王光華，王戈平，李秀萍，蔡其剛，馬利青*，周金林

(1.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧 810016；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

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青海省海北地區(qū)牦牛源賈第蟲(chóng)檢測(cè)與基因型分析

王光華1，王戈平1，李秀萍1，蔡其剛1，馬利青1*，周金林2

(1.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧 810016；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

摘要：為研究青海省海北地區(qū)牦牛賈第蟲(chóng)的感染情況及蟲(chóng)種基因型，對(duì)青海省祁連縣、海晏縣和剛察縣的297份牦牛糞樣采用蔗糖密度梯度離心法純化，之后用免疫熒光方法對(duì)賈第蟲(chóng)進(jìn)行鑒定，對(duì)陽(yáng)性及疑似陽(yáng)性樣品采用基于18 S rRNA和谷氨酸脫氫酶(gdh)基因的套式PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的賈第蟲(chóng)序列進(jìn)行比對(duì)分析。免疫熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果顯示，共檢出24份賈第蟲(chóng)陽(yáng)性糞樣，總陰性率為8.1%。套式PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,24份陽(yáng)性樣品中18 S rRNA基因擴(kuò)增陽(yáng)性22份，gdh基因擴(kuò)增陽(yáng)性18份，產(chǎn)物大小分別為292 bp和432 bp。序列分析表明，分離的蟲(chóng)種均為牦牛源腸賈第蟲(chóng)，基因型為集聚體E，未發(fā)現(xiàn)人畜共患基因型。

關(guān)鍵詞：牦牛；賈第蟲(chóng)；基因型；免疫熒光試驗(yàn)；套式PCR

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)(Giardialamblia)是一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)，也是人體腸道感染的常見(jiàn)寄生蟲(chóng)之一，常引起人和動(dòng)物的腹痛、腹瀉和消化不良[1]。賈第蟲(chóng)有廣泛的宿主，包括人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物，一旦感染很難消除。任何年齡的人和動(dòng)物均有易感性，羔羊和犢牛尤其易感，感染孢囊后多為無(wú)癥狀帶蟲(chóng)者，有臨床癥狀者主要表現(xiàn)為急性或慢性腹瀉，后者常伴有營(yíng)養(yǎng)吸收不良綜合征。目前，賈第蟲(chóng)病已被列為世界范圍內(nèi)危害人類(lèi)健康的10種主要寄生蟲(chóng)病之一[2]。

賈第蟲(chóng)的基因型根據(jù)分子遺傳學(xué)和表型不同可分為8個(gè)主要的聚集體(A～H),每個(gè)聚集體都有不同的宿主范圍，A和B集聚體主要感染人和多種哺乳動(dòng)物[1]。對(duì)賈第蟲(chóng)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要是采集動(dòng)物糞樣濃縮技術(shù)(硫酸鋅浮集法、甲醛-乙醚沉積法和離心法)處理包囊，之后用ELISA、顯微鏡觀察和免疫熒光技術(shù)進(jìn)行抗原檢測(cè)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR和熒光定量PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于賈第蟲(chóng)的分子流行病學(xué)調(diào)查。目前，賈第蟲(chóng)的檢測(cè)和基因分型技術(shù)主要通過(guò)分析小亞基核糖體RNA(small subunit ribosomal RNA,ssu-rRNA)、β賈第素(β-giardin,bg)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,gdh)、延伸因子-1α(elongation factors-1α,ef-1α)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase,tpi)及滋養(yǎng)體表面抗原基因?qū)崿F(xiàn)[3]。

本研究從青海省海北藏族自治州祁連縣、海晏縣和剛察縣的不同牧戶(hù)采集了297份牦牛糞樣，采用蔗糖密度梯度離心法純化之后用免疫熒光試驗(yàn)(immunofluorescence test,IFT)進(jìn)行鑒定，對(duì)陽(yáng)性及疑似陽(yáng)性樣品進(jìn)行基于賈第蟲(chóng)18 S rRNA和谷氨酸脫氫酶(gdh)的套式PCR擴(kuò)增，為該地區(qū)牦牛賈第蟲(chóng)病的防控和研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1糞樣2014年9月～11月，分別以青海省祁連縣、海晏縣和剛察縣的7戶(hù)規(guī)模在50頭以上的養(yǎng)殖戶(hù)為調(diào)查對(duì)象，采集不同牧戶(hù)4月齡～7月齡犢牦牛的新鮮糞樣，加入25 g/L的重鉻酸鉀溶液后存放于4 ℃冰箱，共采集297份糞便樣品。

1.1.2主要試劑與儀器糞樣DNA提取試劑盒、GoTaqDNA聚合酶預(yù)混液等，Promega公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、瓊脂糖等，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；賈第蟲(chóng)熒光抗體試劑盒，Cellabs公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母提取物，Oxoid公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑如氯化鈉、氫氧化鈉和碘液等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1免疫熒光抗體檢測(cè)參照文獻(xiàn)[4]方法，每份樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心法純化后采用免疫熒光抗體檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)。在400倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)賈第蟲(chóng)包囊的樣品判為陽(yáng)性，未發(fā)現(xiàn)的判為陰性。

1.2.2糞樣DNA的提取對(duì)間接免疫熒光試驗(yàn)(IFT)檢測(cè)陽(yáng)性的樣品提取DNA。分別取400 μL純化的樣品分裝于1.5 mL離心管，按糞便DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣品DNA提取，所得DNA溶于80 μL滅菌水中，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.318 S rRNA基因的套式PCR擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[5]的引物和方法對(duì)IFT檢測(cè)陽(yáng)性樣品進(jìn)行18 S rRNA基因擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1，目的基因片段長(zhǎng)度約為292 bp。第1輪PCR反應(yīng)體系為12.5 μL GoTaqDNA聚合酶預(yù)混液，上、下游引物Gia2029和Gia2150c各1 μL(10 μmol/L),模板DNA 3 μL，加滅菌水至25 μL；第2輪PCR體系中模板為第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物1 μL，上、下游引物RH11和RH4各1 μL(10 μmol/L)，其余試劑與首輪體系一致。第1輪反應(yīng)條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。第2輪反應(yīng)條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物電泳后回收并純化，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1　所用套式PCR引物

1.2.4基于gdh基因的套式PCR擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[6]引物和方法對(duì)IFT檢測(cè)陽(yáng)性樣品進(jìn)行g(shù)dh基因擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1，目的基因片段長(zhǎng)度約為432 bp。第1輪PCR反應(yīng)體系為12.5 μL GoTaqDNA聚合酶預(yù)混液，上、下游引物GDHeF和GDHiR各1 μL(10 μmol/L),模板DNA3 μL，加滅菌水至25 μL；第2輪PCR體系中模板為第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物1 μL，上、下游引物GDHiF和GDHiR各1 μL(10 μmol/L)，其余試劑與首輪反應(yīng)體系一致。第1輪反應(yīng)條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。第2輪反應(yīng)條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；之后72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物電泳后回收并純化，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5基于gdh基因的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析參照文獻(xiàn)[6]的方法，將PCR擴(kuò)增的gdh基因片段采用限制性?xún)?nèi)切酶NlaⅣ進(jìn)行RFLP分析，具體步驟為：10×M buffer 2 μL,限制性?xún)?nèi)切酶NlaⅣ 0.5 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)0.2 μL，加滅菌水至20 μL。37 ℃反應(yīng)3 h,之后采用30 g/L瓊脂糖凝膠電泳，核酸染色劑染色后分析電泳圖譜。

2　結(jié)果

2.1糞樣免疫熒光抗體檢測(cè)

經(jīng)賈第蟲(chóng)免疫熒光抗體試劑盒檢測(cè)，在采集的297份糞樣中共檢出24份賈第蟲(chóng)陽(yáng)性樣品，總感染率為8.1%。賈第蟲(chóng)在免疫熒光顯微鏡下的形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1　免疫熒光抗體法檢測(cè)牦牛賈第蟲(chóng)包囊(400×)

2.218 S rRNA基因和gdh基因擴(kuò)增結(jié)果

24份IFT陽(yáng)性樣品采用套式PCR方法擴(kuò)增，18 S rRNA基因擴(kuò)增陽(yáng)性22份，gdh基因擴(kuò)增陽(yáng)性18份，產(chǎn)物大小分別為292 bp和432 bp，符合預(yù)期大小(圖2和圖3)。

2.3基因測(cè)序及序列分析

將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，經(jīng)NCBI Blast序列比對(duì)，結(jié)果均為賈第蟲(chóng)18 S rRNA基因或gdh基因。

2.4RFLP分析結(jié)果

將PCR擴(kuò)增的gdh基因片段采用限制性?xún)?nèi)切酶NlaⅣ進(jìn)行RFLP分析，發(fā)現(xiàn)gdh基因片段可以被限制性?xún)?nèi)切酶(NlaⅣ)酶切為3個(gè)主要的片段為220、100、70bp(圖4)。這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)[6]中賈第蟲(chóng)集聚體E型的片段大小一致。

3　討論

本研究采用免疫熒光抗體試驗(yàn)對(duì)青海省海北州

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽(yáng)性對(duì)照;2.陰性對(duì)照；3～17.糞樣PCR結(jié)果

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽(yáng)性對(duì)照；2～9.糞樣PCR結(jié)果；10.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 00;1.Positive control.2-9.PCR products of the fecal samples;10.Negative control

圖3賈第蟲(chóng)gdh基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.3PCR amplification results ofGiardiagdh gene

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)；1～2.糞樣gdh 基因PCR-RFLP分析結(jié)果；3.陽(yáng)性對(duì)照樣品gdh 基因PCR-RFLP分析結(jié)果；4.陰性對(duì)照

M.DNA Marker；1-2.PCR-RFLP analysis of positive samples；3.PCR-RFLP analysis of positive control；4.Negative control

圖4基于賈第蟲(chóng)gdh基因的PCR-RFLP分析圖

Fig.4PCR-RFLP analysis ofGiardiagdh gene

部分地區(qū)的牦牛糞樣進(jìn)行了賈第蟲(chóng)的鑒定，從297份糞樣中共檢出24份賈第蟲(chóng)陽(yáng)性樣品，總感染率為8.1%。表明該地區(qū)牦牛中存在一定程度的賈第蟲(chóng)感染。不同地區(qū)，不同動(dòng)物中賈第蟲(chóng)的感染率不同，馮超等[7]對(duì)河南省2 137份奶牛糞樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)189份奶牛糞樣為賈第蟲(chóng)陽(yáng)性，總感染率為8.84%。顧有方等[8]對(duì)安徽省部分地區(qū)山羊糞樣進(jìn)行賈第蟲(chóng)鑒定，共檢出32份賈第蟲(chóng)陽(yáng)性樣品，總陽(yáng)性率為6.3%。王光華等[9]對(duì)青海省海晏縣10份牧羊犬糞便樣品進(jìn)行賈第蟲(chóng)檢測(cè)，結(jié)果有1份為賈第蟲(chóng)包囊陽(yáng)性，陽(yáng)性率為10%。

IFT方法操作簡(jiǎn)單，特異性好，但僅憑形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)鑒定難以確定基因型和亞型，通過(guò)分子生物學(xué)方法進(jìn)行基因分型可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)分類(lèi)的不足?；谫Z第蟲(chóng)18 S rRNA基因的套式PCR擴(kuò)增是目前最常用的方法之一，該方法具有簡(jiǎn)便、快速、特異性和敏感性強(qiáng)等特點(diǎn)。在本試驗(yàn)中用18 S rRNA基因套式PCR方法共檢測(cè)出22份賈第蟲(chóng)陽(yáng)性樣品，出現(xiàn)部分樣品IFT檢測(cè)陽(yáng)性而PCR檢測(cè)陰性現(xiàn)象，可能是由于賈第蟲(chóng)包囊在樣品中分布不均勻或樣品中存在PCR擴(kuò)增酶抑制物。

在賈第蟲(chóng)聚集體分型方面主要采用基于18 S rRNA和gdh基因PCR-RFLP分析方法，但由于18 S rRNA比gdh基因更加保守，因此采用18 S rRNA PCR-RFLP方法無(wú)法區(qū)分集聚體A和B中存在的亞型；此外，PCR-RFLP分析中采用的gdh基因片段比18 S rRNA基因片段長(zhǎng)，因此分析獲得的信息更加可靠[6]。本試驗(yàn)中對(duì)陽(yáng)性樣品采用基于賈第蟲(chóng)gdh基因的PCR-RFLP分析方法，結(jié)果表明陽(yáng)性樣品均為牦牛源腸賈第蟲(chóng)，基因型為集聚體E，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)人畜共患的集聚體。

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收稿日期：2016-01-19

基金項(xiàng)目：青海省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013-Z-934Q)；外專(zhuān)千人計(jì)劃(WQ20136300172)

作者簡(jiǎn)介：王光華(1978-)，男，青海大通人，副研究員，博士，主要從事病原微生物學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類(lèi)號(hào):S852.722

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)07-0030-04

Detection and Genotyping ofGiardiaIsolates from Yaks in Haibei Area of Qinghai Province

WANG Guang-hua1,WANG Ge-ping1,LI Xiu-ping1,CAI Qi-gang1,MA Li-qing1,ZHOU Jin-lin2

(1.QinghaiAcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,Xining,Qinghai,810016，China; 2.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgricultureSciences,Shanghai,200241，China)

Abstract:Two hundred ninety-seven fresh fecal samples were collected from yaks in Qilian,Haiyan,Gangcha counties of Qinghai province,and detected by immunofluorescence test (IFT) after discontinuous sucrose gradient purification.The IFT-positive samples were amplified by nested PCR targeting the 18 S rRNA and glutamate dehydrogenase (gdh) genes,and the positive PCR products were sequenced.The sequencing results and published Giardia sequence in GenBank were compared and analyzed.The results showed,24 fecal samples were positive by IFT,the total infection rate was 8.1%.22 out of 24 were 18 S rRNA gene (292 bp) positive,18 out of 24 were gdh gene (432 bp) positive,respectively.The sequence analysis indicated that these isolated species are Giardia duodenalis,assemblage E.The zoonotic genotype was not found in the present study.

Key words:yak; Giardia; genotype; immunofluorescence; nested-PCR