莊金秋，梅建國(guó)，祖立闖，苗立中，沈志強(qiáng)，

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 2566000；3.濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司，山東濱州 256600)

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雞傳染性支氣管炎病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原的研制

莊金秋1，3，梅建國(guó)1，3，祖立闖2，苗立中1，沈志強(qiáng)1，2

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 2566000；3.濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司，山東濱州 256600)

摘要：為應(yīng)用血凝抑制(HI)試驗(yàn)檢驗(yàn)雞傳染性支氣管炎疫苗免疫效力(血清、卵黃抗體水平)，建立了雞傳染性支氣管炎病毒HI試驗(yàn)抗原的制備方法。該方法是通過(guò)選取抗原譜最廣的雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)M41株，經(jīng)SPF雞胚增殖培養(yǎng)36 h后無(wú)菌收取雞胚尿囊液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清用聚乙二醇(PEG)20000濃縮100倍；兔源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株(C57-1株)37 ℃增殖培養(yǎng)18 h，4℃、12 000 r/min離心10 min取上清，經(jīng)PEG 20000透析袋濃縮5倍后通過(guò)0.20 μm濾膜過(guò)濾除菌，然后將IBV液和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液(含α毒素)二者按一定比例混合后經(jīng)37 ℃恒溫振蕩感作2 h，4 ℃經(jīng)48 h后制成。經(jīng)大量試驗(yàn)表明，制備的IBV HI試驗(yàn)抗原效價(jià)高、穩(wěn)定性好，可替代進(jìn)口抗原應(yīng)用于雞群IBV疫苗免疫后血清抗體及卵黃抗體的HI效價(jià)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：傳染性支氣管炎病毒；血凝抑制試驗(yàn)；A型產(chǎn)氣莢膜梭菌

雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病[1-2]。感染雞主要表現(xiàn)為咳嗽、氣管啰音、打噴嚏等癥狀[3-4]。雛雞及育成雞感染后生長(zhǎng)發(fā)育受阻，并可導(dǎo)致較高死淘率；產(chǎn)蛋雞感染導(dǎo)致產(chǎn)蛋量減少和蛋品質(zhì)下降，患病雞常因呼吸道、腎臟或消化道感染而死亡，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的危害[5-6]。

IBV表面沒(méi)有血凝素(hemaggeutinin,HA)，對(duì)動(dòng)物紅細(xì)胞無(wú)自然血凝特性，但經(jīng)特殊處理后能夠獲得血凝活性，并且這種血凝活性能被特異性IBV血清抑制。根據(jù)這一特性，國(guó)內(nèi)學(xué)者建立了多種IBV血凝抑制(HI)試驗(yàn)抗原[即IBV血凝抗原(HA抗原)]的制備方法[7-13]，其處理IBV先后應(yīng)用胰酶、Ⅰ型磷脂酶C(PLC1)、神經(jīng)氨酸酶和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)液上清等[14-17]，其所建立的方法有的制備程序復(fù)雜、有的產(chǎn)品穩(wěn)定性差、有的獲得的病毒血凝活性低等，這些原因?qū)е履壳皣?guó)內(nèi)尚無(wú)商品化的IBV HI試驗(yàn)抗原，多數(shù)疫苗企業(yè)均購(gòu)買(mǎi)荷蘭GD公司進(jìn)口抗原，成本較高。根據(jù)IBV經(jīng)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的α-毒素(即卵磷脂酶)處理后能夠獲得較好的凝集雞紅細(xì)胞的特性[18-21]，我們研制了一種成本低、效價(jià)高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的IBV HI試驗(yàn)抗原，經(jīng)多次臨床樣品檢測(cè)，表明其與進(jìn)口抗原的檢測(cè)結(jié)果具有非常好的一致性，可完全替代昂貴進(jìn)口抗原用于雞群IBV疫苗免疫后血清抗體及卵黃抗體水平的監(jiān)測(cè)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾(中國(guó))公司產(chǎn)品；透析袋，美國(guó)Axygen公司產(chǎn)品；PEG20000，德國(guó)默克公司產(chǎn)品；一次性96孔V型血凝版，海門(mén)康泰公司產(chǎn)品；0.20 μm微孔濾膜，德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品。

1.1.2主要材料SPF雞蛋為濟(jì)南斯帕法斯公司生產(chǎn)；IBV-M41株毒種、兔源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-1株凍干菌種及禽病PCR檢測(cè)試劑盒均由山東綠都生物科技有限公司提供；厭氣肉肝胃酶消化湯根據(jù)中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程(2000年版)附錄制備；對(duì)照抗原為荷蘭GD公司產(chǎn)品；新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、產(chǎn)蛋下降綜合征、禽流感H9陽(yáng)性血清均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，陰性血清采自濟(jì)南斯帕法斯公司的SPF雞，28份待檢血清為自制傳染性支氣管炎血清、新支流三聯(lián)滅活疫苗免疫SPF雞效力檢驗(yàn)血清及SPF雞蛋卵黃抗體；8.5 g/L生理鹽水、380 g/L檸檬酸鈉抗凝劑、HA緩沖液、0.01 mol/L pH 7.4 PBS和10 mL/L雞紅細(xì)胞均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院生物制品研究室自制。

1.1.3緩沖液的配制HA緩沖液：將5.96 g HEPES、8.19 g NaCl、0.15 g CaCl2依次溶于1 000 mL超純水中，用0.1 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)至6.5，0.20 μm微孔濾器過(guò)濾分裝后，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1IBV HI試驗(yàn)抗原制備

1.2.1.1病毒增殖將IBV M41株種毒用無(wú)菌生理鹽水稀釋100倍，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1 mL，置37 ℃雞胚孵化器孵化，30 h前照蛋1次，棄去死胚，收取30 h～36 h的活胚，氣室向上直立，置2 ℃～8 ℃中冷卻4 h～24 h。將冷卻的雞胚取出，無(wú)菌收集尿囊液置滅菌瓶中備用。取病毒液少量進(jìn)行HA試驗(yàn)及PCR檢測(cè)，確定收獲的病毒是否有血凝性及新城疫病毒、流感病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒等常見(jiàn)外源病毒污染。若結(jié)果陽(yáng)性則廢棄重新增毒。

1.2.1.2病毒濃縮剪取適當(dāng)長(zhǎng)度的透析袋煮沸處理10 min，將收集的新鮮尿囊液于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，無(wú)菌條件下將離心后的病毒液上清加入透析袋中并將透析袋置于1 000 mL燒杯中，加入聚乙二醇20000適量包埋透析袋，將燒杯置2 ℃～8 ℃經(jīng)12 h～24 h，期間更換2次～3次新的聚乙二醇20000，至病毒液被濃縮100倍左右。無(wú)菌收集病毒濃縮液置滅菌瓶中，現(xiàn)用或置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?.2.1.3A型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)與菌液處理將兔源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-1株凍干菌種按3%的接種量接種于厭氣肉肝胃酶消化湯中，置37℃溫箱中靜置培養(yǎng)18 h，4℃、12 000 r/min離心10 min后取上清，經(jīng)聚乙二醇20000濃縮5倍后用0.20 μm濾膜過(guò)濾除菌，分裝，現(xiàn)用或置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4IBV HI試驗(yàn)抗原制備取適量保存的病毒濃縮液和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌5倍濃縮菌液，將二者分別按1∶0.2、1∶0.3、1∶0.5、1∶0.8、1∶1、1∶1.5、1∶2的比例混合后，37 ℃恒溫振蕩感作2 h，4 ℃ 48 h后測(cè)定血凝價(jià)，選取血凝價(jià)最高且大于1∶28的配比比例進(jìn)行大量制備IBV HI試驗(yàn)抗原。

1.2.2血凝抑制試驗(yàn)

1.2.2.1HI試驗(yàn)抗原血凝價(jià)測(cè)定取96孔V型微量板1塊，每孔加入25 μL HA緩沖液，第1排加制備的IBV HI抗原25 μL，并做2個(gè)～4個(gè)重復(fù)孔，然后將抗原進(jìn)行2倍系列稀釋，稀釋后每孔再加入25 μL HA緩沖液，最后再加入10 mL/L雞紅細(xì)胞懸液25 μL，用微量振蕩器混勻，2 ℃～8 ℃下靜置40 min，判定結(jié)果。以使100%紅細(xì)胞凝集的抗原最高稀釋倍數(shù)作為判定終點(diǎn)。

1.2.2.24單位HA抗原的配制根據(jù)測(cè)定的HI抗原 HA效價(jià)，用HA緩沖液配制4單位HA抗原。

1.2.2.3HI試驗(yàn)操作步驟取96孔V型微量反應(yīng)板，每孔加入25 μL HA緩沖液。分別吸取25 μL待檢血清，加至每塊板的第1排各相應(yīng)孔內(nèi)，并在每塊板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)照，然后進(jìn)行2倍系列稀釋。分別向各孔中加入含4 HA單位的抗原25 μL(除紅細(xì)胞對(duì)照孔外)，2 ℃～8 ℃下靜置30 min。每孔中加入10 mL/L雞紅細(xì)胞懸液25 μL，輕輕混勻，2 ℃～8℃下靜置40 min。

1.2.2.4荷蘭GD公司抗原血凝抑制試驗(yàn)方法操作步驟同上，唯一不同之處在于其過(guò)程中所用緩沖液為0.01 mol/L pH7.4 PBS而非HA緩沖液。

1.2.2.5結(jié)果判定將反應(yīng)板傾斜45°，以完全抑制4HA單位抗原的血清最高稀釋度作為HI抗體效價(jià)。當(dāng)4 HA單位抗原完全凝集，雞紅細(xì)胞陰性對(duì)照完全不凝集，陽(yáng)性對(duì)照血清IBV HI抗體效價(jià)與原效價(jià)相比誤差不高于1個(gè)滴度，各陰性對(duì)照血清及卵黃抗體IBV HI抗體效價(jià)不高于4 log2時(shí)，試驗(yàn)方可成立。

2　結(jié)果

2.1IBV HA試驗(yàn)及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

HA試驗(yàn)結(jié)果表明，收集的IBV M41株SPF雞胚尿囊液無(wú)自然血凝特性，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)收獲的IBV雞胚尿囊液擴(kuò)增出了440 bp的目標(biāo)片段(圖1)。另外，該尿囊液經(jīng)由山東綠都生物科技有限公司提供的禽病PCR試劑盒檢測(cè)未擴(kuò)增出具有血凝性的新城疫病毒、流感病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒及無(wú)血凝性的傳染性法氏囊病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒及禽呼腸病毒等外源病毒。

2.2IBV HI試驗(yàn)抗原制備

將IBV 100倍病毒濃縮液和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌5倍濃縮菌液按照不同比例混合處理后HA試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)當(dāng)濃縮后的IBV液和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液按照1∶1比例(V/V)混合后，所測(cè)得的血凝價(jià)高達(dá)1∶29，接近荷蘭GD公司IB M41抗原血凝價(jià)(1∶210)，其他比例獲得的血凝價(jià)都不高于1∶26，因此大量制備IBV HI試驗(yàn)抗原可選用二者1∶1的比例配制，即A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液含量為50%。

2.3IBV M41株HI試驗(yàn)抗原應(yīng)用結(jié)果

應(yīng)用制備的IBV M41株HI試驗(yàn)抗原進(jìn)行HI試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。試驗(yàn)中采用新鮮雞紅細(xì)胞，自制抗原血凝價(jià)為1∶29。由表中可見(jiàn)，自制抗原與GD公司抗原比較二者差異不顯著，17份IBV陰性血清抗體都在4 log2以下，這與章振華等[11]報(bào)道一致，其為血清中的非特異性凝集素所致。待測(cè)IBV陽(yáng)性血清HI抗體效價(jià)均大于5 log2。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000； 1.IBV M41株毒種； 2.IBV M41株雞胚尿囊液； 3.陰性對(duì)照雞胚尿囊液

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Positive control of M41 IBV strain; 2.Egg embryo allantoic fluid of IBV M41 strain; 3.Negative control of allantoic fluid

圖1IBV M41株尿囊液RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1RT-PCR amplification results of IBV M41 strain

in egg embryo allantoic fluid

3　討論

聚乙二醇20000分子質(zhì)量大，用于濃縮病毒比用分子質(zhì)量小聚乙二醇(如聚乙二醇6000)所用的時(shí)間短，能較好的保護(hù)病毒纖突，使病毒獲得較高的血凝活性。雖然超高速離心、等密度梯度離心、蔗糖梯度離心等多種方法的超速離心病毒能除去病毒液中的雜蛋白，得到較純凈的病毒，但高速離心過(guò)程中損失的病毒纖突較多，而使用聚乙二醇20000濃縮較少損失病毒纖突，可獲得較高血凝活性的病毒[22-23]。濃縮后的抗原有人用甲醛滅活[24-26]，有人用56℃水浴滅活，有人用β-丙內(nèi)酯滅活，但我們研究發(fā)現(xiàn)，病毒滅活后血凝價(jià)會(huì)降低2個(gè)梯度，因此，我們不建議對(duì)病毒進(jìn)行滅活處理。

A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液經(jīng)PEG濃縮處理保持了較高濃度的卵磷脂酶，利于病毒獲得較高的血凝價(jià)。但我們發(fā)現(xiàn)菌液濃縮倍數(shù)不宜過(guò)高，過(guò)高后與100倍濃縮的病毒液混合后黏度太大，進(jìn)行HI試驗(yàn)容易導(dǎo)致非特異性凝集，出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而5倍濃縮比例適中，也便于計(jì)算菌液含量。

本研究自制的IBV抗原置2 ℃～8 ℃可保存6個(gè)月。如添加明膠、蔗糖保護(hù)劑凍干后在-20 ℃可保存3年～5年?？乖苽溥^(guò)程中病毒和菌液的濃縮比例非常關(guān)鍵。有人認(rèn)為菌液無(wú)需濃縮處理，含量在15%～20%即可獲得具有較好血凝價(jià)的IBV，但是在濃縮后的抗原中直接加入未濃縮菌液并未獲得較好效果。在抗原制備過(guò)程中發(fā)現(xiàn)病毒和菌液混合后，菌液含量如低于20%或高于60%，獲得的抗原血凝價(jià)會(huì)降低2個(gè)梯度。因此我們建議將IBV 100倍濃縮液和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌5倍濃縮菌液二者按1∶1比例混合制備HI試驗(yàn)抗原。利用這種方法制備的抗原血凝價(jià)為1∶29，雖然比從荷蘭進(jìn)口的IBV HI抗原血凝價(jià)低(1∶210)一個(gè)梯度，但是應(yīng)用本研究制備的HI抗原進(jìn)行時(shí)試驗(yàn)時(shí)讀數(shù)清晰，結(jié)果易判，不會(huì)出現(xiàn)使用GD公司抗原時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)的半凝集現(xiàn)象?？乖洳貤l件下，效價(jià)能夠保持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定，這樣避免了每次試驗(yàn)時(shí)臨時(shí)制備抗原、且使用前需要反復(fù)檢測(cè)驗(yàn)證的難題，減少了HI試驗(yàn)的工作量。

表1　HA試驗(yàn)結(jié)果

表2　HI試驗(yàn)結(jié)果

本研究的創(chuàng)新之處在于：①抗原無(wú)需經(jīng)過(guò)超速離心，而是使用安全環(huán)保的PEG濃縮，操作簡(jiǎn)單又較好的保持了病毒的血凝活性;②應(yīng)用A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液而非購(gòu)買(mǎi)高價(jià)磷酸酯酶C，降低了成本;③抗原液未經(jīng)過(guò)滅活劑滅活，保持了較高的血凝價(jià);④無(wú)需冷凍，活病毒蛋白在冷藏條件下即可保持較好的穩(wěn)定性;⑤整個(gè)制備過(guò)程無(wú)需特殊儀器和復(fù)雜工藝，一般實(shí)驗(yàn)室均能實(shí)現(xiàn)。因此，本研究提供了一種成本低、效價(jià)高、制作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好的IBV HI試驗(yàn)抗原的制備方法，其檢測(cè)結(jié)果與應(yīng)用進(jìn)口抗原的檢測(cè)結(jié)果一致，可替代進(jìn)口抗原應(yīng)用于雞群IBV疫苗免疫后血清抗體及卵黃抗體的HI效價(jià)檢測(cè)。

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收稿日期：2016-01-14

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015GSF121027)；濱州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015ZC0109)

作者簡(jiǎn)介：莊金秋(1978-)，女，山東濰坊人，副研究員，獸醫(yī)碩士，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物用病毒疫苗研制。

中圖分類號(hào):S852.659.6；S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)07-0034-05

Development of HI Test Antigen of Avian Infectious Bronchitis Virus

ZHUANG Jin-qiu1,3,MEI Jian-guo1,3,ZU Li-chuang2,MIAO Li-zhong1,SHEN Zhi-qiang1,2

(1.ShandongBinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong，256600,China;2.ShandongLvduBio-industryCompany,LTD.,Binzhou,Shandong，256600,China;3.BinzhouBio-carrierBiotechnologyCo.,Ltd.,Binzhou,Shandong，256600,China)

Abstract:In order to determine the serum antibody level of avian infectious bronchitis virus (IBV) in the inactivated vaccine,the preparation method of HI test antigen of IBV was established.The widest spectrum of IBV M41 strain was selected and proliferated in allantoic fluid of SPF chick embryos for 36 h,and then centrifuged in 4℃ and 12 000 r/min for 10 minutes,and last concentrated 100 fold by the polyethylene glycol (PEG) 20000 dialysis bag.Rabbit Clostridium perfringens type A standard Chinese strain (C57-1 strain) was first cultured for 18 h,then centrifuged supernatant in 4℃ and 12 000 r/min for 10 minutes,and then concentrated 5 fold by the PEG20000 dialysis bag,and last filtered by 0.20 μm membrane.The IBV HI antigen was made by mixing the IBV virus fluid and type A Clostridium perfringens liquid (containing alpha toxin) according to a certain proportion,then by the constant temperature of 37℃ for 2 h,and then in 4℃ for 48 h.It was showed that the prepared IBV HI test antigen had high titer and good stability,and could successfully replace imported antigen by using for the HI detection of serum antibody and egg yolk antibody in the sera of chickens immunized with IBV vaccine by a large number of experimental results.

Key words:Infectious bronchitis virus; HI test; Clostridium perfringens type A