稈鑒定方法［5］，這些鑒定方法各有優(yōu)缺點。由于是不同的研究者利用不同的材料在不同的時期用不同的方法進行室內(nèi)抗蟲性鑒定，鑒定方法和鑒定結(jié)果的有效性需要進一步明確［6］。鑒于此，筆者利用同一批水稻材料，采用離體葉片、離體莖稈、離體剝開莖稈及活體成株等多種室內(nèi)抗蟲性鑒定方法進行抗蟲性鑒定比較，以期對這些水稻室內(nèi)抗二化螟鑒定技術(shù)進行綜合評價，為有效鑒定和評價水稻抗二化螟能力提供技術(shù)支撐。同時，選擇綜合評價最優(yōu)方法對同為鱗翅目水稻害蟲稻縱卷葉螟進行抗蟲性鑒定，以期找到一種方便快捷的稻縱卷葉螟抗蟲性鑒定方法。

1　材料與方法

1.1供試蟲準備

供試驗用二化螟卵塊購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所。將購買的卵塊置于培養(yǎng)皿中，保持一定的溫度（25℃～28℃）和濕度（RH 80%～90%），直至孵化，取剛剛孵化的幼蟲供正式試驗用。稻縱卷葉螟幼蟲及蟲卵在中國水稻研究所富陽實驗基地試驗田內(nèi)采集。

1.2供試水稻材料

供試水稻材料包括臺中在來1號（簡稱TN 1，感蟲對照）、轉(zhuǎn)cry1Ab/1Ac基因水稻華恢1號（抗蟲對照）及其非轉(zhuǎn)基因受體材料明恢63、轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻及其非轉(zhuǎn)基因受體材料日本晴。

1.3試驗地點及種植方式

試驗在中國水稻研究所富陽轉(zhuǎn)基因中試基地進行，供試水稻材料5月25日播種，單本分別移栽至大田和塑料桶中，大田每個材料種植4行8株，每個材料種植25個塑料桶。整個生育期間不施任何殺蟲劑。

1.4華恢1號陽性株鑒定

取華恢1號水稻葉片放置于1.5 mL離心管中研磨，并以蒸餾水抽提和稀釋，將Cry1Ab/1Ac膠體金免疫檢測試紙條（美國一龍公司）插入樣品液，5min后觀察結(jié)果。在試紙條上出現(xiàn)1條檢測線和1條質(zhì)控線為陽性（含毒蛋白），記為“+”；僅出現(xiàn)1條質(zhì)控線為陰性（無毒蛋白），記為“-”。

1.5抗螟性鑒定方法

1.5.1離體葉片法

參考農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測抗蟲水稻抗蟲性鑒定標準》（農(nóng)業(yè)部953公告-8.1-2007）中的方法，在水稻分蘗中期，分別從各供試材料的單本種植的稻株中，隨機從3個分蘗上剪取3～4 cm長的葉片（倒1葉）各1片。隨后在葉片兩端壓上用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過的小濾紙片，將葉片移置小平底玻管（9.5 cm×1.5 cm）內(nèi)徑，然后每管分別接入12頭蟻螟（二化螟或稻縱卷葉螟），管口塞緊脫脂棉花。第4天向管內(nèi)添加新鮮供試葉片2～3片，自開始接蟲后第7天檢查葉片，記錄幼蟲存活數(shù)，對每個玻璃管的活蟲體質(zhì)量進行稱量。每個株系鑒定10株，2次重復(fù)。

根據(jù)試蟲存活情況，計算各供試材料每個株系的試蟲死亡率，并參照感蟲對照的平均試蟲死亡率計算試蟲校正死亡率和平均校正死亡率，根據(jù)校正死亡率劃分抗、感等級，評價供試材料的抗二化螟或稻縱卷葉螟特性。校正死亡率=（供試材料試蟲死亡率-感蟲對照試蟲平均死亡率）/（1-感蟲對照試蟲平均死亡率）× 100。分級標準：

級別抗性幼蟲校正死亡率

0級HR（高抗）>80%

1級R（抗）60.1%～80%

3級MR（中抗）40.1%～60%

5級MS（中感）20.1%～40%

7級S（感）＜20%

9級HS（高感）全部死亡

1.5.2離體莖稈法

取分蘗盛期的主分蘗稻苗2根，把稻苗擦干，將2根稻苗截取成包含葉鞘的5 cm莖稈2根，隨后在莖稈兩端壓上用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過的小濾紙片。然后每根莖稈分別接入6頭二化螟蟻螟，將2根莖稈移置小平底玻管（9.5 cm×1.5 cm）內(nèi)徑，管口塞緊脫脂棉花。接蟲后第7天分別考查或測定幼蟲死亡率和活蟲體質(zhì)量。其間，于第3天在莖稈兩端增加用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過的小濾紙片確保莖稈濕潤。每個株系鑒定5株，2次重復(fù)。結(jié)果統(tǒng)計和評價標準同離體葉片法。

1.5.3離體剝開莖稈法

取分蘗盛期的主分蘗稻苗2根，把稻苗擦干，將2根稻苗截取成包含葉鞘的5 cm莖稈2根，將莖稈剝開，用細毛筆輕輕將12頭二化螟蟻螟接種在剝開的莖稈中（每個莖稈接蟲6頭），隨后在莖稈兩端壓上用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過的小濾紙片，將莖稈移置小平底玻管（9.5 cm×1.5 cm）內(nèi)徑，管口塞緊脫脂棉花。接蟲后第7天分別考查或測定幼蟲死亡率和活蟲體質(zhì)量。其間，于第3天在莖稈兩端增加用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過的小濾紙片確保莖稈保濕。每個株系鑒定5株，2次重復(fù)。結(jié)果統(tǒng)計和評價標準同離體葉片法。

1.5.4活體成株抗蟲性鑒定法

參照國際水稻研究所抗蟲鑒定方法，將種植在塑料桶中且?guī)?～3個分蘗的稻株搬至溫室，用細毛筆輕輕將二化螟蟻螟接種在夾于莖稈與葉鞘之間的葉舌處，每株接10頭，并加塑料網(wǎng)罩（直徑20 cm，高70 cm）。接蟲后2周移去網(wǎng)罩。接蟲后15 d、30 d考查各稻株中有無枯心，調(diào)查枯心率和枯心指數(shù)。每個株系鑒定10株，2次重復(fù)?？菪穆剩?）=單株枯心數(shù)/單株分蘗數(shù)。參照Heinrichs［2］溫室鑒定二化螟抗性按枯心指數(shù)進行分級評定?？剐詷藴剩?/p>

級別抗性枯心指數(shù)

0級HR（高抗）無害

1級R（抗）＜20%

3級MR（中抗）20.1%～40%

5級MS（中感）40.1%～60%

7級S（感）60.1%～80%

9級HS（高感）>80%

2　結(jié)果與分析

2.1華恢1號轉(zhuǎn)基因陽性檢測

在移栽至大田和塑料桶1周后，對抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號所有的單株進行轉(zhuǎn)基因陽性檢測，剔除陰性單株，防止陰性單株與陽性單株抗蟲性差異造成的試驗誤差。選取陽性單株進行抗蟲性鑒定，結(jié)果見圖1。

2.24種室內(nèi)抗蟲鑒定方法的吻合性比較

表1　利用離體葉片、離體莖稈和離體剝離莖稈法對水稻材料抗二化螟特性評價結(jié)果

表2　利用活體成株鑒定法對水稻材料進行二化螟抗性評價結(jié)果

表3　利用離體葉片鑒定法對水稻材料抗稻縱卷葉螟特性評價結(jié)果

圖1　華恢1號的Cry1Ab/1Ac蛋白檢測結(jié)果

分別利用離體葉片、離體莖稈、離體剝開莖稈鑒定技術(shù)對感蟲對照TN1、抗蟲對照華恢1號及常規(guī)稻明恢63等3份水稻材料進行抗二化螟特性鑒定，結(jié)果如表1。從表1可以看出，感蟲對照TN1各重復(fù)均表現(xiàn)為不抗二化螟，表現(xiàn)穩(wěn)定；以TN1作為參照，抗蟲對照華恢1號的校正死亡率為100%，表現(xiàn)為高抗二化螟；而常規(guī)稻明恢63 3種鑒定方法的平均校正死亡率在3.44%～13.56%之間，表現(xiàn)為感二化螟，方差分析表明，3種鑒定方法結(jié)果無顯著差異。利用活體成株鑒定方法對同樣3個品種進行二化螟抗性評估，結(jié)果見表2。從表2可見，TN1枯心率達100%，華恢1號未發(fā)現(xiàn)枯心，分別表現(xiàn)為高感和高抗二化螟，與離體葉片法、離體莖稈法、離體剝開莖稈法鑒定結(jié)果相吻合；常規(guī)稻明恢63接蟲后第15天和第30天的枯心率分別為62.5%和72.5%，表現(xiàn)為感二化螟，與上述3種鑒定方法的結(jié)果相同?？傮w而言，4種鑒定方法均適宜用于水稻抗二化螟特性的評價，鑒定結(jié)果無明顯差異。

2.3對稻縱卷葉螟的抗性評價

利用離體葉片鑒定方法對感蟲對照TN1、抗蟲對照華恢1號及常規(guī)稻明恢63等3份水稻材料進行抗稻縱卷葉螟特性鑒定，結(jié)果與抗二化螟特性鑒定結(jié)果一致，以TN1作為參照，抗蟲對照華恢1號的評價校正死亡率為100%，表現(xiàn)為高抗稻縱卷葉螟，而常規(guī)稻明恢63平均校正死亡率為3.85%，表現(xiàn)為感稻縱卷葉螟（表3）。因此，對轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻的稻縱卷葉螟抗性鑒定可利用離體葉片鑒定方法進行鑒定。

2.4轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻材料抗蟲性檢測

利用離體葉片鑒定法和活體成株鑒定法對轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻材料進行抗二化螟特性鑒定，除感蟲對照品種TN1外，轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻材料和對照日本晴在接蟲30 d后的枯心率均略高于接蟲15 d的枯心率（表4），表明接蟲15 d后二化螟的危害在繼續(xù)擴展。因此，抗二化螟的特性分析以接蟲30 d的枯心率結(jié)果為準，其中，明恢63在接蟲15 d和30 d的枯心率的差異也有相同反應(yīng)（表2）。2種鑒定方法鑒定結(jié)果表明，13GV-12、13GV-18、13GV-30表現(xiàn)為高抗二化螟，抗二化螟能力均優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N日本晴，GV-2、GV-38、GV-48、GV-54、GV-63、GV-81表現(xiàn)為感或中感二化螟，與對照日本晴抗二化螟能力相仿，再次驗證離體葉片鑒定方法與活體成株鑒定方法的研究結(jié)果相一致。

表4　利用離體葉片鑒定法和活體成株鑒定法對轉(zhuǎn)Vip3A水稻材料抗二化螟特性評價結(jié)果

3　小結(jié)與討論

目前常用的抗蟲性鑒定方法主要包括田間抗蟲性鑒定和室內(nèi)抗蟲性鑒定。田間抗蟲性鑒定是在自然條件下進行，方法簡便，真實感強，但易受田塊中蟲口密度不均勻、被檢測群體大?。爸貜?fù)數(shù)）、氣候條件（如溫度、濕度等）甚至鳥獸危害等多方面因素影響，鑒定結(jié)果容易出現(xiàn)偏差。室內(nèi)抗蟲性鑒定環(huán)境可以控制或保護，采取人工接蟲，方法易規(guī)范，結(jié)果可比性強、重復(fù)性好，但對于離體材料（葉、莖稈等）存在保鮮、供試蟲齡、適宜的被檢測群體、后期剝檢查蟲工作量大等問題，相對于室外抗蟲性鑒定，離體抗蟲性鑒定的檢測成本較高，過程較煩瑣，這種方法適宜有條件的單位在需對水稻材料抗蟲性準確鑒定的情況下使用。研究結(jié)果表明，對水稻抗二化螟特性鑒定采取離體葉片法、離體莖稈法、離體剝開莖稈法鑒定與活體成株法鑒定的結(jié)果完全吻合。離體葉片鑒定法具有快速、簡便、不損傷稻株、后期容易剝檢查蟲的優(yōu)點。對于離體莖稈鑒定剝開與否，試驗證明對二化螟的存活和生長無明顯差異，但對鑒定后期剝檢查蟲而言，離體剝開莖稈鑒定法更容易造成二化螟鉆入莖稈內(nèi)鞘內(nèi)部，由于為害后期莖稈顏色與幼蟲體色相近，容易漏檢蟲數(shù)，從而造成數(shù)據(jù)偏差，而離體莖稈中的幼蟲主要存在于莖稈內(nèi)鞘?？傮w而言，離體葉片鑒定法是目前最快速、有效的抗二化螟鑒定方法。另外，離體鑒定法中供試蟲齡，以剛剛孵化6 h以內(nèi)的蟻螟為宜。運用離體葉片鑒定法測定水稻抗稻縱卷葉螟和抗二化螟的結(jié)果一致，對轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻的稻縱卷葉螟抗性鑒定可以利用離體葉片鑒定法進行鑒定。由于稻縱卷葉螟和二化螟同屬于鱗翅目害蟲，且對Bt蛋白更加敏感，初步判斷對于轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻的稻縱卷葉螟抗性鑒定可以參照其二化螟抗性鑒定結(jié)果進行評估，結(jié)論是否成立可以通過進一步增加測試品種進行驗證。

［1］王艷青.近年來水稻病蟲害發(fā)生及趨勢分析 ［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22（2）：343-347.

［2］Heinrichs E A,Medrano F G,Rapusas H R.Genetic evaluation for insect resistance in rice［J］.Manila,Philippines:International Rice Research Institute,1985.

［3］葉恭銀，胡萃，舒慶堯，等.轉(zhuǎn)蘇云金桿菌毒蛋白基因水稻抗螟性的離體葉片測定法［J］.植物保護學(xué)報，2000，27（1）：1-6.

［4］姚青，賴鳳香，張志濤.水稻抗二化螟特性離體稻株鑒定技術(shù)［J］.中國水稻科學(xué)，2002，16（4）：385-386.

［5］四川省地方標準DB51/T1056-2010.水稻抗二化螟性鑒定技術(shù)規(guī)程［S］.

［6］張志濤.水稻品種抗蟲性鑒定技術(shù)概述［J］.國外農(nóng)學(xué)-水稻，1986 （6）：1-7.

Evaluation of Appraisement Method for Rice Resistance to Striped Stem Borer

LIU Xianbo1,XIE Lihong1,TANG Shaoqing1,TU Jumin2,HU Peisong1,LUO Ju1*
（1China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China；2Zhejiang University,Hangzhou 310000,China；*Corresponding author:luojurice@126.com）

The identification result was consistent with the resistance evaluation to striped stem borer through four different bioassay methods,including detached-leaf bioassay,detached-stem bioassay,stripping detached-stem bioassay and whole plant bioassay.The detached-leaf bioassay is considered as the most rapid and effective method for evaluating resistance ability to striped stem borer.By both detached-leaf and whole plant bioassays,the author identified transgenic rice with Vip3A gene,and further validated the identification effectiveness of the detached-leaf bioassay method.Simultaneously,our preliminary results revealed that detached-leaf bioassay could also perform an accurate identification to rice leaf roller as lepidoptera pests of rice.

rice；striped stem borer；resistance evaluation；technology appraisement

S511；S435.112+1

A

1006-8082（2016）04-0035-04

2016-02-25

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重大專項（2014ZX08001-001，2016ZX08001-001）