姚　亮，彭代銀，俞年軍，汪新宇，王飄飄，陳衛(wèi)東，何祥林

(1.安徽中醫(yī)藥大學　安徽省中醫(yī)藥科學院中藥資源保護與開發(fā)研究所，安徽 合肥　230012；2.安徽霍山長沖中藥材開發(fā)有限公司，安徽 霍山　237266)

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正交試驗優(yōu)化霍山米斛總多糖提取工藝

姚亮1，彭代銀1，俞年軍1，汪新宇1，王飄飄1，陳衛(wèi)東1，何祥林2

(1.安徽中醫(yī)藥大學安徽省中醫(yī)藥科學院中藥資源保護與開發(fā)研究所，安徽 合肥230012；2.安徽霍山長沖中藥材開發(fā)有限公司，安徽 霍山237266)

[摘要]目的建立霍山米斛總多糖的最佳提取工藝。方法依據2015年版《中華人民共和國藥典》第一部中鐵皮石斛多糖測定方法，通過單因素考察及正交試驗研究提取溫度、提取次數(shù)、提取時間、料液比對霍山米斛總多糖提取率的影響，采用苯酚-硫酸法測定其多糖含量。結果霍山米斛的最佳提取工藝為：提取溫度為100 ℃，提取2次，每次提取2 h，料液比為1∶800(g/mL)。結論所優(yōu)選的工藝簡單、方便、準確，適用于霍山米斛總多糖的提取。

[關鍵詞]霍山米斛；總多糖；正交試驗；工藝優(yōu)化

霍山米斛(DendrobiumhuoshanenseenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)俗稱米斛，為蘭科石斛屬多年生草本植物，作為安徽省珍稀、名貴、道地中草藥，產于大別山區(qū)安徽霍山等地?；羯矫柞哂幸婢珡婈?、生津止渴、補虛羸、除胃中虛火之功效?，F(xiàn)有的石斛種類繁多，不同石斛類的總多糖的組成存在差異，不能以相同方法評價不同石斛中總多糖含量。在霍山米斛主要成分中，大家普遍以總多糖含量的高低來評價霍山米斛的優(yōu)劣?，F(xiàn)有研究中，黃森等[1]采用Box-Behnken法優(yōu)化提取霍山米斛活性多糖，張煒玲等[2]和秦霞等[3]采用響應面法優(yōu)化霍山米斛多糖提取工藝，魏明等[4]采用超聲波協(xié)同纖維素酶法提取霍山米斛多糖。以上關于霍山米斛多糖的提取方法比較繁瑣，還要進行多糖的純化，工藝復雜，要求較高，不適合在霍山縣當?shù)氐霓r村推廣。所以，本研究參照《中華人民共和國藥典》中鐵皮石斛總多糖的提取方法[5]，系統(tǒng)地制定簡便、易行的方法來提取霍山米斛的總多糖，采用正交試驗方法優(yōu)化霍山米斛總多糖的提取工藝，為霍山米斛的質量控制提供依據。

1　材料

1.1儀器紫外分光光度計：UV-1600 上海美譜達儀器有限公司；LC-4016型低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；AB135-S型十萬分之一天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BCD-225CHC冰箱：安徽省合肥美菱股份有限公司；KQ-300B型超聲波清洗器：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；雙層鐵皮電爐：上海日用電爐廠；Milli-Q Gradient A10超純水系統(tǒng)：密理博(上海)貿易有限公司。

1.2試藥霍山米斛于2015年12月采自安徽省霍山縣太平畈鄉(xiāng)，經安徽中醫(yī)藥大學藥學院生藥系俞年軍教授鑒定為DendrobiumhuoshanenseenseC. Z. Tang et S. J. Cheng。無水葡萄糖(分析級)、苯酚(分析級)、硫酸(分析級)批號分別為20150807、20150603、20141221。其他試劑均為分析級，實驗用水均由Milli-Q超純水機制備。

2　方法與結果

2.1霍山米斛中總多糖含量的測定

2.1.1總多糖含量的測定精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL具塞試管中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，再精密加硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，以相應試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法[5]，在488 nm波長處測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖含量，計算，即得?？偠嗵翘崛÷?總多糖質量/原藥材干品質量×100%。

2.1.2對照品溶液的制備取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成90 μg/mL的溶液，即得。

2.1.3供試品溶液的制備取本品粉末(過3號篩)約0.12 g，精密稱定，加水80 mL，加熱回流2 h，放冷，轉移至100 mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL，置15 mL離心管中，精密加入無水乙醇10 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心20 min，棄去上清液(必要時濾過)，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉移至25 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.4檢測波長選擇分別對未顯色霍山米斛總多糖溶液、未顯色標準葡萄糖溶液、經苯酚-硫酸法顯色后的標準葡萄糖溶液、經苯酚-硫酸法顯色后的霍山米斛總多糖溶液，空白溶液在400～800 nm范圍內掃描，測定吸收光譜，見圖1。參照《中華人民共和國藥典》最終確定最佳吸收波長為488 nm。

圖1 未顯色霍山米斛總多糖溶液(A)、未顯色標準葡萄糖溶液(B)、顯色后的標準葡萄糖溶液(C)、顯色后的霍山米斛總多糖溶液(D)和空白溶液(E)的紫外掃描圖(波長400～800nm)

2.1.5標準曲線的制備精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL具塞試管中，各加水補至1.0 mL，精密加入5%苯酚溶液l mL(臨用配制)，搖勻，再精密加硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，以相應試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法[5]，在488 nm的波長處測定吸光度，以吸光度(A)對葡萄糖濃度(c)進行線性回歸，得線性回歸方程為：A=0.008 81c+ 0.112 52(R2=0.999 04)。結果表明，葡萄糖濃度在9.106～91.060 μg/mL范圍內與吸光度線性范圍良好。

2.1.6精密度試驗按標準曲線確定的范圍內，精密吸取葡萄糖對照品溶液6份，各1 mL，按照“2.1.1”項下操作測定吸光度，計算RSD為2.5%，小于4%，表明精密度良好，符合方法學的要求。

2.1.7穩(wěn)定性試驗在標準曲線確定的范圍內，精密吸取“2.1.3”項下制備的供試品1 mL，分別于0、10、20、30、40、50、60 min按照“2.1.1”項下操作測定吸光度，計算其RSD為0.88%，小于4%，表明穩(wěn)定性良好，符合方法學要求。

2.1.8重復性試驗精密稱取霍山米斛樣品6份，約0.12 g，按“2.1.3”項下制備供試品，按照“2.1.1”項下操作測定含量，計算RSD為0.80%，小于4%，表明重復性良好，符合方法學要求。

2.1.9回收率試驗取已知含量的霍山米斛粉末100 mg，精密稱定，共6份，按“2.1.3”項下制備的供試品，精密移取1 mL，再加入葡萄糖對照品溶液，含量為25 μg，濃縮定容到1 mL，按照“2.1.1”項下操作測定吸光度，計算加樣回收率的范圍為88.87%～98.01%，平均加樣回收率為93.32%，符合方法學要求。見表1。

表1　加樣回收率實驗結果(n=6)

2.2霍山米斛提取工藝考察

2.2.1提取溫度試驗每次取霍山米斛粉末(過三號篩)適量，精密稱定，使料液比為1∶667(g/mL)，加熱回流2 h，提取1次，分別考察在溫度70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃下總多糖提取率。見表2。結果顯示，在提取溫度70～100 ℃范圍內，多糖提取率隨著提取溫度的升高而升高，在100 ℃處有最大值，所以單因素考察最佳提取溫度為100 ℃。

表2　提取溫度對霍山米斛總多糖提取率的影響(n=6)

2.2.2提取時間試驗每次取霍山米斛粉末(過3號篩)適量，精密稱定，使料液比為1∶667(g/mL)，在100 ℃下加熱回流，提取1次條件下，分別考察在1、2、3、4 h提取時間下總多糖提取率。見表3。

表3　提取時間對霍山米斛總多糖提取率的影響(n=6)

結果顯示，提取時間在2 h之內，多糖提取率隨著提取時間的增加而顯著增加；提取時間在2 h之后，多糖提取率反而隨著提取時間的增加而減少;在提取時間為2 h時，多糖提取率達到最大值。所以單因素考察最佳提取時間為2 h。

2.2.3料液比試驗每次取霍山米斛粉末(過3號篩)適量，精密稱定，在100 ℃下加熱回流，提取1次條件下，分別考察料液比為1∶1 000(g/mL)、1∶800(g/mL)、1∶667(g/mL)、1∶571(g/mL)條件下總多糖提取率。見表4。

表4　料液比對霍山米斛總多糖提取率的影響(n=6)

結果顯示，當料液比為1∶1 000(g/mL)、1∶800(g/mL)、1∶667(g/mL)時，霍山米斛粉末浸潤比較充分，隨著霍山米斛粉末增加，多糖提取率逐漸下降，當料液比為1∶571(g/mL)時，總多糖提取率下降最快，可能是由于在2 h內，霍山米斛粉末中浸出的霍山米斛總多糖達到最大值?？紤]到總多糖的量便于測定，為減少誤差，最終選擇1∶800(g/mL)、1∶667(g/mL)、1∶571(g/mL)作為料液比的水平，進行正交試驗。

2.2.4提取次數(shù)試驗每次取霍山米斛粉末(過3號篩)適量，精密稱定，使料液比為1∶667(g/mL)，在100 ℃下加熱回流2 h，分別考察在提取1次、2次、3次、4次條件下總多糖提取率。見表5。

表5　提取次數(shù)對霍山米斛總多糖提取率的影響(n=6)

結果顯示，多糖提取率隨著提取次數(shù)的增加而增加，在提取次數(shù)大于2次時，多糖提取率增加比較緩慢，可能是霍山米斛中總多糖的量已經接近提取完全，考慮到能源的消耗和產率的關系，在正交表中，最終選擇提取1、2、3次作為水平進行正交試驗。

2.2.5正交試驗依據單因素實驗結果，以影響因素較大的料液比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、提取次數(shù)(D)為因素，選用L9(34)正交表進行正交實驗，進而得到霍山米斛總多糖加熱回流提取的最優(yōu)條件。見表6。

表6　正交試驗因素水平表

2.2.6正交試驗結果由直觀分析可得，影響霍山米斛總多糖提取率的因素從高至低依次是D、C、A、B，最佳工藝的組合為A1B3C2D3。以均方最小的B因素為誤差項進行方差分析，結果顯示D因素對霍山米斛多糖提取工藝具有顯著性影響，結合生產實際與成本考慮，選擇提取的最優(yōu)組合為A1B3C2D2，即料液比為1∶800(g/mL)，提取溫度為100 ℃，提取時間為2 h，提取次數(shù)為2次。見表7、表8。

表7　正交試驗結果

表8　正交試驗的方差分析結果

注：F0.05(2,2)=19。

2.2.7驗證試驗依照最優(yōu)條件提取霍山米斛總多糖，并重復平行3次加熱回流提取實驗，計算最優(yōu)條件下回流提取得到的霍山米斛總多糖的提取率。結果從100.31、100.21、100.06 mg的霍山米斛粉末測得的米斛總多糖提取率分別為35.88%、36.23%、35.91%，平均提取率為36.01%，表明最佳提取工藝合理、可靠、可行。

3　討論

多聚糖簡稱為多糖，常有100個以上甚至幾千個單糖基通過糖苷鍵連接而成。其性質隨單糖數(shù)目的增多，差別也越來越大。研究[6]表明，植物多糖具有多種藥理活性，具有增強免疫功能、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老、降低血糖、降低血脂等作用[6]。作為安徽道地藥材，霍山米斛多糖的藥理活性已被大量證實?；羯矫柞鳛榘不栈羯娇h的支柱產業(yè)，在評價其優(yōu)劣時多以石斛中總多糖的含量為指標進行考察?，F(xiàn)在多糖提取方法主要有堿提取法、酸提取法，超濾法、超臨界流體萃取技術、水提醇沉法等[7-13]，大量研究旨在提高霍山米斛的多糖提取率，其提取工藝越來越復雜，儀器越來越特殊，不適合推廣，所以本研究選擇經典的加熱回流法來提取霍山米斛的總多糖。

本研究發(fā)現(xiàn)，影響霍山米斛總多糖提取率的因素從大到小依次是提取次數(shù)、提取時間、料液比、提取溫度，綜合其他影響因素，得出最佳的提取工藝，即提取溫度為100 ℃，提取2次，每次提取2 h，料液比為1∶800(g/mL)。

霍山米斛經過加熱回流法提取，最后采用苯酚-硫酸法測定霍山米斛中總多糖含量。該方法具有簡單、易行的特點，適用于霍山米斛質量的評價。

參考文獻：

[1]黃森,查學強,羅建平,等.Box-Behnken法優(yōu)化提取霍山米斛活性多糖的研究[J].中藥材,2007,30(5):591-594.

[2]張煒玲,王新生,戴亞峰,等.響應面法優(yōu)化霍山米斛多糖提取工藝[J].安徽農業(yè)科學,2012,40(12):7061-7064.

[3]秦霞,董海麗,劉紅.響應面法優(yōu)化霍山米斛多糖超聲提取工藝[J]. 安徽農業(yè)科學,2012,40(12):7065-7066.

[4]魏明,邵平,姚紅,等.超聲波協(xié)同纖維素酶法提取霍山米斛多糖的研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(3):199-201.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:803-804.

[6]張錦雀,黃麗英,蘇聰枚.中草藥多糖提取分離純化研究進展[J].中藥材,2008,31(11):1760-1765.

[7]王宏云,李銘.石斛多糖提取加工新技術的應用現(xiàn)狀[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育,2014,12(13):160.

[8]袁清霞,趙龍巖,李子嬌,等.酸法提取仙人掌多糖工藝[J].食品研究與開發(fā),2012,33(3):42-46.

[9]齊善厚.樟芝多糖的超濾分離及其免疫活性研究[J].現(xiàn)代食品科技，2012,28(12):1672-1674.

[10]劉鴻鋮.人參有效成分超臨界萃取法提取與純化的研究[D].長春：吉林農業(yè)大學,2014：1-30.

[11]黃曉君,聶少平,王玉婷,等.鐵皮石斛多糖提取工藝優(yōu)化及其成分分析[J].食品科學,2013,34(22):21-26.

[12]王培培,魯芹飛,陳建南,等.正交試驗法優(yōu)化鐵皮石斛多糖的提取工藝[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(11):2781-2782.

[13]岑忠用,蘇江,梁冠興.熱水浸提法提取鐵皮石斛原球莖多糖的工藝[J].湖北農業(yè)科學,2011,50(18):3807-3810.

作者簡介：姚亮(1990-)，男，碩士研究生

通信作者：彭代銀，pengdy@ahtcm.edu.cn

[中圖分類號]R284.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.04.023

基金項目：安徽省科技廳2015年公益性技術應用研究聯(lián)動計劃項目(1501ld04006)；安徽高?？蒲袆?chuàng)新平臺團隊等項目(皖教秘科〔2015〕49號)；安徽道地中藥材品質提升協(xié)同創(chuàng)新中心項目(皖教科〔2013〕2號)

(收稿日期：2016-04-12；編輯：姚實林)

Optimization of Extraction Process for Total Polysaccharides fromDendrobiumhuoshanenseby Orthogonal Test

YAOLiang1,PENGDai-yin1,YUNian-jun1,WANGXin-yu1,WANGPiao-piao1,CHENWei-dong1,HEXiang-lin2

(1.AnhuiUniversityofChineseMedicine&InstituteofTraditionalChineseMedicineResourcesProtectionandDevelopment,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.HuoshanChangchongChineseMedicineDevelopmentCo.,Ltd.,AnhuiHuoshan237266,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the optimal extraction process for total polysaccharides from Dendrobium huoshanense. MethodsBased on the determination of polysaccharides in Dendrobium officinale in the 2015 edition of Pharmacopoeia of The People’s Republic of China, the single-factor study and orthogonal test were performed to investigate the influence of extraction temperature, times of extraction, extraction duration, and solid/liquid ratio on the extraction rate of total polysaccharides from Dendrobium huoshanense. The phenol-sulfuric acid method was used to measure the content of polysaccharides. ResultsThe optimal extraction process was an extraction temperature of 100 ℃, two times of extraction, a duration of 2 hours for each extraction, and a solid/liquid ratio of 1∶800 (g/mL). ConclusionThis process is simple, convenient, accurate, and applicable to the extraction of total polysaccharides from Dendrobium huoshanense.

[Key words]Dendrobium huoshanense; Total polysaccharides; Orthogonal test; Process optimization